基于白纹伊蚊转录组的溴氰菊酯抗性相关基因分析及验证

目的 通过对白纹伊蚊溴氰菊酯抗性品系(DR)和敏感品系(DS)进行转录组分析,筛选可能与抗性相关的差异表达基因。方法 提取白纹伊蚊实验室敏感品系(DS品系)、溴氰菊酯抗性品系(DR品系)的总RNA进行高通量测序,对差异基因进行COG和KEGG的功能注释与分析,筛选出可能与抗性相关的差异表达基因,并进行实时定量PCR验证。结果 DR品系的LC₅₀为2 087.75μg/L,相较于DS品系,抗性倍数为109.8倍,达到了高度抗性标准。RNA-seq测序后基于FPKM值进行差异性分析结果显示,差异表达的基因共有551个,其中在DR品系中上调表达基因有278个,下调表达基因有273个。COG和KEGG功能富集结果显示,显著性富集的通路和蛋白质功能预测均主要与物质代谢相关。基于此进一步分析了代谢抗性相关基因,且10个目标基因的RNA-seq结果与实时定量PCR结果在DR和DS品系中表达趋势具有一致性。结论 白纹伊蚊可能通过上调表达细胞色素P450基因、谷胱甘肽S转移酶基因、羧酸酯酶、表皮蛋白等基因应对杀虫剂的选择压力。     

双氢青蒿素抑制胶质瘤细胞生长机制

目的 探讨双氢青蒿素对胶质瘤细胞C6生长影响及可能机制。方法 培养大鼠脑胶质瘤C6细胞,噻唑蓝法检测双氢青蒿素对C6细胞生长抑制率,annexin V/PI检测C6细胞凋亡率;ELISA法检测细胞培养液上清中cyclinD1、Bax和casepase-3蛋白表达变化;Western blot法检测Bax和Bcl-2蛋白表达量。结果 双氢青蒿素可明显抑制C6细胞生长,以作用48 h最为明显,0.05、0.50、5.00和50.00μmol/L双氢青蒿素组细胞生长抑制率分别为(83.96±1.08)% 、(74.04±3.54)% 、(68.70±9.20)% 和(57.25±7.01)%,与对照组(100.00±1.07)% 比较,差异有统计学意义(P<0.01);50.00μmol/L双氢青蒿素组细胞凋亡率[(25.98±3.95)%]明显高于对照组[(2.32±0.78)%],差异有统计学意义(P<0.01);与对照组比较,各剂量双氢青蒿素组C6细胞培养液上清中caspase-3分泌增加,50.00μmol/L双氢青蒿素组细胞Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少,Bax/Bcl-2比值增加。结论 双氢青蒿素通过下调cyclin D1蛋白,上调Bax/Bcl-2比值使caspase-3蛋白活化,从而抑制胶质瘤细胞生长。     

p27kip1基因转移抑制大鼠胶质瘤生长的实验研究

[目的]探讨重组腺病毒介导的人突变型p27kip1基因（Ad-p27kip1）表达对大鼠神经胶质瘤移植瘤生长的抑制作用。[方法]建立大鼠胶质瘤移植瘤模型,随机分成3组：Ad-p27组、Ad-LacZ组、PBS组。Ad-p27组给予腺病毒介导的人p27 kip1基因（Ad-p27kip1）瘤内注射,另2组分别给予Ad-LacZ和PBS瘤内注射,观察对肿瘤生长的抑制情况,并用免疫荧光法检测P27和CyclinD1的表达;原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡情况。[结果]给予Ad-p27kip1基因治疗的实验组大鼠肿瘤生长受到明显抑制;在颅内肿瘤模型组给予Ad-p27治疗的大鼠生存时间明显延长;免疫荧光染色显示移植瘤P27表达明显增强,CyclinD1的表达受到抑制。Ad-p27组细胞凋亡显著多于Ad-LacZ组和PBS组。[结论]腺病毒介导的人p27基因（Ad-p27kip1）对大鼠胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,其机制是增强p27表达、抑制CyclinD1的表达、诱导胶质瘤细胞凋亡。     

人脑胶质瘤中凋亡相关基因Survivin的表达及意义

目的 探讨凋亡相关基因Survivin表达在人脑胶质瘤发生、发展中的临床意义.方法 按Kernohan四级分类法将96例脑胶质瘤患者分为Ⅰ级26例、Ⅱ级32例、Ⅲ级28例和Ⅳ级10例;另取12例正常脑组织作为对照组.采用免疫组织化学sP法检测各组标本中Survivin的表达情况.结果 Survivin在正常脑组织和脑胶质瘤组织中的阳性表达率分别为0和58.3%,二者比较差异有统计学意义(P＜0.05).Ⅰ～Ⅳ级脑胶质瘤Survivin的阳性表达率分别为38.5%、53.1%、75.0%和80.0%,各级比较间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 凋亡相关基因Survivin在脑胶质瘤中呈过度表达,且其阳性表达率随着脑胶质瘤恶性程度的增高而升高.     

基于多组学数据对胃癌细胞性别差异表达基因的鉴别和分析

目的 鉴别和分析胃癌细胞的性别差异表达基因。方法 使用生物信息学方法分析从不同性别胃癌患者恶性腹水中得到的胃癌细胞RNA-seq数据（n=59）,筛选差异表达基因,联合H3K27ac Ch IP-seq数据（n=44）关联性别差异增强子的目标基因,取两者重叠基因为胃癌细胞的性别差异表达基因并在TCGA数据库和体外细胞系中进行验证。结果RNA-seq共鉴别到差异表达基因133个,其中最显著差异表达基因为XIST和RPS4Y1,表现出明显的性别差异。GO分析和PPI网络分析均显示差异表达基因主要与蛋白质糖基化、上皮细胞发育和细胞黏附等过程相关。对Ch IP-seq中的性别差异增强子进行分析,共关联到基因103个。GO分析表明这些基因主要与细胞对应激反应的调节、胰岛素分泌的调节、水平衡等过程相关。取RNA-seq与Ch IP-seq共同差异基因,共有9个重叠基因DPM1、CFTR、MET、NT5E、EPCAM、LAMA3、BAD、GRIN2D、和FZD5。基因功能分析表明上述基因与蛋白质糖基化、粘着斑和c AMP信号通路等有关。TCGA数据库（n=60）和体外胃癌细胞系（n=6）RT-q P...     

PTEN在脑胶质瘤表达的研究

目的探讨抑癌基因PTEN在脑胶质瘤的表达情况及其临床意义.方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测45例胶质瘤组织与23例正常脑组织PTEN基因外显子1-9、5-8 mRNA表达情况.结果在45例肿瘤组织中,PTEN-mRNA相对表达量的均数和标准差分别为外显子1-9 0.40,0.19,外显子5-8 0.38,0.16.正常脑组织中PTENmRNA相对表达量的均数和标准差分别为外显子1-9 0.58,0.21,外显子5-8 0.64,0.17.胶质瘤组织和正常脑组织中PTENmRNA表达水平存在明显差别(P＜0.05).胶质瘤中PTENmRNA表达水平与患者年龄、性别无关,但随着恶性程度分级增高其表达水平明显降低(P＜0.05).结论PTENmRNA表达水平的异常在胶质瘤的发生和发展过程中起着重要作用.     

越桔原花青素抑制胶质瘤细胞生长作用

目的 探讨越桔原花青素对胶质瘤细胞生长的影响及其机制。方法 培养胶质瘤SHG-44细胞,随机分为对照组和越桔原花青素低、中、高剂量组(10、20、40μg/L),采用噻唑蓝法(MTT)检测越桔原花青素对细胞生长的抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态学变化,流式细胞术分析细胞周期变化,western blot检测细胞周期蛋白cyclinD1表达。结果 MTT结果显示,各剂量越桔原花青素均可抑制胶质瘤细胞生长,与对照组比较,10、20、40 mg/L越桔原花青素作用48、72 h时,胶质瘤细胞生长[A值分别为(0.56±0.03)、(0.42±0.07)、(0.29±0.02)和(0.71±0.09)、(0.56±0.02)、(0.30±0.01)]均明显受抑制,差异有统计学意义(P<0.05);倒置显微镜观察发现,越桔原花青素组细胞密度随剂量升高而减少,细胞明显皱缩;流式细胞分析结果显示,随着剂量增加,SubG1期细胞明显增多而G2/M期细胞明显减少;Western blot结果显示,20、40μg/L越桔原花青素组胶质瘤细胞cyclin D1蛋白表达[分别为(2.40±0.18)和(1.82±0.20)]高于对照组(3.06±0.11),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 越桔原花青素可抑制胶质瘤细胞的体外生长,其机制可能与降低胶质瘤细胞内cyclinD1蛋白表达、阻滞细胞周期有关。     

Survivin基因调节人脑胶质瘤细胞侵袭与迁移机制的探讨

目的:检测并研究Survivin基因对U251及U87神经胶质瘤细胞侵袭及迁移的影响,为胶质瘤的基因治疗提供理论和实验依据.方法:(1)通过划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞在干扰及过表达Survivin胶质瘤细胞迁移的变化;(2)通过Transwell侵袭实验检测细胞在干扰及过表达Survivin胶质瘤细胞侵袭能力的变化;(3)通过Westernblot和免疫荧光实验检测细胞在干扰Survivin 48h后N-cadherin表达及定位的变化;(4)通过明胶酶谱实验检测在干扰及过表达Survivin 48h后细胞分泌MMP的变化.结果:(1)针对Survivin特异性的三条siRNAoligo,干扰效率达70％-80％;过表达后转染率在80％左右;(2)划痕实验Transwell实验(不铺胶)证实转染siRNAoligo和过表达Survivin后细胞迁移数目明显低于对照组(P＜0.01),Transwell迁移实验证实转染siRNAoligo和过表达Survivin后穿过滤膜的细胞数目明显低于对照组(P＜0.01);(3) Transwell侵袭实验证实转染siRNAoligo和过表达Survivin后细胞侵袭数目明显低于对照组(P＜0.01);(4)明胶酶谱证实转染siRNAoligo后细胞分泌基质金属酶低于对照组,而过表达Survivin后高于对照组;明胶酶谱实验显示:与对照组相比,siRNAoligo组MMP2的活性明显降低(P＜0.05).结论:(1) Survivin基因调节神经胶质瘤细胞的迁移能力;(2) Survivin基因通过调节MMP2的分泌来影响神经胶质瘤细胞的侵袭能力.     

IncRNA XIST在胶质瘤中的表达及生物学功能

目的 研究探讨lnc RNA XIST在胶质瘤中的表达水平及其生物学功能.方法 选取2018年6月—2019年5月的35例胶质瘤患者为观察组,同时期的35例脑外伤患者为对照组.比较两组、观察组中不同分级者的组织lnc RNA XIST表达情况,同时检测转染siRNA XIST与siRNA-NC的U87及U251细胞克隆...     

胶质瘤患者中BMI1通过抑制CXXC4表达激活Wnt途径对胶质瘤细胞转移的影响

目的 探究BMI1对胶质瘤的作用及可能的作用机制。方法 收集胶质瘤和正常脑组织各25例。RT-PCR和免疫组化检测BMI1的表达; RT-PCR检测U251和SVGp12细胞中BMI1和CXXC4 m RNA表达; Western blot检测BMI1、CXXC4、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、β-catenin、C-myc和Cyclin D1表达; Ch IP-PCR实验检测BMI1与CXXC4启动子的结合; CCK-8检测细胞活力; Ed U试剂盒检测细胞增殖; Transwell检测细胞迁移和侵袭。结果 胶质瘤组BMI1 m RNA表达和免疫组化评分较正常组明显上调(P <0.05)。U251组细胞中BMI1 m RNA和蛋白表达较SVGp12组明显上调(P <0.05),CXXC4 m RNA和蛋白表达明显下调(P <0.05)。BMI1可与CXXC4启动子相结合。si RNA-BMI1+si RNA-CXXC4组细胞中CXXC4 m RNA表达以及CXXC4和E-cadherin蛋白表达较si RNA-BMI1组明显下调(P ...     

人卵丘细胞内基因表达与胚胎发育潜能的关系

缺乏准确、客观、非侵入性的胚胎评估标准是目前体外受精-胚胎移植技术所面临的主要挑战之一。本文对卵丘细胞内基因表达与胚胎及卵子发育潜能之间的相关研究进行了总结,发现卵丘细胞内特定基因的表达与胚胎发育、成熟及发育潜能之间存在紧密的联系。近年来,通过实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）及微阵列技术筛选出一系列颗粒细胞中能够预测受精结局、胚胎形态学评分、妊娠结局等胚胎发育潜能的候选标记基因,这些基因主要涉及卵丘扩展、脂类代谢、细胞凋亡等过程。然而,卵母细胞及胚胎的发育受卵泡内、外多种因素的影响。欲确立一种全面、准确、非侵入性的胚胎发育潜能评估方法仍需更深入的研究。     

2002年云南非脊灰病毒测序定型和ECHO13病毒基因特征分析

目的对云南省2002年急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中非脊灰病毒(non-polio,NPV)的带毒情况及埃柯病毒13型(echovirus 13,E13)的基因特征进行描述。方法按Obster等介绍的方法,对2002年云南省脊灰实验室分离到的21株NPV进行基因测序定型。结果 2002年云南省共报告267例AFP病例,共采集到<15岁AFP病例的合格粪便标本257份,257份便标本中共检测到NPV43株(带毒率为16.7%),其中脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)22株(阳性率8.6%),均为疫苗株,未发现脊灰野病毒;检测到非脊灰病毒(NPV)21株(阳性率8.2%)。21株EV中,12株为人类肠道病毒B组(HEV-B,11个血清型,其中3株为E13),3株为人类肠道病毒C组(HEV-C,1个血清型),未分离到HEV-A和HEV-D组病毒。结论 2002年云南省AFP病例中非脊灰病毒携带率不高。对3株常见的E13进行基因进化分析,表明E13病毒存在基因多样性特点(即存在不同的基因型)。     

浓缩铀诱发细胞凋亡的形态及基因调控

目的　研究浓缩铀诱发人白血病HL 6 0细胞凋亡的电镜形态特征 ,以及对相关基因bcl 2和bax的调控作用。方法　探讨受浓缩铀内照射不同时间 ,诱发HL 6 0细胞凋亡的电镜形态 ;运用免疫组织化学技术探讨浓缩铀对HL 6 0细胞bcl 2和bax蛋白的表达 ,运用RNA分子杂交技术探讨浓缩铀对HL 6 0细胞bcl 2mRNA的转录水平表达的影响。结果　人白血病HL 6 0细胞在浓缩铀辐照作用下 ,可呈现核断裂和核染质边聚。对照的HL 6 0细胞中bcl 2蛋白呈高度表达 ,为 (88± 7) % ,而受浓缩铀辐照下 ,可下调至(6 1± 5 ) %。bax在对照细胞中表达很低 ,在浓缩铀作用下 ,未见明显改变。经浓缩铀辐照后 ,可使HL 6 0细胞中的bcl 2mRNA表达呈明显下调。结论　浓缩铀内照射可诱发人白血病HL 6 0细胞凋亡发生 ,且其诱发HL 6 0细胞的凋亡作用与其下调凋亡相关基因bcl 2的表达相关联     

cDNA代表性差异分析法筛选二羟环氧苯并芘致癌相关基因片段

目的采用cDNA代表性差异分析法,分离二羟环氧苯并芘诱导恶性转化的细胞与对照组细胞之间的差异表达基因。方法先从细胞中提取mRNA并合成双链cDNA,双链DNA以Sau3AI内切酶消化,连接接头并经PCR扩增。以BPDE诱导恶变细胞的cDNA为“检测子”、以对照组细胞cDNA为“驱赶子”进行消减杂交。结果经3轮消减杂交后分离出5个cDNA片段,在琼脂糖凝胶上清晰显示210bp以下的5条条带,这些片段分别与总RNA作Northern印迹杂交证实它们均来自BPDE诱变的细胞。结论cDNA代表性差异分析法是筛选化学致癌相关基因的有效、灵敏的方法。     

citrin缺陷所致新生儿肝内胆汁淤积症的SLC25A13基因IVS16ins3kb突变类型分析

目的探讨citrin缺陷所致新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD)患儿SLC25A13基因IVS16ins3kb突变类型的第二代测序技术(NGS)数据分析特点。方法选择2017年7月与2020年4月,浙江大学医学院附属金华医院儿科收治的符合NICCD临床诊断标准,采用染色体组分析工具箱(GATK)、XHMM、CNVkit软件,对患儿NGS靶向外显子捕获测序数据进行单核苷酸变异(SNV)、插入与缺失突变、拷贝数变异(CNV)分析,仅提示SLC25A13基因单个位点杂合突变的2例患儿(患儿1、2)为研究对象。采用回顾性分析方法,收集患儿1、2的临床病例资料,包括病史、实验室检查结果、基因检测结果、治疗与预后等。利用福君基因动态实验室信息管理系统3.0(FLIMS系统),采用split read方法,对患儿1、2的NGS靶向外显子捕获测序原始数据(fastq格式)进行IVS16ins3kb突变类型分析,并采用长链、高保真PCR(LA-PCR)方法进行验证。本研究遵循的程序符合浙江大学医学院附属金华医院医学伦理委员会规定,并获得该委员会批准(审批文号:2018-119)。结果①病史采集:患儿1(女性)与患儿2(男性),分别因皮肤黄染2个月余与4个月余,于本院就诊,就诊时年龄分别为2个月+19 d、4个月+16 d,均为足月儿、均无家族遗传性疾病史。②实验室检查、治疗:入院时,对患儿1、2干血片采取串联质谱仪进行遗传代谢病检测结果显示,血液中瓜氨酸、甲硫氨酸等多种氨基酸含量显著增高;肘静脉血生化检查结果显示,血清氨、乳酸浓度及血清总胆红素(STB)、血清直接胆红素(SDB)、血清间接胆红素(SIB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶、碱性磷酸酶均异常增高。对患儿1、2均采取无乳糖配方奶喂养3个月后,血液生化指标均明显好转。③NGS靶向外显子捕获及Sanger测序法验证结果:采用GATK、XHMM、CNVki软件对患儿1、2的NGS靶向外显子捕获测序数据进行SNV、插入与缺失突变、CNV分析结果提示,分别存在SLC25A13基因9号外显子c.852_855delTATG、16号外显子c.1638_1660dup杂合移码、功能缺失性热点突变,经Sanger测序法验证,上述突变分别遗传自患儿1、2父亲。④使用split read方法,对患儿1、2的NGS靶向外显子捕获测序原始数据(fastq格式)进行分析发现,SLC25A13基因16号内含子区域特征性split read一端为6号染色体DNA序列,另一端为7号染色体DNA序列,SLC25A13基因16号内含子区域特征性split read发生结构变异,可能为7号染色体SLC25A13基因发生IVS16ins3kb插入突变。⑤采用LA-PCR方法验证结果提示,患儿1、2分别存在SLC25A13基因c.852_855delTATG+IVS16ins3kb及c.1638_1660dup+IVS16ins3kb复合杂合热点突变,均被确诊为NICCD患儿。结论对于NGS结果呈阴性或检出SLC25A13基因单个位点杂合突变的临床疑似NICCD患儿,可采用split read方法,对其NGS原始数据(fastq格式)进一步进行IVS16ins3kb突变分析,降低对该病患儿漏诊及误诊率。     

Dietary Fibre and Organic Acids in Kiwifruit Suppress Glycaemic Response Equally by Delaying Absorption—A Randomised Crossover Human Trial with Parallel Analysis of 13C-Acetate Uptake

Non-sugar components of kiwifruit reduce the amplitude of the glycaemic response to co-consumed cereal starch. We determined the relative contribution of different non-sugar kiwifruit components to this anti-glycaemic effect. Healthy participants (n = 9) ingested equal carbohydrate meals containing 20 g starch as wheat biscuit (WB, 30 g), and the sugar equivalent of two kiwifruit (KFsug, 20.4 g), either intrinsic or added as glucose, fructose and sucrose (2:2:1). The meals were WB+KFsug (control, no non-sugar kiwifruit components), WB + whole kiwifruit pulp (WB+KF), WB + neutralised kiwifruit pulp (WB+KFneut), WB + low-fibre kiwifruit juice (WB+KFjuice) and WB+KFsug + kiwifruit organic acids (WB+KFsug+OA). All meals were spiked with 100 mg sodium [1-¹³C] acetate to measure intestinal absorption. Each participant ingested all meals in random order. Blood glucose and breath ¹³CO₂ were measured at ingestion and at 15 min intervals up to 180 min. Compared with WB+KFsug, whole kiwifruit pulp (WB+KF) almost halved glycaemic response amplitude (p < 0.001), reduced incremental area under the blood glucose response curve (iAUC) at 30 min (peak) by 50% (p < 0.001), and averted late postprandial hypoglycaemia. All other treatments suppressed response amplitude half as much as whole kiwifruit and averted acute hypoglycaemia, with little effect on iAUC. Effects on ¹³CO₂ exhalation paralleled effects on blood glucose (R² = 0.97). Dietary fibre and organic acids contributed equally to the anti-glycaemic effect of kiwifruit by reducing intestinal absorption rate. Kiwifruit flesh effectively attenuates glycaemic response in carbohydrate exchange, as it contains fructose, dietary fibre and organic acids.