小拟南芥液泡膜H~+-PPase基因OpVP1的克隆、序列分析及表达

植物液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在植物耐盐性起着重要的作用。为了克隆小拟南芥液泡膜H+-PPase基因,采用RT-PCR结合RACE的方法从小拟南芥叶片的cDNA中克隆了1个液泡膜H+-PPase基因,命名为OpVP1。OpVP1基因的cDNA全长为2698bp,开放阅读框(ORF)为2313bp,编码770个氨基酸。OpVP1蛋白与琴叶拟南芥、拟南芥相似性最高,分别为98.6%、98.4%。系统进化分析表明OpVP1基因属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因。OpVP1蛋白的分子量是80745.9Da,等电点pI为5.13,含有14个跨膜螺旋结构。三维结构分析表明OpVP1蛋白是由2个单体组成的二聚体蛋白。qRT-PCR表明OpVP1基因在角果中表达高于根、茎、叶和花中的表达。     

植物液泡膜H~+-Pyrophosphatase基因功能研究进展

植物液泡膜H+-PPase是一种区别于H+-ATPase的质子泵,广泛存在于生物体内.该文重点介绍植物液泡膜H+-PPase基因及同源基因的结构和功能方面的研究进展,以及该基因在不同植物上遗传转化体系的建立,并展望了该基因应用于植物耐盐抗旱基因工程中的前景.     

小麦液泡质子焦磷酸酶基因EST的克隆与分析

通过RT-PCR的方法在矮苏3小麦的总cDNA中克隆到一个与大麦液泡质子焦磷酸酶基因(VP)高度同源的EST。以该序列为基础,利用生物信息学的方法构建了一个编码小麦VP蛋白的全长EST重叠群,长2764bp,其包含一个长2355bp的完整开放读码框(ORF),编码785个氨基酸多肽。通过Southern杂交,将该VP基因定位在小麦染色体的第7同源群上。     

小拟南芥转运蛋白基因及NHX2基因的克隆与表达

转运蛋白(transport protein)是膜蛋白的一大类,介导生物膜内外的化学物质及信号的交换。植物体内存在多个与Na~+转运相关的蛋白,其中液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白(Vacuolar Na~+/H~+antiporter,NHX)在离子稳态和提高植物耐盐性方面发挥着重要作用。为了深入了解转运蛋白基因在短命植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)耐盐方面的作用,本研究首先基于小拟南芥响应高盐胁迫叶片转录组数据筛选出1157个转运蛋白基因,按功能分为Na~+转运蛋白,K~+转运蛋白,Ca~(2+)转运蛋白,ABC转运蛋白以及糖转运蛋白等,其中功能注释为Na~+转运蛋白的基因有24个。K均值(K-means)聚类分析结果显示,1157个转运蛋白基因分布于20个K subcluster,其中在K6、K9、K15子聚类中的基因数量分布较多,分别为172、193、190个。在分布于K6子聚类的Na~+转运蛋白基因中,有一个编码NHX2蛋白的基因经盐胁迫处理后明显上调表达。采用RT-PCR克隆了Ap NHX2基因,Ap NHX2开放阅读框1626 bp,编码541个氨基酸。Ap NHX2蛋白是一个典型的跨膜转运蛋白,具有12个跨膜结构区。系统进化分析表明Ap NHX2与拟南芥At NHX2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,Ap NHX2基因在小拟南芥各组织中均有表达,但在花中表达量最高。为进一步研究该基因的功能,构建了过量表达载体35S∶Ap NHX2并转化农杆菌GV3101。本研究为进一步阐述转运蛋白基因在小拟南芥响应盐胁迫中的功能机制奠定了基础。     

珍珠鸟和家鸡甲状旁腺激素3型受体(PTH3R)的结构与表达图谱分析

本研究采用RT-PCR方法,首先克隆珍珠鸟和家鸡的PTH3R基因全长cDNA序列.结果显示,家鸡PTH3R(cPTH3R)cDNA全长1632bp,编码543个氨基酸,珍珠鸟PTH3R(zPTH3R-w)cDNA序列全长1563bp,编码520个氨基酸,其蛋白均含有信号肽序列、七次跨膜区等特征性结构.此外,在珍珠鸟中还发现一个新剪接变体zPTH3R-v1,其cDNA序列全长1468bp,编码488个氨基酸,其缺失第3外显子进而导致第1跨膜结构域缺失.利用生物信息学方法,我们还对珍珠鸟和家鸡PTH3R蛋白序列进行三维建模.采用RT-PCR方法,本研究也对珍珠鸟PTH3R基因进行组织表达分析.结果显示,zPTH3R及其剪切变体zPTH3R-v1在珍珠鸟脑及外周组织中广泛表达.     

小拟南芥几丁质酶基因cDNA的克隆与序列分析

通过合成1对特异引物，应用RT-PCR技术从小拟南芥总RNA中经反转录克隆出几丁质酶基因，该cDNA基因全长985bp，含有1个963bp的开放阅读框(ORF)，编码321个氨基酸，推测分子量为35．53kD，序列同源性分析表明，该基因与拟南芥几丁质酶基因有93％的同源性。     

法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及双元载体的构建

以留兰香(MenthaspicataL)为材料,利用RT PCR方法克隆法呢基焦磷酸合酶基因(fps)的cDNA,核酸序列分析表明,该基因的编码区长1050bp,编码349个氨基酸.进一步将fps基因插入植物表达载体BinAR,酶切鉴定及测序结果都证明fps的植物双元表达载体构建成功,为fps基因在烟草中的异源表达奠定了基础.     

毛竹硅转运基因PhLsi1的ORF克隆及生物信息学分析

以水稻硅的内转运蛋白基因Lsi1的cDNA序列为信息探针,对毛竹的核酸数据库进行同源性搜索,获得全长为797bp的毛竹硅内转运蛋白基因的cDNA序列(Genbank登陆号:FP095571).与水稻Lsi1的cDNA序列相比,毛竹中该基因cDNA序列第721位处发生终止突变,导致毛竹Lsi1丢失了86个氨基酸残基.采用RTPCR方法对其进行克隆,序列分析表明,PhLsi1基因在编码时确实存在提前终止现象,共编码212个氨基酸,与水稻、玉米和大麦中已克隆的硅内转运蛋白(silicon influx transporter,含有6个跨膜螺旋区和2个NIP保守基序)的序列相似性分别高达99.3%,91.9%,91.9%,但只具有5个跨膜螺旋区和1个NIP保守基序.     

大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的cDNA克隆及序列分析

根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列,对其进行了克隆、测序及分析.结果表明:大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列全长为422bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为1.45×104,PI为6.81,含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点和一个核糖体蛋白S12 signature位点.该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性.     

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

利用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因,获得了其cDNA序列.该序列长2 317bp,含有一个2 295bp的完整开放阅读框,有8个外显子,7个内含子,编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为84 340.91和6.61.推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫(Laccase)基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明了该基因仅在野桑蚕的表皮、头部、中肠和血液中有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕漆酶基因的功能提供了分子基础.     

棉花转化酶基因保守片段的克隆及其序列分析

通过CODEHOP designer对已登陆GENEBANK的植物酸性转化酶基因序列的同源性分析,根据植物酸性转化酶基因保守区序列设计简并引物,以棉花总RNA为模板,通过RT-PCR方法得到cDNA,以此为模板通过PCR扩增得到片段长为1155bp的片段,将其克隆到加T载体上,经PCR和酶切鉴定筛选得到阳性克隆,并将阳性克隆进行测序,然后在GENBANK中进行blast检索。结果表明本研究克隆的棉花酸性转化酶基因片段编码的氨基酸与甜橙(BAF34362)、温州蜜桔(BAB82419)和梨(BAF35859)的液泡酸性转化酶基因编码的氨基酸的同源性分别为75%、75%和73%。因此,推测获得的基因片段定位于液泡。     

草鱼脂肪酸去饱和酶和延长酶基因cDNA全序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏中控制高不饱和脂肪酸(HU-FA)合成的脂肪酸去饱和酶(FAD)和脂肪酸延长酶(ELO)基因cDNA全序列.结果表明,草鱼FAD基因cDNA全长为1 994 bp,开放阅读框(ORF)为1 332 bp,编码444个氨基酸...     

胡萝卜DcPS基因的克隆、进化及根发育中表达分析

补骨素合成酶(PS)是胡萝卜营养物质补骨素生物合成的关键酶.从'黑田五寸'胡萝卜中克隆得到DcPS基因,对其进行了进化和在胡萝卜根发育过程中表达水平分析.结果表明,DcPS基因长1518 bp,编码氨基酸505 aa,属于细胞色素P450超级基因家族.其氨基酸序列含有10个明显的特征,其中含有1个跨膜区,为亲水性蛋白....     

麻疯树异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IPI)启动子的克隆及瞬时表达分析

本文以麻疯树基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到麻疯树异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)基因(JcIPI)起始密码子上游1 536bp的启动子序列.利用在线软件PLACE和PlantCARE分析表明该序列除具备TATA-Box、CAAT-Box等启动子基本元件外,还含有AuxRR-core、TATC-box、MBS、HSE等特异性元件.为确定启动子核心启动区域,构建JcIPI启动子283、550、970、1 276和1 536bp的5′端缺失片段,并将其分别驱动pBI121载体的葡萄糖苷酸酶(GUS)基因,构建植物表达载体.采用农杆菌介导法转化烟草,在烟草叶片中进行瞬时表达分析.GUS酶活测定结果显示,五个启动子缺失片段都具有启动子活性,并随长度增加而增强.     

银杏GbGGPS基因的克隆及序列分析

利用RACE技术克隆并获得了银杏牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GbGGPS基因).银杏GbGGPS基因的cDNA全长为1 641 bp,含有1个1 176 bp的可读框,编码391个氨基酸序列.生物信息学预测GbGGPS蛋白的分子质量为42.51 ku,理论等电点为5.98,N端有叶绿体信号肽,其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成.蛋白质同源分析表明,GbGGPS含有多聚异戊二烯基合成酶家族中保守的5个特征性结构域和2个富含天冬氨酸的区域.同源建模分析显示GbGGPS序列与薄荷GGPS蛋白的三维结构及活性位点高度相似.系统进化分析表明,银杏GGPS蛋白归属植物进化支,且与加拿大红豆杉、挪威云杉、北美冷杉的GGPS蛋白归为同一分支.     

蓖麻PsbO基因的克隆与序列分析

用实验室栽培的蓖麻新鲜叶片为材料,Trizol法提取总RNA,参照GenBank公布的植物PsbO氨基酸序列,进行序列比对找出氨基酸序列保守区设计简并引物,通过RT-PCR扩增目的片段,纯化后克隆到T-Vector中测序,获得蓖麻的PsbO基因,对其基因序列进行分析。了解到其长度为1081bp,5＇非编码区为10bp,3＇非编码区为273bp,编码区长798bp,编码266个氨基酸。序列分析结果表明,蓖麻PsbO基因编码的氨基酸序列与已公布的其他植物中克隆到的PsbO氨基酸序列有较高的同源性。     

齿毛菌漆酶的基因克隆、异源表达及脱色研究

通过简并PCR、TAIL-PCR、Site Finding PCR等方法从实验室前期筛选得到的一株齿毛菌中获得漆酶Lac基因(包括启动子)序列,将其c DNA转入Pichia pastoris X33中表达,以ABTS(2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))为底物测定温度和p H对酶活及其稳定性的影响,并探究重组漆酶的脱色效果.结果表明,Lac DNA长3 129 bp,含有10个内含子,编码的Lac蛋白共有542个氨基酸,与已知漆酶氨基酸序列的相似性最高为60%,在5’端950 bp序列内发现多个可能的启动子元件;成功分泌表达重组漆酶r Lac,在含1 mmol·L-1铜离子的YP培养基中28℃发酵15 d达到酶活最高峰2.89 U·m L-1;酶学性质研究发现,r Lac的最适作用温度和p H值分别为55℃和3.0,且在p H 4~10及20~40℃有较好的稳定性;r Lac对靛类、偶氮类、三苯甲烷类等多种染料都有脱色效果.     

麻疯树P5CS基因的克隆及原核表达

使用RACE技术,从麻疯树叶片中克隆了Δ1吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因,命名为JcP5CS. JcP5CS的cDNA全长2675 bp,包含一个2148 bp的开放阅读框,一个117 bp的5’-非翻译区以及一个410 bp的3’-非翻译区.开放阅读框编码716个氨基酸多肽链,分子量为77.54 kD,预测等电点为6.11.通过与其它物种的P5CS氨基酸序列比对,结果显示,与其他高等植物的P5CS氨基酸序列有很高的同源性.包含谷氨酸激酶和谷氨酸-γ-半醛脱氢酶两个结构域以及ATP及NAD (P     

西瓜八氢番茄红素合成酶基因全长的克隆与表达分析

通过RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中克隆八氢番茄红素合成酶（PSY）基因的cDNA全长,用生物信息学方法对其cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,并用实时荧光定量PCR技术研究PSY在不同瓤色西瓜果实发育过程中的表达情况.结果表明,PSY基因cDNA全长1 561 bp（GenBank登录号为KC166870）,其开放阅读框为1 266 bp,编码421个氨基酸.该基因及其推导的氨基酸序列与同为葫芦科的其他植物的PSY及氨基酸序列的同源性分别为87％和91％以上;序列分析显示,PSY氨基酸序列N末端存在转运肽信号序列.不同瓤色西瓜果实发育过程中PSY的表达存在明显差异,红瓤果实中的表达量最高,这表明PSY可能与红瓤果实中积累较多的类胡萝卜素有关;PSY的表达量均高于PSY-A,推测PSY基因主要负责果实中类胡萝卜素的合成.     

马铃薯‘转心乌’F3′5′H的cDNA克隆、原核表达和生物信息学分析

花色苷合成途径中,类黄酮-3'5'-羟基化酶是合成-3'5'-羟基花色素苷的关键酶。从‘转心乌’块茎嫩芽提取总RNA,通过RT-PCR克隆到F3'5'H的cDNA序列(GenBank登录号为HQ860267),SDS-PAGE获得表达蛋白的分子量约为55 k Da。该基因全长1 518 bp,编码区长1 485 bp,共编码494个氨基酸。