兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养、鉴定及向成骨细胞分化诱导

目的:探讨体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,并观察其向成骨细胞分化的潜能。方法:采用贴壁分离法分离培养兔BMSCs,通过细胞形态学观察和细胞表面抗原检测对细胞进行鉴定,并向成骨细胞分化诱导培养,通过钙钻法检测碱性磷酸酶表达,茜素红染色观察钙结节形成能力。结果:分离培养3d,可见贴壁细胞呈三角形、成纤维形或多角形外观,培养10～12d细胞长满瓶底,传代后细胞增殖明显加快;使用条件培养基传代培养2周,细胞呈集落生长后开始形成钙结节,茜素红染色阳性。结论:全骨髓贴壁法是一种简单实用的分离培养方法,可获得纯度较高的兔BMSCs,经过诱导后可向成骨细胞分化。     

富血小板纤维蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化的研究

目的 :研究富血小板纤维蛋白(PRF)通过Wnt/β-catenin信号通路对骨髓基质干细胞(BMSCs)分化的影响。方法:分离、培养原代兔BMSCs,取第三代细胞进行干细胞鉴定,收集同一只兔耳缘静脉血离心制备PRF,将PRF与BMSCs置于Transwell小室中共培养并进行成骨分化。实验分组:A组为单纯BMSCs对照组;B组为PRF与BMSCs共培养组;C组为加入DKK1的PRF与BMSCs共培养组;D组为加入Wnt3a的PRF与BMSCs共培养组。茜素红染色观察各组钙结节形成情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测各组ALP活性,定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测成骨成脂相关基因Runx2、OCN、PPARγ2及LPL的m RNA表达,同时检测Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达。结果:流式细术检测结果显示,原代培养的BMSCs符合间充质干细胞鉴定标准。茜素红染色结果显示,B组和D组的钙结节数量明显多于A组和C组,A组和C组之间无明显差异。碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果显示,B组与D组的ALP活性较A组和C组明显增加(P<0.05),且两组之间差异无明显统计学意义。q RTPCR结果显示B组与D组中的成骨分化标志基因Runx2、OCN的m RNA表达,较A组和C组显著增加(P<0.05),而成脂分化标志基因PPARγ2、LPL的m RNA表达显著降低(P<0.05)。此外,B组和D组中Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达较A组和C组显著增加(P<0.05)。结论:PRF通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化而抑制其成脂分化。     

rhBMP-2/rhTGF-β_1联合应用对兔成骨样细胞增殖及分化的影响

目的: 探讨转化生长因子β(transforming growth factors beta,TGF-β)、与骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)联合应用对兔成骨样细胞增殖及分化的影响。方法: 体外培养兔成骨样细胞,采用四唑盐比色法和碱性磷酸酶试剂盒检测两种生长因子对兔成骨样细胞增殖及分化的影响。结果: 100ng/ml rhBMP-2促进兔成骨样细胞的分化,对增殖无明显作用。不同浓度的rhTGF-β1均可促进成骨样细胞的增殖,对分化无明显作用。二者在同时应用时,其作用部分或完全抵消。结论:在本实验条件下,rhBMP-2、rhTGF-β1联合应用时无协同效应。     

TGF-β1促进rhBMP-2对成骨前体细胞增殖分化的观察

目的:观察TGF-β1对rhBMP-2促进成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖和分化能力的影响。方法:MC3T3-E1加入不同浓度的rhBMP-2和TGF-β1+rhBMP-2进行组织学观察,用MTT法检测细胞增殖,通过ELISA检测细胞ALP含量。结果:随着加入rhBMP-2浓度的增加,MC3T3-E1细胞的增殖逐渐增加,TGF-β1+rhBMP-2组增加更为显著(P<0.05)。TGF-β1+rhBMP-2组和rhBMP-2组在rhBMP-2浓度为25、50、100μg/L间存在统计学意义(P<0.05)。随着rhBMP-2浓度的增加,ALP值逐渐增加,TGF-β1+rhBMP-2组ALP值升高更为显著(P<0.01),TGF-β1+rhBMP-2组和rhBMP-2组在rhBMP-2浓度为25、50μg/L间有统计学意义(P<0.05)。结论:TGF-β1可促进rhBMP-2对MC3T3-E1的增殖和成骨分化作用。     

低氧诱导因子-1α对兔骨髓间充质干细胞成骨作用的实验研究

目的:探索一定浓度的低氧诱导因子-1α对兔骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响。方法:全血培养法培养兔BMSCs,根据不同浓度HIF-1α分为四组:1基础培养2基础培养+50ng/ml 3基础培养+100ng/ml 4基础培养+200ng/ml,三天更换一次培养基,第1天至第7天,用MTT法分析细胞增殖情况,绘制细胞生长曲线。在第7天和第14天进行碱性磷酸酶(ALP)染色及半定量检测。结果:原代兔BMSCs培养10天可见细胞克隆,放射状生长,传代后细胞生长旺盛,长梭形,铺满皿底。MTT检测显示基础培养+100ng/ml组相对其它各组细胞增殖旺盛,第14天时,碱性磷酸酶染色及半定量检测显示基础培养+100ng/ml组促进其表达。讨论:骨替代材料由于没有骨诱导性,成骨能力受到限制,细胞因子可以刺激和诱导细胞增殖、分化,近年研究发现HIF-1α可以促进VEGF的表达,进而影响BMSCs成骨分化,ALP是细胞成骨分化的标志,100ng/ml的HIF-1α组ALP活性增强。结论:100ng/ml的HIF-1α可以促进BMSCs体外分化成骨,为骨缺损修复提供了理论依据。     

糖基化终末产物对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及相关基因P27、cyclinD1 的影响

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖能力以及相关基因P27、cyclinD1的影响。方法:全骨髓法培养小鼠骨髓间充质干细胞;成骨、成脂诱导骨髓间充质细胞,对其进行干细胞鉴定;将培养出的骨髓间充质干细胞与不同浓度的AGEs 共培养,MTT检测不同浓度下骨髓间充质干细胞增殖的改变;实时定量聚合酶链反应(Real time PCR)检测AGEs刺激后P27、cyclin D1表达的改变。结果:小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后茜素红染色出现钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色出现脂滴;MTT显示不同浓度的AGEs(10、50、100、200 mg/L)均能抑制BMSCs的增殖差异有统计学意义(P<0.05),且随着浓度的增加抑制越明显;Real time PCR结果显示:AGEs(50 mg/L)刺激3 d后P27 mRNA的表达水平较对照组升高,cyclinD1 mRNA的表达水平较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:AGEs能抑制小鼠骨髓间充质干细胞的增殖并能改变P27 、cyclinD1 mRNA的表达。     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞成骨向分化的作用

目的:观察不同浓度改良富血小板血浆(PRP)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨向分化的作用效果。方法:使用健康志愿者骨髓培养的3~4代BMSCs。将由该志愿者静脉采集的静脉血制备成改良PRP作用于BMSCs,使用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定矿化诱导7 d后BMSCs的ALP活性,通过茜素红染色观察矿化诱导21 d后BMSCs的矿化结节形成情况,并通过实时荧光定量PCR检测矿化诱导7 d后BMSCs中成骨相关基因Runx2表达的变化。结果:5%改良PRP明显提高了BMSCs的ALP活性,促进了其矿化结节的形成,并上调了BMSCs中Runx2基因的表达。结论:液氮冻融激活的改良PRP促进BMSCs成骨向分化具有浓度特异性。     

氯化锂对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:探讨Wnt/β-catenin通路激活剂—氯化锂(lithium chloride,LiCl)对体外培养的人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:低密度多克隆法分离培养人PDLSCs,分别与不同浓度的LiCl(5、10、20、40 mmol/L)共同培养。分别检测各组细胞的增殖情况、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、钙化结节形成量以及Col-1、OCN、Runx-2等成骨相关基因的表达水平。结果:LiCl无促细胞增殖作用,且高浓度LiCl能明显抑制细胞的增殖。浓度为5 mmol/L的LiCl可促进hP-DLSCs成骨性分化,表现为提高细胞的ALP活性、促进钙化结节的形成、上调Col-1、OCN、Runx-2的mRNA表达水平,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。而高浓度(≥10 mmol/L)LiCl则对成骨分化具有抑制作用。结论:终浓度为5 mmol/L的LiCl可明显促进hPDLSCs的成骨分化。     

RT-PCR检测釉基质蛋白对大鼠骨髓基质细胞成骨相关基因表达影响的研究

目的研究釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMPs)对体外培养大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BM-SCs)成骨相关基因表达的影响。方法采用乙酸法从猪恒牙胚中提取釉基质蛋白,取3周龄雄性SD大鼠胫骨和股骨骨髓体外培养,取生长良好的第3代细胞加入不同浓度的EMPs(0、25、50、100、200 mg/L)进行培养,MTT法检测BMSCs的增殖,用RT-PCR测定成骨相关基因骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP),骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COL-Ⅰ)的表达。结果实验组的细胞增殖大于对照组(P<0.05),并且EMPs的浓度在100 mg/L时增殖作用最强;实验组骨相关基因(BSP、COL-Ⅰ)mRNA的表达高于对照组,并且具有浓度依赖性,但是实验组与对照组OPN mRNA的表达没有区别。结论 EMPs通过调节成骨相关基因的表达而促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化。     

自体来源富血小板血浆对大鼠牙髓细胞增殖作用的研究

目的:初步探讨富血小板血浆及之中生长因子对大鼠牙髓细胞增殖的作用.方法:采用Landesberg 法制备PRP,ELISA测定PRP中两种主要生长因子:转化生长因子(TGF - β1)和血小板源性生长因子(PDGF -AB)的浓度;CCK-8法观察5％、10％PRP在48h时对牙髓细胞的增殖作用;在5％PRP中加入TGF-β1抗体和PDGF-AB抗体分别拮抗TGF-β1和PDGF-AB的作用并观察对细胞增殖的影响.结果:所制备的PRP中血小板含量为1790.58±388.08×109个/L,ELISA的方法测定PRP中TGF-β1及PDGF-AB的浓度分别为3.080 ng/ml和10.706 ng/ml.CCK-8法测定5％和10％PRP对牙髓细胞均有增殖作用(P＜0.05,与对照组相比);屏蔽生长因子可以明显改变5％PRP对大鼠牙髓细胞的增殖作用(P＜0.05);拮抗PDGF-AB组比拮抗TGF - β1组降低增殖作用明显(P＜0.05).结论:本实验制备的PRP含有高浓度的TGF - β1及PDGF-AB,不同浓度的PRP均能有效促进牙髓细胞增殖;屏蔽PDGF-AB明显降低5％PRP对大鼠牙髓细胞的增殖作用.     

不同生长因子对大鼠牙乳头细胞生物学特性的影响

目的：探讨bFGF＋IGF1、TGFβ1＋BMP4、bFGF＋IGF1＋TGFβ1＋BMP4对体外培养的大鼠牙乳头细胞（rDPCs）增殖、分化的影响并筛选出最佳的组合因子。方法：分离培养、鉴定rDPCs,应用四唑盐（MTT）比色法和酶动力学法分别检测不同组合因子刺激后的第1/4/7/10/14天rDPCs的增殖活性、细胞内总蛋白合成量、碱性磷酸酶（ALP）的分泌水平,应用罗式诊断分析法和放射免疫分析法检测细胞上清液内钙、磷浓度和骨钙素含量。结果：组①bFGF（10ng/mL）＋IGF1（100ng/mL）在P4d能最显著地促进rDPCs的增殖、分化与矿化,并在P10d能显著地升高细胞外液的钙离子、磷离子浓度;组②TGFβ1（5ng/mL）＋BMP4（10ng/mL）在P4d能最大程度地促进rDPCs的分化、矿化并显著促进细胞外液骨钙素的分泌合成,且在P7d能最显著地促进rDPCs内总蛋白的合成（P〈0.05）。结论：bFGF＋IGF1、TGFβ1＋BMP4两组因子均可促进rDPCs的增殖活性和分化潜能,为体外牙齿再生提供实验依据。     

不同骨内植入材料对巨噬细胞活性的影响

目的：研究不同骨植入材料对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7活性的影响。方法：在钛（Ti）、医用不锈钢（SS）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材料表面及细胞培养板（PSC）上培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,在不同时间用cck-8法测定细胞增殖情况,实时荧光定量PCR法测定单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA表达水平。结果：小鼠巨噬细胞系RAW264.7在各种材料上均能良好生长,无明显细胞毒性。Ti和PSC组细胞增殖速率明显高于SS和PMMA组。各组材料表面巨噬细胞MCP-1mRNA表达随时间减少,PMMA组表达较高。除钛组外,其余各组巨噬细胞TGF-β1mRNA表达水平随时间增加,12h和24h时钛组表达较高。TNF-αmRNA的表达水平随时间增加,Ti组和PSC组显著高于SS和PMMA组。结论：骨内植入材料表面的巨噬细胞增殖活性和基因表达受不同材料和接触时间的影响。     

氟对体外培养人牙胚TGF-β1表达影响的实验研究

目的研究氟对牙胚发育早期TGF-β1表达的影响。方法应用牙胚体外培养模型,观察低剂量(20mg/L)和中剂量(50mg/L)的氟作用于分泌前期牙胚后,TGF-β1表达情况的变化。采用图像分析仪对免疫组化染色结果进行灰度分析,并对灰度值进行统计学检验。结果在分泌前期TGF-β1的表达主要在造釉器,在20mg/L、50mg/L的氟条件下从培养第4天开始TGF-β1的表达显著降低。结论在牙胚发育早期,TGF-β1主要在上皮表达,TGF-β1可能通过旁分泌和自分泌来调节内釉上皮细胞、牙乳头细胞的分化及基质的合成与分泌,低剂量和中剂量的氟显著抑制TGF-β1的表达,提示氟可能通过抑制TGF-β1的表达而抑制了内釉上皮细胞和牙乳头细胞的分化及随后的基质合成与分泌。     

TGF-β3对成骨细胞的增殖和成骨能力的影响及其机制初探

目的 观察不同浓度的转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3)对成骨细胞增殖和成骨能力的影响及其机制。方法 分离获得新西兰幼兔颅盖骨成骨细胞,纯化并鉴定后用不同浓度的TGF-β3(0.1、1、10、100 μg/L)诱导成骨细胞,CCK-8法检测增殖活性,定量检测法测定碱性磷酸酶(ALP)含量;免疫细胞化学染色观察Ⅰ型胶原Α1(COL-1A1)、Runt相关骨形成蛋白-2(Runx-2)和骨钙素(OCN)蛋白表达;qPCR法检测ALP、骨桥蛋白(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、成骨细胞特异性转录因子(Osx)和Smad4基因的表达;Western blotting法检测Smad2/3蛋白的表达情况。结果 成功分离获得并鉴定成骨细胞;10、100 μg/L的TGF-β3能明显促进成骨细胞增殖(P＜0.05);10 μg/L TGF-β3组ALP含量始终高于对照组(P＜0.05);免疫细胞化学染色结果显示10、100 μg/L的TGF-β3组各蛋白表达均强于对照组;qPCR结果示10、100 μg/L的TGF-β3能促进ALP、OPN、BSP、Osx和Smad4基因的表达(P＜0.05);Western blotting结果示1~100 μg/L的TGF-β3组Smad2/3蛋白表达高于对照组(P＜0.05)。结论 10~100 μg/L的TGF-β3可促进成骨细胞的增殖和成骨能力,浓度为10 μg/L时效果最显著,其诱导成骨作用通过Smad依赖通路实现。     

Rho��ø���Ƽ�Y-27632�������������԰�ϸ��������ֳӰ����о�

目的观察Rho激酶抑制剂Y-27632对涎腺腺样囊性癌细胞肺高转移细胞株(ACC-M)生长增殖的影响,探讨Y-27632对涎腺腺样囊性癌可能疗效,以期为治疗涎腺腺样囊性癌提供新思路。方法 2007年10月至2008年2月在浙江大学医学实验室,形态学观察Rho激酶抑制剂Y-27632作用下ACC-M细胞的生长变化,并用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同药物浓度下ACC-M的增殖情况。结果抑制剂Y-27632作用下ACC-M细胞变成梭形,细胞长轴增加,细胞间连接消失,细胞膜不规则,皱缩不整齐,边界有丝状突起,有倾向凋亡的趋势;MTT比色法检测结果发现,不同浓度Y-27632作用下检测到的ACC-M细胞光密度值均比对照组小,且当药物浓度为10μmol/L时抑制作用有统计学意义(P<0.01)。结论 Rho激酶抑制剂Y-27632在体外实验中对涎腺腺样囊性癌细胞的生长增殖起一定的抑制作用。     

HGF在人牙周膜成纤维细胞中的表达

目的：观察HGF在人牙周膜成纤维细胞中的表达及探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）、白细胞介素-1β（IL-1β）与HGF之间的关系。方法：分别采用IL-1β梯度浓度、最佳干预浓度和TGF-β1梯度浓度干预第5代人牙周膜成纤维细胞,并运用酶联免疫技术检测人牙周膜成纤维细胞的上清液中HGF的表达。结果：经IL-1β单独作用,人牙周膜成纤维细胞的上清液中HGF的含量较空白对照组高,并优选出IL-1β的最佳干预浓度为10 ng/mL。当一定浓度的TGF-β1和10 ng/mL的IL-1β联合干预人牙周膜成纤维细胞,该细胞上清液中HGF的含量较单独IL-1β作用组低。结论：TGF-β1能够抑制IL-1β诱导的人牙周膜成纤维细胞分泌HGF。     

TGF-β1调控小鼠成釉细胞Amelotin基因表达的研究

目的：探讨TGF-β1对Amelotin基因表达的影响及作用机制。方法：通过实时定量RT-PCR法观察TGF-β1对釉成熟蛋白（Amelotin）基因表达的影响;利用TGFBR1小RNA干扰（siRNA）技术阻断TGF-β受体I（TGFBR1）表达,或在成釉细胞中过表达活化型TGF-β受体I（T204D）,观察Amelotin基因表达的改变;利用双荧光素酶基因报告系统观察TGF-β1和T204D对成釉细胞Amelotin启动子转录活性的调控作用。结果：TGF-β1刺激成釉细胞后,Amelotin基因表达显著增强;利用小RNA干扰技术使TGFBR1基因沉默,实时定量RT-PCR显示TGF-β1调控Amelotin基因表达的作用减弱,而pCDNA3.1-T204D转染成釉细胞促进了Amelotin基因表达。将pGL3-Amelotin启动子转染成釉细胞,并用TGF-β1刺激成釉细胞,Amelotin启动子的转录活性明显增强。TGFBR1小RNA干扰阻断了TGF-β1诱导的Amelotin启动子转录活性,而将pGL3-Amelotin与T204D共转染成釉细胞后,促进了Amelotin启动子的转录活性。结论：在牙釉质发育过程中,TGF-β1和活化型TGFBR1信号通路调控成釉细胞Amelotin基因表达。     

锌指E盒结合同源框2在人牙髓组织和细胞的表达

目的：检测锌指E盒结合同源框2（ZEB2）在人牙髓组织和细胞中的表达,并初步探讨其意义。方法：制作牙髓组织石蜡切片,荧光原位杂交技术（FISH）检测 ZEB2的表达;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测正常及TGF-β1刺激下人牙髓细胞（hDPCs）中ZEB2 mRNA表达水平;制作hDPCs细胞爬片, FISH检测ZEB2的表达。结果： FISH结果显示ZEB2在牙髓组织中主要表达于成牙本质细胞层,在牙髓细胞呈弱阳性表达。 RT-qPCR结果显示TGF-β1的作用促进ZEB2的表达,且具有浓度和时间依赖性,5ng/ml TGF-β1刺激ZEB2表达达最大（P〈0.05）;5ng/ml TGF-β1刺激后, ZEB2 mRNA在24h内表达逐渐上调,24h达峰值（P〈0.05）。 FISH结果示ZEB2在正常hDPCs胞质和胞核均呈弱阳性表达, TGF-β1刺激24h后ZEB2表达增强,胞核表达明显。结论： ZEB2在牙髓组织中主要表达于成牙本质细胞层,正常hDPCs中弱阳性表达,而TGF-β1可促进hDPCs中ZEB2表达,提示ZEB2可能通过参与TGF-β1信号通路调控hDPCs的成牙本质向分化过程。