再生障碍性贫血患者外周血CD4~＋CD25~＋调节性T细胞及Foxp3的变化及临床意义

目的:探讨再生障碍性贫血(AA)患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞(Tress)及Foxp3的表达及临床意义.方法:25例AA病人,其中含非重型再障(nSAA)18例、重型再障(SAA)7例,采用四色流式细胞检测技术分析从患者外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+T细胞、CD4+CD25+/CD4+、CD4+CD25high/CD4+T细胞百分比及绝对计数,并进一步分析AA患者PBMC的CD4++CD25+、CD4+CD25low及CD4+CD25highT细胞中Foxp3+T细胞的百分比,同时利用RT-PCR方法检测PBMC中Foxp3mRNA表达水平,并与29例正常对照组的上述指标进行比较.结果:与正常对照组相比,SAA患者及nSAA患者PBMC中CDM+T细胞、CD4+CD25+/CD4+、CD4+CD25high/CD4+百分比及绝对计数减低(P<0.05),并且SAA组明显低于nSAA组(P<0.001);从患者CD+CD25+、CD4+CD25low及CD4+CD25highT细胞中Foxp3的表达较正常对照组减低(P<0.05);AA患者PBMC中Foxp3 mRNA表达水平与正常对照组没有明显差别(P>0.05).结论:CD4+CD25+调节性T细胞减低可能与从的发病有关,SAA的Treg表达低于nSAA,为其作为从病情变化的判断指标提供进一步的依据.     

银屑病患者骨髓CD34+细胞RUNX1及其靶基因SLC9A3R1的研究

目的:研究转录调节因子RUNX1及其靶基因SLC9A3R1在银屑病患者骨髓CD34+细胞中的表达及SLC9A3R1与NAT9之间RUNX1的连接位点,以揭示银屑病患者造血干细胞的活性,为深入阐明银屑病患者免疫异常的根源及造血细胞在其中的作用提供理论依据.方法:采用免疫磁珠法分离CD34+细胞,RT-PCR法分别检测RUNX1和SLC9A3R1的mRNA表达,直接测序法检测PCR产物中SLC9A3R1与NAT9之间RUNX1连接位点DNA序列.结果:银屑病患者骨髓CD34+细胞RUNX1表达阳性率低于正常对照组(P＜0.05);银屑病患者骨髓CD34+细胞SLC9A3R1表达水平明显高于正常对照组(P＜0.05),且与PASI评分正相关(r=0.48,P＜0.05);在SLC9A3R1与NAT9之间未发现RUNX1连接位点的突变.结论:决定银屑病患者骨髓CD34+细胞分化的关键基因RUNX1存在异常;银屑病患者骨髓RUNX1和SLC9A3R1可能通过对骨髓造血微环镜和造血干细胞的异常调节参与银屑病的发病.     

P53 shRNA对肝癌细胞增殖的影响

 目的 观察用RNA干扰（RNAi）下调SMMC-7721人肝癌细胞系P53表达后对细胞增殖及P21蛋白表达的影响。方法 设计合成P53基因的短发夹RNA（shRNA）,并构建pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA重组质粒。重组质粒转染SMMC-7721细胞,经G418抗性筛选获得阳性克隆。克隆形成实验观察细胞的增殖,RT-PCR法及Western blot法分别检测P53、P21的mRNA及蛋白表达。BALB/c裸鼠皮下注射SMMC-7721细胞,建立移植瘤模型,瘤部位多点注射pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA,观察瘤体积变化和瘤重。结果 P1、P2、P3三条P53 shRNA均可明显降低P53 mRNA水平（P<0.05, P<0.05, P<0.01）;干扰P53表达明显升高SMMC-7721细胞克隆形成率（P<0.05）,P21 mRNA和蛋白的表达均随着P53的沉默而显著降低（P<0.05）。P53 shRNA明显增加裸鼠移植瘤的体积和重量（P<0.05）。结论 shRNA干扰P53基因可抑制P53和P21蛋白表达,使癌细胞恶性增殖。     

免疫相关转录因子GATA-3基因在再障和正常骨髓基质细胞中的表达

目的：了解转录因子GATA-3基因在再生障碍性贫血（AA）和正常骨髓基质细胞（BMSC）中表达的情况，探讨AA发病的免疫机制。 方法： 采集9例AA患者的骨髓标本及34例正常骨髓标本，分离骨髓单个核细胞后体外扩增培养骨髓基质细胞，运用RT-PCR-ELISA方法检测GATA-3基因的表达程度，并对其相对表达水平进行半定量分析。 结果： GATA-3基因在正常和再障的骨髓基质细胞中均有一定的表达。再障的骨髓基质细胞中GATA-3的表达水平较正常高。 结论： 转录因子GATA-3基因可在正常和再障骨髓基质细胞中表达，并可能影响机体免疫功能及骨髓微环境的造血调控，参与AA发病的免疫机制。     

反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞P16、P21表达的增强作用

目的 观察反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞周期的影响,检测P16和P21的表达,探讨端粒酶与细胞期调控间的关系及反义端粒酶RNA在肝癌基因治疗中的意义。方法 经脂质体介导,将反义端粒RNA真核表达载体pBBS212－hTR导入SMMC7721细胞中。细胞克隆转移扩大培养后,采用流式细胞仪、TRAP－PCR－ELISA及免疫组化技术,结合图像分析,在检测SMMC7721／pBBS212－hTR细胞端粒酶活性的同时,检测P16和P21的表达。结果 与对照组相比较,反义端粒酶RNA在抑制SMMC7721／pBBS212－hTR细胞端粒酶活性的同时,检测P16和P21的表达。结果 与对照组相比较,反义端粒酶RNA在抑制SMMC7721细胞端粒酶活性的同时,P16和P21蛋白的表达水平显著增高。结论 转染反义端粒酶RNA在封闭细胞端粒活性表达的同时,伴发P21与P16表达水平的升高。本实验研究为探讨肝癌发病机制及治疗提供了一定的依据。     

缺氧诱导因子-1α和PTEN、P53在急性髓性白血病骨髓基质细胞中的表达及意义

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和PTEN、P53在急性髓性白血病骨髓基质细胞中的表达及意义。方法分离培养28例急性髓性白血病患者和22例正常对照样本骨髓基质细胞,RT-PCR检测HIF-1αmRNA的表达,免疫组织化学技术检测基质细胞HIF-1α和PTEN、P53蛋白表达和分布。结果急性髓细胞白血病(AML)组HIF-1αmRNA和蛋白表达率显著高于对照组(P<0.05),AML组P53蛋白表达率显著高于对照组(P<0.05),而PTEN表达率显著低于对照组(P<0.01)。HIF-1α在骨髓基质细胞的阳性表达与P53的高表达和PTEN的低表达相关联(P<0.05)。结论HIF-1α可能是白血病异常骨髓造血微环境形成过程中的重要调控因子,HIF-1α的表达可能与PTEN和P53基因表达调控相关。     

再生障碍性贫血骨髓促血管新生因子与抑制因子的研究

目的： 通过研究促血管新生因子血管内皮细胞生长因子（VEGF）、酸性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及血管新生抑制因子γ干扰素（IFN-γ）、凝血酶敏感蛋白（TSP）在再生障碍性贫血(AA)患者骨髓中的含量，以探讨血管新生在AA发病机制中的作用。方法：初治重型AA(SAA组) 8例、非重型AA(NSAA组)10例，对照组7例，动态观察5例AA患者，将治疗前后分为初治组和有效组。ELISA法检测各组患者骨髓VEGF、bFGF、IFN-γ含量，流式细胞仪检测TSP。结果：SAA组和NSAA组与对照组比较，VEGF降低、IFN-γ、TSP均升高（P<0.05），其中SAA组VEGF、IFN-γ、TSP(MnX)差异更明显（P<0.01）。SAA组与NSAA组之间各数据没有显著差异；有效组VEGF高于、IFN-γ、TSP低于初治组（P<0.05），与对照组比较，只有IFN-γ有显著差异。结论：促血管新生因子水平低，抑制血管新生因子水平升高可能是AA微血管密度减低、造血微环境支持功能缺陷发生原因之一，血管新生调节因子水平与骨髓造血功能可能有密切关系。     

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响。方法:将LMP1基因真核表达质粒转染至鼻咽癌CNE1细胞,脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞,MTT法检测细胞增殖能力,免疫组化法检测LMP1和P53蛋白表达,原位杂交技术检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达。 结果:对照组,转染并表达LMP1基因的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞。端粒酶反义核酸作用组,LMP1基因转染细胞的LMP1蛋白表达水平显著低于对照组(P＜0.01);LMP1基因转染细胞与未转染细胞和转染空载质粒的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著低于对照组(P＜0.01),但LMP1基因转染细胞的增殖能力和P53蛋白表达水平仍显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞(P＜0.01)。 结论:EB病毒LMP1可促进鼻咽癌细胞P53蛋白的表达。     

环孢素A治疗再障和骨髓增生异常综合征T淋巴细胞异常激活的变化

研究再生障碍性贫血(AA)用环孢素A(CsA)治疗前后和骨髓增生异常综合征(MDS)患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞培养前后早期激活标志CD69的表达及其意义。将外周血在PHA20μg/ml条件下进行全血细胞培养,于0h和4h分别用双色免疫荧光标记流式细胞仪对CD4+、CD8+T淋巴细胞CD69的表达进行分析。发现PHA刺激前初治SAA和MDS-RA+MDS-RAS患者CD4+、CD8+细胞CD69的表达率增高,CAA与RAEB+RAEB-T患者CD8+细胞CD69的表达率增高;PHA刺激后AA与MDS患者CD4+、CD8+细胞表达CD69明显增强,AA患者CD4+细胞CD69的表达率高于CD8+细胞。CsA治疗后SAA患者PHA刺激前CD4+、CD8+细胞CD69的表达率较治疗前明显减低,CAA患者CD8+细胞CD69的表达率较治疗前明显减低。治疗后AA患者PHA刺激后CD4+、CD8+细胞CD69的表达率较治疗前明显减低。CsA治疗有效的AA患者治疗前PHA刺激前后CD4+、CD8+细胞CD69的表达率明显增高,治疗后明显减低。初治AA患者PHA刺激前后CD4+细胞CD69的表达率均明显高于MDS患者。说明T细胞早期活化及其活化潜能增强,以及产生针对自身造血干/祖细胞的细胞毒效应在AA和MDS发病中起重要作用,CsA能抑制AA患者T细胞的早期激活。     

缺氧诱导因子-1α和PTEN、P53在急性髓性自血病骨髓基质细胞中的表达及意义

目的 探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和PTEN、P53在急性髓性白血病骨髓基质细胞中的表达及意义.方法 分离培养28例急性髓性白血病患者和22例正常对照样本骨髓基质细胞,RT-PCR检测HIF1αmRNA的表达,免疫组织化学技术检测基质细胞HIF-1α和PTEN、P53蛋白表达和分布.结果 急性髓细胞白血病(AML)组HIF-1αmRNA和蛋白表达率显著高于对照组(P＜0.05),AML组P53蛋白表达率显著高于对照组(P＜0.05),而PTEN表达率显著低于对照组(P＜0.01).HIF-1α在骨髓基质细胞的阳性表达与P53的高表达和PTEN的低表达相关联(P＜0.05).结论 HIF-1α可能是白血病异常骨髓造血微环境形成过程中的重要调控因子,HIF-1α的表达可能与PTEN和P53基因表达调控相关.     

干细胞白血病基因在再障和正常骨髓基质细胞中的表达

目的：了解白血病干细胞(SCL)基因在再生障碍性贫血(AA)骨髓基质细胞 (BMSC)及骨髓细胞中的表达情况。方法：收集9例AA和33例正常骨髓标本。体外长期培养扩增BMSC，并收集悬浮细胞。运用反转录聚合酶链反应酶联免疫吸附测定(RT-PCR-ELISA)检测SCL基因在BMSC和悬浮细胞中的表达，分析表达率，并以管家基因β2微球蛋白(β2M)为内参照进行半定量分析。结果：SCL基因在AA的BMSC中的表达率(22.2％)低于正常对照组(69.7％，P<0.05)。SCL基因在AA的悬浮细胞中的表达率(87.5％)高于其对应的BMSC(P<0.05)。PCR-ELISA半定量分析结果显示，SCL基因在正常对照组悬浮细胞中的表达水平高于其对应的BMSC(P<0.05)。结论：SCL基因在AA的BMSC中的相对低表达状态提示可能与AA造血调控异常有关。     

Evaluation of angiogenesis and vascular endothelial growth factor expression in the bone marrow of patients with aplastic anemia

It is generally appreciated that bone marrow function and growth of myelopoietic cells depends on an intact microvasculature. A pivotal regulator of angiogenesis is vascular endothelial growth factor (VEGF). Here, we describe analysis of VEGF expression and microvessel density in the bone marrow of patients with aplastic anemia by immunohistochemistry. Bone marrow was examined at diagnosis and at the time of hematological remission after immunosuppressive therapy using anti-thymocyte globulin, cyclosporin A, and glucocorticoids or allogeneic stem cell transplantation. At diagnosis, both VEGF expression and microvessel density were found to be significantly lower in aplastic anemia compared to normal bone marrow (aplastic anemia, 1.1 +/- 0.7 events per field, versus controls, 5.9 +/- 3.0 events per field; P < 0.05). In response to successful therapy, VEGF and microvessel density in the bone marrow increased substantially. Serum VEGF levels were also found to be significantly lower at diagnosis in aplastic anemia compared to healthy controls (aplastic anemia, 51 +/- 35 pg/ml versus controls, 444 +/- 220 pg/ml; P < 0.05). VEGF in the serum increased substantially after successful immunosuppressive therapy or stem cell transplantation (P < 0.05). Taken together, these data show that aplastic anemia is associated with reduced angiogenesis and reduced VEGF expression.     

Population Frequency of Fanconi Pathway Gene Variants and Their Association with Survival After Hematopoietic Cell Transplantation for Severe Aplastic Anemia

Severe aplastic anemia (SAA) is most frequently immune-mediated; however, rare inherited bone marrow failure syndromes, such as Fanconi anemia (FA), may be causal and can present as aplastic anemia (AA). FA is primarily an autosomal recessive disorder caused by the presence of 2 pathogenic variants in a single FA/BRCA DNA repair pathway gene. Patients with SAA often undergo genetic testing during clinical evaluation that may identify single deleterious alleles in FA pathway genes. We quantified the rate of germline single deleterious alleles in 22 FA genes using both a general population database (3234 variants, 125,748 exomes) and in a cohort of patients with SAA undergoing hematopoietic cell transplantation (HCT) (21 variants in 730 patients). The variants were classified as deleterious using in silico tools (REVEL, MetaSVM, VEP) and database resources (ClinVar, LOVD-FA). We found similar rates of single deleterious alleles in FA genes in both groups (2.6% and 2.9%). The presence of a single deleterious variant in a gene for FA in SAA HCT recipients did not affect the overall survival after HCT (hazard ratio, 0.85; 95% CI, 0.37 to 1.95; P  = 0.71), or post-HCT cancer risk (P = 0.52). Our results demonstrate that the identification of a germline monoallelic deleterious variant in an FA gene in patients with idiopathic SAA does not influence the outcome of HCT. Our findings suggest that there is no need for special treatment considerations for patients with SAA and a single deleterious FA allele identified on genetic testing.     

Idiopathic aplastic anemia: Diagnosis and classification

Aplastic anemia (AA) is a disease characterized by pancytopenia and hypoplastic bone marrow caused by the decrease of hematopoietic stem cells. The pathogenesis of AA is complex and involves an abnormal hematopoietic microenvironment, hematopoietic stem cell/progenitor cell deficiencies and immunity disorders. Survival in severe aplastic anemia (SAA) has markedly improved in the past 4 decades because of advances in hematopoietic stem cell transplantation, immunosuppressive and biologic drugs, and supportive care. Herein, we will update the main issues concern AA according to our literature review.     

氯甲基苯甲酰氨标记骨髓间充质干细胞在免疫介导骨髓衰竭小鼠模型体内的归巢

背景：再生障碍性贫血是T淋巴细胞免疫亢进破坏造血干祖细胞的一种异常免疫反应性疾病。骨髓间充质干细胞具有支持造血功能同时具有免疫调控作用。 目的：观察骨髓间充质干细胞移植骨髓衰竭模型小鼠体内的归巢情况。 方法：将BALB/c小鼠随机分成正常对照组、骨髓衰竭模型组和骨髓间充质干细胞移植组,于第6天将已标记氯甲基苯甲酰氨的BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞经尾静脉注射途径移植给骨髓衰竭模型小鼠,采用流式细胞术和组织学荧光显微镜观察标记细胞在不同组织的动态分布。造模第14 天,观察各组小鼠的平均生存时间、外周血血象和骨髓形态学特征。 结果与结论：骨髓间充质干细胞经尾静脉输注后24 h在受体小鼠骨髓中可发现氯甲基苯甲酰氨阳性标记细胞,72 h时阳性标记细胞数量增多(P < 0.05)。骨髓间充质干细胞移植组小鼠濒死或处死前的白细胞、血红蛋白、血小板、骨髓单个核细胞数与模型组小鼠濒死时相比显著升高(P < 0.01)。骨髓衰竭模型组比骨髓间充质干细胞移植组平均生存时间短(P < 0.05)。结果证实,骨髓间充质干细胞输入骨髓衰竭模型体内能归巢至骨髓,促进造血恢复,减轻骨髓衰竭程度,显著延长生存时间。       

骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞的免疫抑制

背景：骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞增殖的影响国内报道较少,而骨髓间充质干细胞是否通过抑制T细胞增殖实现对再生障碍性贫血患者的免疫调节目前尚无定论。 目的：观察人骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞的免疫调节作用。 方法：体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞并通过形态学特征以及流式细胞术进行表面标志鉴定,将骨髓间充质干细胞分别与正常人和再生障碍性贫血患者外周血提取的T淋巴细胞共培养7 d。应用ELISA法检测各培养上清液中T淋巴细胞分泌的白细胞介素2、γ-干扰素、白细胞介素4及白细胞介素10水平。 结果与结论：再生障碍性贫血组患者培养上清液中T淋巴细胞分泌的白细胞介素2、γ-干扰素水平明显高于正常人(P < 0.05),白细胞介素4、白细胞介素10低于正常人(P < 0.05)。骨髓间充质干细胞可下调白细胞介素2、γ-干扰素表达,同时上调白细胞介素4、白细胞介素10表达,从而调节再生障碍性贫血患者的免疫紊乱。     

Eculizumab Bridging before Bone Marrow Transplant for Marrow Failure Disorders Is Safe and Does Not Limit Engraftment

Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) often develops secondary to other bone marrow failure (BMF) disorders, especially aplastic anemia (AA). Patients with the AA/PNH syndrome may require treatment with both eculizumab to reduce intravascular hemolysis and the risk of thrombosis and allogeneic stem cell transplant for the severe BMF. There has been concern that eculizumab could adversely affect the outcomes for transplant in these patients. This is a retrospective, single-center study of severe AA (SAA)/PNH patients treated with eculizumab immediately before the start of conditioning for transplant. Metrics of engraftment and infectious outcomes are described. Eight patients with SAA/PNH and PNH-related symptoms were treated with eculizumab and then proceeded to transplant. All were successfully transplanted without adverse events related to C5 blockage before conditioning. All were also cured of their both PNH and SAA. Eculizumab is safe and efficacious in patients with PNH clones who require transplant. This is sometimes required to “bridge” patients before bone marrow transplantation and does not appear to adversely impact outcomes even when using HLA matched unrelated or haploidentical donors.