环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因在荧光假单胞菌中的表达

将已克隆到的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans)C-2的几丁酶基因chi1片段克隆到质粒载体pUXBF5中，得到重组质粒pUXCH1，该重组质粒在大肠杆菌中可以表达产生具有生物活性的几丁酶并分泌到胞外。将pUXCH1分别利用感受态法和三亲本杂交法转化荧光假单胞菌（Psendomonas fluorescens），在含有卡拉霉素的金氏B平板上筛得转化子。但将转化子点种于几丁质平板上却不能产生水解圈，提取细胞内容物后用比色法也没有检测到有效的酶活性。该研究表明环状芽孢杆菌 的几个酶基因chi1已经被成功的整合到荧光假单胞菌的染色体上，但却没有表达或表达效率极低，这可能是由于荧光假单胞菌的表达系统不能正确有效的识别存在于该chi1几丁酶基因片段中的环状芽孢杆菌基因启动子而造成的。     

产碱假单胞菌碱性脂肪酶的克隆表达及酶学性质

【目的】为获得可应用于酯类水解及合成的脂肪酶资源,本研究通过筛选分离得到能够水解长链脂肪酸酯的脂肪酶产生菌,克隆表达其脂肪酶基因并研究脂肪酶的酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解三硬脂酸甘油酯的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定,并扩增其脂肪酶基因和脂肪酶分子伴侣基因。以pET-22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes。通过PCR成功克隆到该菌的脂肪酶基因(lipPA-9A)和脂肪酶分子伴侣基因(lipPA-9B),并构建共表达重组质粒pET22b-lipPA-9A-9B,实现脂肪酶LIP-9A的活性表达。酶学性质研究表明LIP-9A的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为10.5,最适反应底物为对硝基苯酚辛酸酯(pNPO);同时,LIP-9A还可以催化醇和羧酸发生酯化反应产生酯类物质。【结论】LIP-9A在碱性条件下具有较高活力,且可以催化酯化反应,在洗涤行业和酯合成领域具有一定的应用价值。     

上海地区不同植物根际荧光假单胞菌多样性

荧光假单胞菌是一种常见的植物根际促生细菌,有开发作为生物农药的潜质．以分离自上海周边地区12种植物根际的104株荧光假单胞菌为研究对象,进行了表型分类,并采用16S—rDNARFLP和REP—PCR技术,系统地研究了荧光假单胞菌的遗传多样性．结果表明：16S—rDNARFLP酶切图谱聚类分析在85％相似性水平上,可将供试菌株划分为9群;REP—PCR指纹图谱聚类分析在76％相似性水平上,可将供试菌株划分为26群,说明上海地区的荧光假单胞菌具有丰富的遗传多样性;聚类分析结果还显示出菌株间亲缘关系与其分离地和所在植物具有相关性,表明环境条件对荧光假单胞菌的发育和遗传分化有重要影响．     

扩展青霉碱性脂肪酶的克隆、表达及表达产物的活性分析

以扩展青霉为出发菌株,用Biospin RNA Simply P试剂盒提取其总RNA,反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出扩展青霉碱性脂肪酶结构基因.构建真核重组表达质粒pEL-pIC9,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,利用MD-MM平板及PCR方法筛选和鉴定出重组子,进行甲醇诱导表达.重组子发酵液经SDS-PAGE分析显示获得了分子量约28ku的1条特异条带,用橄榄油检验板法和NaOH滴定法测其活性,酶活可达225U/mL.结果表明,扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中能高效表达为有脂肪酶活性的高活力酶.     

α-亚麻酸特异性脂肪酶产生菌的复合诱变研究

将前期实验中经筛选、紫外诱变获得的α-亚麻酸特异性脂肪酶产生菌为诱变出发菌,通过紫外线、硫酸乙二酯和氯化锂的物理—化学复合诱变处理,经平板筛选和摇瓶发酵及发酵液中脂肪酶活性的测定,分离出具有产生更高活力α-亚麻酸特异性脂肪酶的菌株,测试结果显示,其酶活较单一紫外诱变菌种提高了31%.     

萘和苯酚降解菌中儿茶酚2，3-双加氧酶基因的类似性分析及杂种酶构建

从7个萘降解菌株和5个苯酚降解菌株中经PcR扩增得到12个儿茶酚2,3-双加氧酶(C23O)基因,大小均为924 bp.根据DNA序列的类似性,可将这12个C23O基因聚类为3组,此结果与分离菌株的样本来源基本一致.这12个基因均编码307个氨基酸残基的儿茶酚2,3-双加氧酶,序列中都含有9个严格保守的氨基酸残基(Gly30、His153、Leu172、His199、His214、His246、Tyr255、Pro259、Glu265),均属于外切双加氧酶的I.2.A亚家族.通过盒式PCR,用各种萘和苯酚降解菌的C23O基因中心区替换恶臭假单胞菌ND6菌株pND6-1质粒中nahH基因的中心区,得到5个杂种C23O基因,这些基因在pET-E.coli BL21(DE3)系统中表达以后,均能检测到C23O活性,其中中心区来自假单胞菌ND24菌株C23O基因的杂种酶C23O-ND24,其比活力高于对照恶臭假单胞菌ND6菌株的野生型C23O.     

类志贺邻单胞菌噬菌体ФP4-7裂解酶Gp2的表达及活性测定

多重耐药菌株的出现给临床治疗带来了困难,噬菌体编码的裂解酶能够杀死病原菌,是潜在的重要杀菌因子.本实验采用PCR技术,扩增类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)噬菌体ФP4-7裂解酶gp2基因并克隆至质粒p QE30上进行表达,重组蛋白采用Ni-NTA亲和层析法进行纯化.重组裂解酶Gp2最适反应p H为9;裂解酶40,℃保温15,min,酶活剩余56.4%,.底物专一性实验结果显示,该裂解酶能够高效裂解5种革兰氏阴性菌,即铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),以及3种革兰氏阳性菌,即金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis).杀菌实验结果表明,裂解酶Gp2可与EDTA、LAB-35以及SDS配合使用,进一步提高该酶对铜绿假单胞菌和枯草芽胞杆菌的杀菌活性.裂解酶Gp2具有高效广谱裂菌活性,具有潜在的应用价值.     

褐球固氮菌和荧光假单胞菌原生质体制备条件的研究

为了利用原生质体融合技术获得同时具备固氮、解磷、抑病等活性的多功能菌株,本文对褐球固氮菌A41和荧光假单胞菌P32原生质体的制备条件进行了研究。通过对菌龄、酶解温度、酶浓度、酶解时间等影响因素的正交实验确定了褐球固氮菌A41和假单胞菌P32原生质体制备的最佳条件。实验结果表明,固氮菌A41最佳制备条件为菌龄20h、酶解温度37℃、酶浓度3mg/mL、酶解时间45min;假单胞菌P32最佳制备条件为菌龄20h、酶解温度37℃、酶浓度2mg/mL、酶解时间30min。     

铜绿假单胞菌中丙氨酸消旋酶的酶学特性及菌株检测

铜绿假单胞菌为条件致病菌,是目前各种医院内感染最广泛、最严重的致病菌之一.以分离自公共场所洗手液的菌株6-3为研究对象,其16S rRNA基因与Pseudomonas aeruginosa DSM 50071的16S rRNA基因的一致性为99.8%,初步确定其为铜绿假单胞菌;根据同源蛋白的核苷酸序列设计菌株6-3中丙氨酸消旋酶的扩增引物,通过PCR从6-3菌株中克隆获得了丙氨酸消旋酶基因(alrPa),基因序列与P. aeruginosa PAO1中丙氨酸消旋酶Alr_(PAO1)的氨基酸同源率为98.9%,存在4个不一致的氨基酸位点;经原核表达、Ni-NTA亲和层析法纯化获得了蛋白PaAlr,酶学特性分析表明,重组蛋白PaAlr的最适反应温度为40℃,最适反应pH=10.0;最适底物是L-Ala,具有严格的底物特异性,K_(m,L-Ala)=10.96mmol/L,V_(max,L-Ala)=1 562μmol/(L·min),K_(m,D-Ala)=8.45mmol/L,V_(max,D-Ala)=881.9μmol/(L·min),其最大反应速率约为Alr_(PAO1)的7倍;以铜绿假单胞菌中丙氨酸消旋酶为检测对象,以PCR和Western-blotting 2种方法对铜绿假单胞菌进行检测,实验发现,在目的基因序列已知的前提下,采用PCR法具有较好的检测灵敏性和专一性.     

肺炎克雷伯氏菌漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)基因组为模板,通过PCR扩增得到其漆酶基因lac;基于毕赤酵母密码子偏爱性优化后,得到新型漆酶基因lacm;将其与大肠杆菌–毕赤酵母(E. coli-P. pastoris)穿梭表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-lacm;将该质粒转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中,实现该漆酶的胞外分泌表达,发酵液中重组漆酶(rLACM)活力达0.37 U/m L.经对rLACM酶学性质分析表明:rLACM的最适温度为70℃,最适pH为8.0,在30～70℃、pH 5.0～9.0活力稳定.     

霉菌产脂肪酶发酵条件的研究

从合肥市不同环境的土壤中分离筛选到几株产碱性脂肪酶的霉菌菌株。这些菌株产酶培养基组成 (% )是 :黄豆粉 4 .0 ,玉米浆 1 .0 ,橄榄油 1 .0 ,小麦粉 1 .0 ,(NH4) 2 SO41 .0 ,K2 HPO40 .2 ,pH自然。产酶的最适温度 2 4～ 2 6℃ ,pH稳定范围为 9.4～ 9.5 ,培养周期为 72h .     

产脂肪酶假丝酵母的筛选及其研究

从武汉油污样中分离获得一株高产脂肪酶酶的假丝酵母R－2．发酵研究表明,最适培养基为蛋白胨20g/L,蔗糖10g/L,橄榄油5g/L,(NH4)2SO41g/L,MgSO4.7H2O1g/L,K2HPOR1g/L和吐温－801g/L,最适产酶条件为30℃,初始pH7．0,转速200r/min,培养32h ,最高产酶活力达到1437u/mL,酶作用最适温度40℃,最适pH7.5。     

固定化脂肪酶催化（R，JS）-1-苯乙醇转酯化拆分反应及动力学研究

利用制备的舍Fe304无机磁性复合物FSN固定假单胞茵脂肪酶（Pseudomonas sp Lipase,PSL）,获得具有高活性、高对映体选择性和易分离的固定化酶PSL／FSN．乙酸乙烯酯做酰化试剂,PSL／FSN在正庚烷溶剂中催化（R,S）-1-苯乙醇转酯化拆分反应,40℃反应2h时,（S）-1-苯乙醇对映体过量值eep和（R）-乙酸-1-苯乙酯的对映体过量值eep均为99％,（R,S）-1-苯乙醇的转化率达到理论值。固定化酶PSL／FSN在70℃经2h热处理,其活性和对映选择性没有明显的下降;PSL／FSN重复使用10次,其活性和对映体选择性未出现衰减。基于实验数据,研究了固定化酶催化（R,S）-1-苯乙醇转酯化拆分反应的动力学行为,获得了（R,S）-1-苯乙醇转酯化拆分反应的动力学方程。     

产脂肪酸菌种的筛选及部分酶学性质

从含油污泥中筛选出一株产脂肪酶活力较高的微球菌,此菌最适产酶条件：2％的蛋白胨为氮源,1％的橄榄油为碳源,pH8.0,28℃培养48h．酶学性质研究发现,在28℃和45℃脂肪酶有较高催化活力,其中28℃活力更高些,最佳反应pH为8．0,pH稳定范围在6．0～10．0之间,Ca2 和K 对酶有激活作用,Fe2 ,Cu2 和Mn2 等对酶有抑制作用．     

Burkholderia cepacia XYU-6脂肪酶的克隆及其细胞表面展示

通过分析GenBank中Burkholderia cepacia脂肪酶的序列,设计简并引物,采用同源克隆的策略,成功地从B. cepacia XYU-6菌株中克隆到脂肪酶基因bcl,其大小为1095 bp,编码364个氨基酸（ GenBank登陆号KR233260）.将bcl基因与质粒pET-28b（＋）连接并转化大肠杆菌,使脂肪酶BCL的大肠杆菌胞内过表达,其活力是野生菌的12.9倍.通过将bcl基因克隆到细胞表面展示载体pZXL中,构建脂肪酶BCL的细胞表面展示工程菌,使BCL在Lpp-OmpA引导下定位于大肠杆菌细胞表面,其活力是野生菌的3.9倍.研究结果为脂肪酶BCL后续的分子改造和应用奠定基础.     

杜邦嗜热菌脂肪酶在黑曲霉中的异源表达

该文将杜邦嗜热菌脂肪酶TDL2在黑曲霉系统中异源表达,并考察TDL2自带信号肽和pCAMBIA质粒信号肽对脂肪酶TDL2表达的影响.利用PCR和无缝克隆技术,将脂肪酶TDL2的编码序列与质粒pCAMBIA0380线性片段拼接,分别构建利用β-葡萄糖苷酶bgl2的信号肽的重组质粒pCAMBIA-TDL2-1和利用TDL2信号肽序列的重组质粒pCAMBIA-TDL2-2.用根瘤农杆菌介导转化宿主细胞A. niger CICC 2213构建组成型黑曲霉工程菌A. niger/pCAMBIA-TDL2-1和A. niger/pCAMBIA-TDL2-2,在发酵120 h后其发酵单位分别达到18.5 U·mL^-1和38.3 U·mL^-1,实现了脂肪酶TDL2在黑曲霉中的异源表达.SDS-PAGE分析和活力测定结果表明:利用脂肪酶TDL2信号肽的工程菌A. niger/pCAMBIA-TDL2-2比利用bgl2信号肽的工程菌A. niger/pCAMBIA-TDL2-1的表达量更大、发酵单位更高.     

耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选和鉴定

从国内各地采取土样分离筛选产耐有机溶剂脂肪酶的新菌株,通过形态和生理生化特征以及系统进化树分析,筛选到的新菌株命名为Pseudomonas aeruginosa CS-2.来自Pseudomonas aeruginosa CS-2的粗脂肪酶液在乙腈中酶活提高,在苯、氯仿、正己烷、石油醚和异辛烷中表现出较高的稳定性.     

肉色曲霉产碱性脂肪酶发酵条件的研究

对肉色曲霉产碱性脂肪酶的发酵条件进行优化,摇瓶实验表明,该菌株最适产酶培养基组成为（%）：黄豆饼粉2,NH4NO3 0.5,玉米粉1,糊精1,柠檬酸钠0.1,K2HPO4 0.5,FeSO4 0.006,大豆油0.6,吐温-800.5mL,pH 9.0.最适产酶温度为28℃,产酶高峰出现在96小时,最佳装液量为35mL,碱性脂肪酶菌株的酶活可达9.3U/mL.脂肪酶的最适作用pH为9.0,最适作用温度为30℃.     

洗涤剂用碱性脂肪酶稳定剂研究

青霉脂肪酶在一定浓度的钙离子存在下,显示出高的活性,当钙离子浓度为2×10-2M时,酶的相对活性达180%.乙酸钠和多羟基化合物可以作为洗涤剂的稳定剂,其中多羟基高分子化合物对青霉脂肪酶有优良的稳定和激活效果.     

棉纤维膜固定化脂肪酶的研究

对棉纤维作载体、对 - ( β-硫酸酯乙砜基 )苯胺 ( SESA)作活化剂固定化脂肪酶的工艺条件进行了研究 ,发现在醚化 p H值为 9.0～ 1 0 .0 ,交联 p H值为 7.0 ,酶的质量浓度为 6 mg· m L- 1,交联时间为 1 2 h,在室温条件下 ,得到最高固定化酶活力为 33U·g- 1。对上述条件下制备的固定化酶的稳定性进行了考察 ,用该固定化酶间歇水解橄榄油 ,重复使用 6次后相对水解率由 1 0 0 %降至 44%。该固定化脂肪酶最适使用的温度为 30～ 35℃ ,p H值为 9.0