一个编码玉米转译起始因子新基因的克隆

采用DD PCR方法比较玉米杂种一代及其亲本苗期基因表达产物mRNA的差异 ,分离并鉴定出一个玉米杂种一代超亲表达的cDNA .以该cDNA为探针从cDNA文库中筛选到一个全长的cDNA克隆 (ZH0 1) .ZH0 1长 1780bp ,5′端非编码区 112bp ,3′端非编码区 395bp ,开放阅读框共编码 4 14个氨基酸 .序列同源比较表明 ,ZH0 1为一个亲的玉米转译起始因子eIF4A基因家族成员 .     

豌豆EF-1α的cDNA克隆、全序列及结构特征分析

以赤霉素 (GA)处理后的G2豌豆为材料 ,构建了一个 2 .0× 1 0 6的cDNA文库 ,用随机筛选法从该文库中得到一个 1 6 6 7bp的cDNA ,其 5′端非编码区长 1 0 0bp ,3′端非编码区长 2 2 3bp ,拥有一个 1 34 4bp的开放读码框 ,共编码 447个氨基酸 .DNA及报道的蛋白质序列同源性分析表明 ,它编码了豌豆延伸因子 1α(elongationfactor 1 alpha ,EF 1α) ,其功能区段具有很高的保守性 ,可应用于分子进化研究     

猪瘟病毒石门株全基因组cDNA文库构建、序列测定及分析

根据已发表的猪瘟病毒序列 ,设计并合成了 1 8对覆盖全长基因组的引物 .应用RT PCR技术从猪瘟病毒石门株感染的猪血中扩增出各相应的cDNA片段 ,分别克隆 ,构建了石门株全基因组的cDNA文库并完成了序列测定 .石门株基因组全长 1 2 2 98nt,其中 5′端和 3′端非编码区长度分别为 373和 2 31nt,中间一个大的开放阅读框长 1 1 6 97nt,翻译成一个包含3898个氨基酸残基的多聚蛋白 .还对石门株序列与其他猪瘟病毒序列进行了分析比较     

春化相关基因ver203FcDNA3′末端的克隆及序列分析

以差异筛选技术克隆到的春化相关基因cDNAverc2 0 3为基础 ,设计 5′端引物 ,利用RACE克隆策略 ,通过RT PCR扩增得到cDNA的 3′未端序列ver2 0 3F(1197bp) .Northernblot分析表明其全长约为 2 .0kb ,且其表达具有春化处理的特异性 .检索表明该基因序列(AB0 12 10 3)与一大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性 .推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径 .     

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因的cDNA克隆及其表达

用cDNA差示分析法从G2豌豆总RNA中筛选到一个GA3特异诱导表达的基因片段，用该片段作探针进一步筛选G2豌豆cDNA文库，得到一个全长2036bp的cDNA序列。经分析，该cDNA含有一个1746bp的可读框，编码的蛋白质含有581个氨基酸，理论分子量为64ku,cDNA及推导的氨基酸序列分别与不同来源的乙酰羟酸还原异构酶相应序列有较高的同源性。将该基因转入表达载体中并在大肠杆菌中表达，获得了具有显著酶活性的外源蛋白。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在人体纤溶与凝血的平衡调控中发挥重要作用,而且在治疗心血管栓塞性疾病方面具有广阔的应用前景.t-PA在人体内的表达受严格调控,其mRNA具有较长的非翻译区序列.我们曾报道了t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控,为研究长约209nt的5′-UTR序列对t-PA表达的影响.本文采用反转录-PCR技术从黑色素瘤细胞中克隆出t-PA cDNA 5′端序列,在体外和体内2个系统中研究了5-′UTR序列对t-PA表达的影响.     

海岛棉GbKTN1对酵母细胞伸长的影响

用5′RACE/3′RACE从海岛棉(Gossypium barbadense)开花后10 d的纤维细胞中分离获得了GbKTN1 cDNA序列, 全长2006 bp, 包括113 bp的5′非翻译区、1563 bp的可读框及327 bp的3′非翻译区(不包括终止密码子TAA). 可读框编码521个氨基酸, 蛋白质分子量约为55 kD, 靠近GbKTN1 C末端的233~414 氨基酸残基间包含一个ATP结合功能区. Southern杂交证明, GbKTN1在海岛棉基因组中以单拷贝形式存在. 半定量RT-PCR结合Southern杂交分析表明, GbKTN1在海岛棉根、茎、叶及纤维细胞中均有表达, 以纤维细胞中的表达最高, 叶中最低. 利用裂殖酵母系统, 初步分析了GbKTN1对细胞伸长的功能, 发现该基因在酵母细胞中诱导表达后使细胞显著伸长, 平均为诱导前的2.18倍, 部分细胞呈不规则形状, 这是首次在活体(in vivo)中证明KTN1与细胞的伸长有关.     

猪腮腺分泌蛋白基因序列和蛋白结构比较分析及组织表达谱鉴定

腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein, PSP)是唾液中特异性高表达的一种蛋白, 其功能与抗菌有关. 根据人、牛和鼠的PSP基因cDNA序列设计简并引物, 通过3′和5′RACE获得猪PSP基因全长cDNA序列. 同源性分析表明, 在核苷酸和氨基酸水平上, 猪、人和牛PSP基因同源性较高. 在蛋白二级和三级结构上, 猪与人PSP的结构也非常相像, 与抗菌蛋白BPI结构类似. 蛋白功能分析发现, 猪PSP基因氨基末端含有一个特殊结构Leu-X(6)-Leu-X(6)-Leu-X(7)-Leu-X(6)-Leu-X(7)-Leu-X(6)-Leu-X(6)-Leu, 可能对其功能有一定的意义. 通过RT-PCR, 斑点杂交和Northern杂交, 证明猪PSP基因是组织特异性表达, 只在腮腺和下颌下腺表达.     

白芷细胞外ECBP21全长cDNA克隆

ECBP21是从白芷悬浮培养细胞外检测并纯化的一种依赖钙的钙调素结合蛋白。利用RT－PCR和5‘-RACE方法，获得其cDNA全长。ECBP21 cDNA全长947bp，编码216个氨基酸，其中N端1－25氨基酸为信号肽，26－216氨基酸为成熟蛋白肽段，而且26－45氨基酸序列与纯化ECBP21N末端测序结果完全一致。将此cDNA成熟蛋白编码区核苷酸片段导入pET-28b( )表达载体中，并在大肠杆菌表达系统中诱导表达，经CaM-Gel overlay检测证实表达蛋白具有Ca^2 依赖的钙调素结合特征，从而进一步证实了cDNA克隆的正确性。这为进一步用分子生物学方法研究植物细胞外多肽ECBP21的生物学功能奠定了基础。     

玉米Cat1基因顺式元件ABRE2结合蛋白ABP9的基因克隆及功能分析

构建了授粉后17d(17dpp)的玉米幼胚cDNA基因文库，用玉米Catl基因顺式元件ABRE2通过酵母单杂交的方法筛选文库，获得3个完全相同的阳性克隆，命名为ABP9，用5′RACE的方法得到了该基因的全长cDNA序列，研究结果表明，ABP9属于bZIP类转录因子，与玉米Catl基因顺式元件ABRE2具有结合特异性，且在酵母细胞中具有转录激活功能。     

人硫氧还蛋白存在不同的选择性剪切形式

利用RT_PCR技术、基因克隆化和基因表达技术 ,首次在人胎肝细胞中发现了人硫氧还蛋白 (hTRX)的另外一种选择性剪切形式 (hTRXδ3) .经测序证实hTRXδ3缺失正常hTRX第 3外显子的 6 0bp ,无其他编码区域改变 ,其酶活性位点依然存在 .经大肠杆菌表达重组蛋白的活性分析 ,hTRXδ3依赖DTT催化胰岛素还原的活性明显低于完整的hTRX蛋白 .本文结果为进一步研究hTRX的结构与功能提供了基础     

大豆GmNHX1在百脉根中的过表达研究: 体内Na+含量的降低是耐盐性提高的基础

从大豆中克隆到了液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白编码基因(GmNHX1)的全长cDNA, 包括5′端非翻译区464 bp, 编码区1641 bp, 3′端非翻译区486 bp, 共2591 bp. 该cDNA编码的GmNHX1蛋白共546个氨基酸, 具有典型的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白特征, 与已知功能的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白AtNHX1, OsNHX1及AgNHX1具有较高的同源性. GmNHX1在大豆基因组中为单拷贝基因, 其表达具有组织特异性, 并能受到NaCl, KCl, LiCl, ABA以及脱水等胁迫上调; 耐盐品种GmNHX1的转录水平在叶片中低于而在根系和下胚轴中均高于敏盐品种. 将GmNHX1 cDNA置于两个串联的CaMV35S启动子控制下在豆科模式植物百脉根中过表达, 提高了转基因百脉根的耐盐性. Na⁺及K⁺含量测定表明, 与对照相比, 过表达GmNHX1的百脉根小苗中Na⁺, K⁺含量显著降低, K⁺/Na⁺比率显著增加, 显示了百脉根中过表达GmNHX1所导致的耐盐性与减少转基因植物中Na⁺的积累有密切关系.     

水稻紫黄质脱环氧化酶基因的克隆、体外表达及酶促反应

从水稻中克隆了紫黄质脱环氧化酶（VDE）基因，其全长cDNA序列为1887bp，编码446个氨基酸，其中转运肽长98个氨基酸，构建了该基因的原核表达载体pET-Rvde，在0.4mmol/L IPTG的诱导下，外源蛋白大量表达，其分子量与天然的VDE蛋白一致，表达量随诱导时间而增加。Western杂交表明表达蛋白与VDE的多克隆抗体有免疫反应，将表达蛋白用于紫黄质的脱环氧化反应，吸收光谱及HPLC分析结果表明，表达蛋白能在体外催化紫黄质转变成为玉米黄质和环氧玉米黄质。     

中国登革2型病毒反向遗传系统的构建与鉴定

为构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的反向遗传系统, 根据已测定的DEN2-43全基因组序列, 利用长链RT-PCR及融合PCR扩增此病毒基因组全长cDNA分子, 并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆. 将此克隆体外转录后, 经电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒. 结果表明, 获得的基因组全长cDNA克隆具有感染性, 所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及乳鼠神经毒力, 且可稳定传代. 该反向遗传系统的构建为深入探讨登革病毒的致病机理及新型疫苗的研制奠定了基础.     

哺乳动物驱动蛋白的计算基因组学分析与鉴定

提供了一种新颖的、基于比较基因组学方法的全长驱动蛋白预测方法(full-length kinesin prediction program, FKPP), 用于哺乳动物中驱动蛋白质组的鉴定与研究. 之前的预测认为, 哺乳动物共含94个驱动蛋白, 而用FKPP从哺乳动物的基因组中总共鉴定出134个可能的驱动蛋白基因. 基于数据库中存在的片段序列, 用FKPP鉴定出25个可能的全长驱动蛋白. 此外, 用FKPP方法发现人的动点马达蛋白CENP-E应包含2701个氨基酸, 而不是当初根据克隆预测的2663个氨基酸. 通过对CENP-E的cDNA进行重测序, 并同时采用特异性识别FKPP预测的CENP-E多肽抗体予以实验评估, 结果表明, FKPP预测的CENP-E氨基酸序列是正确的. 为此, 本研究利用FKPP对哺乳动物的驱动蛋白进行了重新分类. 鉴于目前公共数据库含有较多非全长序列的蛋白片段, FKPP可提供一个具有显著效率且准确新颖的全长序列预测手段, 用于驱动蛋白以及其他蛋白家族的分子鉴定.     

一个竹类植物MADS盒基因的克隆及其在拟南芥中的表达

采用RACE方法, 从竹类植物麻竹(Dendrocalamus latiflorus)幼穗中克隆到一个含完整编码区及3′端非翻译区的cDNA, 命名为 DlMADS18. 该cDNA全长1039 bp; 编码区共编码249个氨基酸, 具有典型的植物MADS盒基因结构, 由MADS区、I区、K区和C末端组成. 序列相似性分析结果表明, DlMADS18属于AGL6亚家族, 其氨基酸序列与水稻(Oryza sativa L)的MADS盒基因OsMADS6同源性最高, 序列一致性为88%, 与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AGL6一致性为59%. 将DlMADS18置于CaMV 35S启动子控制下在拟南芥中异位表达, 转基因拟南芥表现出叶卷曲、植株矮小、开花时间提前、花聚生于花序顶端等性状, 表明DlMADS18很可能参与麻竹开花时间的调控.     

山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.     

一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

胚乳特异sbeⅡa启动子在小麦中的评价及特性分析

淀粉的合成是一个复杂的生化过程. sbeⅡa基因是淀粉合成过程中的关键酶基因之一, 在小麦籽粒成熟过程中对淀粉, 尤其对支链淀粉的生物合成调控起重要作用. 为了解sbeⅡa基因的调控机理及其胚乳特异表达特性, 利用APCR方法克隆了sbeⅡa启动子3094 bp片段, 并对该片段进行测序, 同时利用GUS瞬间表达体系对sbeⅡa启动子序列进行不同片段的功能缺失研究. 研究结果表明, 3094 bp序列(存在于sbe.g融合体中)具有稳定的启动子活性, 而5′或3′缺失体的启动子活性明显降低. 在sbeⅡa启动子中间缺失体中, 一些缺失体仅有微弱活性, 但sbe.e在缺失–1579~–1210 bp片段情况下, 却具有比sbe.g(含启动子全长序列)还要高的启动子活性. 研究初步证明, 一些固定序列(motifs), 如 –300 bp因子、G盒以及醇溶蛋白盒(Prolamin box)等作为正调控因子在决定启动子胚乳特异表达模式中是必需的, 而且在–1579~–1210 bp片段中也存在一些负调控因子或固定序列. 在瞬间表达检测体系中, 小麦胚乳组织年龄对检测结果有着重要影响.