比格犬牙髓干细胞的培养与鉴定

目的 应用经典的人牙髓干细胞分离培养方法证明比格( Beagle)犬牙髓干细胞的存在,以期为大型动物的牙源性干细胞性质及其应用研究提供基础.方法 获取比格犬健康恒牙牙髓组织,应用分散酶进行消化培养获得细胞,并通过观察其生物学特性、多向分化能力及干细胞相关表面标志物的表达等方法进行鉴定.结果 经酶消化法获得的比格犬牙髓干细胞形态与人牙髓干细胞形态相似,呈典型的成纤维细胞形态;比格犬牙髓干细胞的牙龈成纤维细胞集落形成率为150个集落/104个细胞,显著高于人牙髓干细胞的牙龈成纤维细胞集落形成率(60个集落/104个细胞),差异有统计学意义(P＜0.001);比格犬牙髓干细胞具有多向分化能力,在体外经诱导可以形成矿化结节、脂滴和成软骨细胞,同时比格犬牙髓干细胞表达间充质干细胞相关表面标志物基质细胞抗原( STRO-1)、CD146、碱性磷酸酶、波形蛋白、细胞角蛋白18及神经上皮干细胞蛋白(nestin).结论 本项研究证实了比格犬牙髓组织中存在牙髓干细胞,并具有增殖活跃的特件和多向分化的潜能.     

犬乳牙牙髓干细胞体外培养及生物学性能研究

目的：体外分离培养比格犬乳牙牙髓干细胞（DTPSCs）,研究其生物学特性。方法：用酶解组织块法培养6周龄比格犬 DTPSCs,克隆法纯化,检测细胞克隆形成能力及增殖曲线;免疫组化鉴定细胞来源,流式细胞术鉴定细胞表面标记物;进行细胞多向诱导分化能力检测。结果：获得了成集落状生长的犬乳牙牙髓细胞,其克隆形成率为32％;免疫组化确定细胞为间充质而非造血来源;流式细胞术鉴定 STRO-1、CD146阳性表达,而 CD14、CD45及 CD86阴性表达;细胞成骨、成脂诱导后分别对茜素红、油红 O 染色阳性,成牙本质诱导后细胞碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白染色阳性,且细胞内碱性磷酸酶活性显著增高。结论：比格犬乳牙牙髓中存在具有间充质干细胞表型、自我更新及多向分化能力的干细胞。     

富血小板纤维蛋白对人牙槽骨成骨细胞增殖和分化的影响

目的:研究富血小板纤维蛋白(plate-rich fibrin,PRF)体外对人牙槽骨成骨细胞(human alveolar osteoblasts,HAOB)增殖分化的影响,探讨HAOB与PRF构建临床组织工程骨的可能性。方法 :收集临床拔牙过程中的牙槽骨,采用改良酶消化法体外分离培养HAOB,根据成骨细胞形态学特征及成骨特性对所培养出的细胞进行鉴定,后加入志愿者的PRF分组培养;而后在不同的实验时间点进行细胞增殖CCK-8检测、碱性磷酸酶(ALP)定性检测、钙结节茜素红染色以及成骨相关基因RT-PCR检测。结果:HAOB具有典型的成骨细胞的形态;随时间的延长,细胞数目明显增加(P<0.05),实验组(PRF组)细胞数量明显高于对照组。实验组ALP染色较对照组颜色更深,ALP活性相对较高。经茜素红染色,实验组镜下观察形成的钙结节数量较对照组多。在第7和11天发现实验组成骨相关基因的表达量均高于对照组。结论:采用改良酶消化法分离培养的HAOB具有典型的成骨细胞生物学特性,且成分较为单一;PRF体外具有促进HAOB增殖分化的能力。     

人恒牙牙髓干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的:研究人恒牙牙髓组织来源的牙髓干细胞在体外分化为成骨细胞的能力,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织,应用酶消化法获得牙髓细胞.单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞,第3代牙髓干细胞用成骨向诱导培养基向成骨细胞诱导分化.用碱性磷酸酶染色和Vo...     

山羊乳牙牙髓细胞体外培养和绿色荧光转染的研究

目的:体外分离、培养山羊乳牙牙髓细胞,并转染绿色荧光蛋白.方法:采用组织块法获得山羊乳牙牙髓细胞,细胞计数法测定生长曲线.细胞爬片行HE染色、碱性磷酸酶染色、抗波形蛋白和角蛋白免疫组化染色.加入含GFP反转录病毒液转染山羊乳牙牙髓细胞.结果:通过组织块法获得了山羊乳牙牙髓细胞,细胞群体倍增时间为43.79h.HE染色显示细胞形态为梭形,细胞体小,胞核大.细胞碱性磷酸酶染色阳性,抗波形蛋白免疫组化染色阳性,抗角蛋白免疫组化染色阴性.转染绿色荧光蛋白后,细胞能持续表达绿色荧光.结论:山羊乳牙牙髓组织可分离培养出间叶来源的乳牙牙髓细胞,并成功使之表达绿色荧光.     

浓缩生长因子用于比格犬成熟恒牙牙髓再生的实验研究

目的:探讨浓缩生长因子(CGF)结合牙髓血运重建术在比格犬成熟恒牙牙髓再生中的作用。方法:选择6只18月龄比格犬的36颗上颌门齿,分为4组：阳性对照组不干预,阴性对照组建立根尖周炎并牙根吸收模型后不治疗,血运重建组建立同样模型后行牙髓血运重建术,血运重建加置CGF膜组建立同样模型后置CGF膜行牙髓血运重建术。术后拍摄X线片,HE染色观察各组牙组织学变化。结果:比格犬实验模型建立成功。血运重建组和血运重建加置CGF膜组根尖周阴影缩小,根尖部矿化组织中可见骨陷窝,但后者矿化组织更致密。结论:CGF结合牙髓血运重建术有促进犬成熟恒牙根尖周炎愈合和牙根发育的作用。     

Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨骨髓基质干细胞体外培养及其成骨特性观察

目的:观察Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨骨髓基质干细胞(BMSCs)的成骨分化特性。方法:无菌条件下从10周龄GK大鼠(实验组)及同龄正常Wistar大鼠(对照组)下颌骨获取BMSCs,采用全骨髓贴壁培养法对细胞进行纯化及培养,流式细胞仪检测干细胞表型.取第3代细胞成骨诱导培养,分别对两组细胞行茜素红染色,碱性磷酸酶染色及活性测定,培养基钙、磷含量测定,以及real-time PCR测定Runx2基因表达变化。结果:成功培养出Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨来源的BMSCs,与正常组比较,实验组BMSCs茜素红染色变浅、钙结节形成减少,碱性磷酸酶(ALP)活性下降,细胞钙、磷分泌显著降低,差异有统计学意(P<0.05);Runx2 mRNA表达也明显降低(P<0.05)。结论:Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨来源的BMSCs的成骨分化能力受到损害,并且即使在正常糖浓度下培养其成骨能力仍无法恢复。     

犬PRF复合BMSCs修复拔牙窝颊侧骨壁缺损的实验研究

目的:评价富血小板纤维蛋白(PRF)构建的组织工程骨,在颊侧骨壁缺损修复中的成骨作用。方法:体外将PRF作用于比格犬的骨髓间充质干细胞(BMSCs),第21天测定钙结节量;4、7、11 d时采用实时定量PCR法检测成骨相关基因。9只成年比格犬拔除上颌左右两侧的侧切牙,构建颊侧骨壁缺损的拔牙位点,并随机分为血凝块组、PRF组和组织工程骨组,在手术后即刻、6周及12周时评价各组的颊侧骨高度和拔牙窝的骨密度。结果:PRF在体外实验中能明显促进BMSCs的增殖,提高成骨分化以及钙化能力(P<0.05)。动物实验中,PRF表现出了促进早期伤口愈合的能力。在颊侧骨壁缺损的修复中,组织工程组在6周时骨高度和骨密度分别为(2.63±0.57)mm、(765.19±59.70)HU,较血凝块组[(5.65±2.91)mm、(599.08±53.88)HU]和PRF组[(4.14±1.16)mm、(644.76±65.39)HU]显著增高(P<0.05)。结论:PRF复合BMSCs构建的组织工程骨可以在早期有效地修复拔牙窝骨壁缺损。     

促红细胞生成素对人牙髓细胞增殖和成骨分化的影响

目的：探讨促红细胞生成素（EPO）对体外培养的人牙髓细胞（hDPCs）增殖和成骨分化的影响。方法：体外培养鉴定人牙髓细胞。使用 EPO 对在成骨诱导培养基中培养的牙髓细胞进行刺激,CCK-8检测 EPO 对牙髓细胞增殖的影响;20 U ／ml EPO 培养 hDPCs 7 d 和14 d,采用碱性磷酸酶活性（ALP）检测和茜素红染色观察 EPO 对牙髓细胞矿化的影响;利用 Real-time PCR 检测加入 EPO 后牙髓细胞成牙本质向分化相关基因的表达情况。结果：EPO 以时间和剂量依赖性方式促进牙髓细胞的增殖;20 U ／ml 的 EPO 后作用,牙髓细胞碱性磷酸酶活性显著提高（P ＜0．05）,钙结节形成明显增多;成牙本质向分化相关基因 DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2的表达明显上调（P ＜0．05）。结论：EPO 能促进人牙髓细胞的增殖和分化。     

富血小板纤维蛋白对牙髓干细胞体外增殖与分化特性的影响

目的:探讨不同浓度富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)对犬牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)体外增殖及成牙本质/成骨分化能力的影响.方法:酶消法分离培养犬DPSCs,经流式细胞术和多向分化鉴定后分别在含自体PRF体积比为1/8、2/8、3/8的3种浓度的培养基中进行培养;采用MTT法检测1、2、3、4、5、6、7d各时间点的细胞增殖活性;实时定量PCR检测培养7、14、21 d时ALP、DSPP、DMPl mRNA的表达水平.结果:成功分离并获得克隆化培养的犬DPSCs,DPSCs具有成骨和成脂分化能力;3种浓度PRF均能促进DPSCs的增殖,1周内促增殖作用有时间依赖性而无PRF浓度依赖性;不同浓度PRF可通过上调成牙本质/成骨早期标志基因ALP、DSPP mRNA及晚期标志基因DMP1mRNA的表达来促进犬DPSCs成牙本质/成骨向分化,该效应既具时间依赖性又具有PRF浓度依赖性.结论:自体PRF可以不同方式同时促进犬DPSCs的增殖及分化.     

应用人恒牙牙髓干细胞与明胶支架构建组织工程骨的研究

目的构建由人恒牙牙髓干细胞和三维明胶支架组成的组织工程骨,并验证其成骨效果。方法从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙牙髓组织中应用酶消化法获得牙髓细胞,单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞。第3代细胞被分别接种到6孔板或三维明胶支架上进行成骨向诱导培养,诱导14天后支架组移植入裸鼠背部皮下。应用ALP染色、Von Kossa染色验证牙髓干细胞的体外成骨能力;应用X线、HE染色和免疫组化验证组织工程骨的体内成骨效果。结果牙髓干细胞体外成骨向诱导后7、14天ALP染色呈阳性;14、21天Von Kossa染色形成矿化结节。在体内组织工程骨成骨明显,X线显示实验侧支架内有团块状高密度阻射影;HE染色显示大量的骨组织形成;免疫组化显示骨结构区域骨桥蛋白、骨涎蛋白和骨钙素阳性表达。结论人恒牙牙髓干细胞和明胶支架构建形成了组织工程骨。     

富血小板纤维蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化的研究

目的 :研究富血小板纤维蛋白(PRF)通过Wnt/β-catenin信号通路对骨髓基质干细胞(BMSCs)分化的影响。方法:分离、培养原代兔BMSCs,取第三代细胞进行干细胞鉴定,收集同一只兔耳缘静脉血离心制备PRF,将PRF与BMSCs置于Transwell小室中共培养并进行成骨分化。实验分组:A组为单纯BMSCs对照组;B组为PRF与BMSCs共培养组;C组为加入DKK1的PRF与BMSCs共培养组;D组为加入Wnt3a的PRF与BMSCs共培养组。茜素红染色观察各组钙结节形成情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测各组ALP活性,定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测成骨成脂相关基因Runx2、OCN、PPARγ2及LPL的m RNA表达,同时检测Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达。结果:流式细术检测结果显示,原代培养的BMSCs符合间充质干细胞鉴定标准。茜素红染色结果显示,B组和D组的钙结节数量明显多于A组和C组,A组和C组之间无明显差异。碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果显示,B组与D组的ALP活性较A组和C组明显增加(P<0.05),且两组之间差异无明显统计学意义。q RTPCR结果显示B组与D组中的成骨分化标志基因Runx2、OCN的m RNA表达,较A组和C组显著增加(P<0.05),而成脂分化标志基因PPARγ2、LPL的m RNA表达显著降低(P<0.05)。此外,B组和D组中Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达较A组和C组显著增加(P<0.05)。结论:PRF通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化而抑制其成脂分化。     

1,25（OH）2维生素D3矿化液对人牙髓干细胞成骨方向诱导作用的研究

目的研究维生素D3矿化液对人牙髓干细胞的成骨方向诱导是否有促进作用。方法从恒牙牙髓中分离培养成纤维样细胞并测试其间充质干细胞的特异性标记物Stro-1阳性率,用一定浓度的1,25（OH）2维生素D3、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的矿化液诱导牙髓干细胞,通过倒置相差显微镜、碱性磷酸酶染色、Vonkossa染色及骨钙素、Ⅰ型胶原基因表达观察和检测矿化液诱导后细胞形态变化及矿化基质分泌情况,以未诱导组为对照。结果维生素D3矿化液连续诱导21d后,诱导组的细胞碱性磷酸酶染色阳性、Ⅰ型胶原和骨钙素的基因表达阳性,并可见明显钙结节形成。结论维生素D3矿化液可以诱导人牙髓干细胞向成骨样细胞分化并促进其产生矿化基质。     

神经生长因子对骨髓基质细胞成骨活性的影响

目的 探讨神经生长因子（nerve growth factor,NGF）对骨髓基质细胞成骨活性的影响.方法 原代培养SD大鼠四肢骨骨髓源性骨髓基质细胞.通过检测细胞增殖、定量检测碱性磷酸酶的表达及茜素红矿化结节染色,观察NGF对骨髓基质细胞增殖及成骨活性的影响.结果 实验组与对照组细胞增殖无统计学差异,NGF对骨髓基质细胞增殖无促进作用.第3天时,实验组细胞分化及碱性磷酸酶的表达高于对照组（P＜0.05）.钙结节茜素红染色及钙结节量实验组大于对照组.结论 NGF可直接促进骨髓基质细胞的成骨向转化及矿化作用,对细胞增殖无促进作用.     

人乳牙牙髓干细胞的体外培养观察

目的:体外分离、培养人乳牙牙髓干细胞。方法:采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养,以获得人乳牙牙髓干细胞。有限稀释法分离纯化,测定细胞克隆形成率,细胞计数法测生长曲线,细胞爬片行HE染色、碱性磷酸酶染色、抗波形蛋白(vimentin)免疫组化染色。结果:通过有限稀释法获得了克隆形成率为11～24个/103,细胞群体倍增时间为39.84h,HE染色细胞形态为梭形、细胞体小、胞核大的干细胞。且碱性磷酸酶染色阳性,抗波形蛋白(vimentin)免疫组化染色阳性。结论:人乳牙牙髓中可分离培养出牙髓干细胞。     

改良富血小板血浆促进乳牙牙髓干细胞成骨分化作用研究

目的：体外研究改良富血小板血浆（modified platelet-rich plasma,mPRP）促进人乳牙牙髓干细胞成骨分化的作用。方法：以α-MEM作为基础培养基,分别加入1％、2％、5％、10％4种不同浓度 mPRP 或者10％胎牛血清（对照）,对第4代SHED 连续培养并诱导矿化,碱性磷酸酶试剂盒检测 ALP 活性的变化,qRT-PCR 方法检测细胞内 RUNX2和骨钙素 mRNA 含量的改变。结果：不同浓度的 mPRP 均可以促进乳牙牙髓干细胞的 ALP 活性,且浓度为2％时 A 值最高;qRT-PCR 检测显示2％ mPRP 可以上调乳牙牙髓干细胞内 RUNX2及骨钙素 mRNA 的含量。结论：一定浓度的 mPRP 对乳牙牙髓干细胞的成骨分化具有一定的促进作用。     

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响.方法 成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化.逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究.碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性.茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力.实时定量RT-PCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达.结果 成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达.过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论 组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

黄精多糖对乳牙牙髓干细胞增殖及成骨向分化的影响

目的:初步探索不同浓度黄精多糖(PSP)对乳牙牙髓干细胞(SHEDs)增殖及成骨分化能力的影响.方法:分离、培养SHEDs,通过流式细胞术及茜素红染色分别对细胞表面标志物和成骨分化潜能进行鉴定.采用不同浓度PSP处理SHEDs后,CCK-8法检测SHEDs的增殖情况,钙钴法染色和碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测其ALP活...     

BMP2/Smads通路介导富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞成骨分化的作用研究

目的:基于骨形态发生蛋白2(BMP2)/母亲信号蛋白同源物通路(Smads)通路,分析富血小板纤维蛋白(PRF)对人牙髓干细胞成骨分化的作用.方法:分离纯化牙髓干细胞,流式细胞仪检测并鉴定牙髓干细胞表面抗原标记物,随机分为对照组、PRF组、BMP激活剂组和BMP抑制剂组(简称激活剂组和抑制剂组),检测培养7d、14d后的碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-qPCR检测牙髓干细胞胶原蛋白Ⅰ(COL-Ⅰ)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN) mRNA相对表达水平;茜素红染色观察矿化结节形成;Western-Blot检测牙髓干细胞BMP2、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相对表达水平.结果 ..STRO-1、CD29、CD90表达阳性,符合牙髓干细胞的表型.各组ALP活性随时间延长而升高(P＜0.05),从对照组到抑制剂组、PRF组、激活剂组,牙髓干细胞ALP活性及COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA相对表达水平依次升高,红色矿化结节数目、A值依次增加(P＜0.05).从抑制剂组到对照组、PRF组、激活剂组,牙髓干细胞BMP2、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相对表达水平依次升高(P＜0.05).结论 ..PRF可能通过激活BMP2/Smads信号通路促进人牙髓干细胞成骨分化.