盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶不同结构域蛋白的表达纯化及其抗体的制备与分析

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是迄今为止世界上发现的最耐盐的真核光合生物,而甘油是盐藻用于调节细胞内外渗透压变化的关键调渗物质.3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是盐生杜氏藻甘油合成途径中的关键酶.与已经报道的其它物种的GPDH基因不同,盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶(Ds.GPDH)基因具有两个独立的功能结构域,即丝氨酸磷酸化酶结构域(SGPP domain)和3-磷酸甘油脱氢酶结构域(GPD domain).本实验在已克隆的Ds.GPDH2基因的基础上,以含GPDH2全基因序列的T质粒载体(pMD18-T-GPDH2)为模板,PCR扩增分别得到两个单结构域片段(SGPP与GPD),以及双结构域片段(GPDH),构建了pET32a-SGPP、pET32a-GPD和pET32a-GPDH三种原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达.纯化蛋白制备抗原,制备出3个多克隆抗体.Western Blot和交叉反应分析显示通过重组蛋白制备的多克隆抗体具有很高的特异性.图7参16     

盐藻LHCB3蛋白的表达纯化及抗体制备

为了解盐生杜氏藻(Dunaliella salina)主要光捕获蛋白LHCB蛋白的功能,将已获得的盐藻Lhcb3基因构建到原核表达载体pET32a-DsLhcb3,通过优化表达条件,建立了高效的重组系统.pET32a-DsLhcb3在大肠杆菌中的优化表达条件为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h.采用镍离子亲合层析纯化获得LHCB3蛋白,并以此为抗原制备了多克隆抗体,经琼脂糖扩散检测效价,在1:16处有明显沉淀.提取盐藻总蛋白,经过制备的LHCB3抗体杂交,在29 000处获得两条明显的杂交条带,为进一步研究盐藻LHCⅡ蛋白表达机理奠定了基础.     

乙酰辅酶A羧化酶:脂肪酸代谢的关键酶及其基因克隆研究进展

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)在脂肪酸合成和分解代谢中发挥着重要作用.系统介绍了该酶的结构与分类、生物学作用与应用、抑制剂的类型与作用机理以及基因克隆4个方面的进展.ACC在大多数原核生物中为多亚基型酶,而在大多数真核生物中为多功能型单亚基酶,在天蓝色链霉菌和古菌勤奋金属球菌中为另外两种特殊类型;但都具备3个关键的功能域,即生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和羧基转移酶(CT).CT功能域作为潜在的靶标广泛应用于植物除草剂的筛选和哺乳动物肥胖、糖尿病等代谢疾病的药物设计中.ACC基因也成为转基因油料作物和生物柴油研究中重要的靶标基因.研究表明,植物质体中的β-CT亚基是多亚基型ACC的限制因子,而BCCP是脂肪酸合成的负调控因子.油脂的合成代谢十分复杂,且存在反馈抑制机制,因此克隆和表达ACC基因可以提高宿主中ACC的活性,但不一定能显著促进脂肪酸的积累.图2参52     

种子特异启动子At2S3驱动热激转录因子AtHsfA6a提高烟草热抗性

特异启动子指导外源基因在某一特定时空表达,避免个体多余营养的浪费,在作物品质及逆境适应性改良中具有重要应用潜力.采用种子特异启动子联合抗性基因的方法,对拟南芥种子特异启动子At2S3和热激转录因子At Hsf A6a进行克隆,构建p BI121双元表达载体(p At2S3::At Hsf A6a),利用农杆菌菌株转化烟草,获得转基因烟草稳定株系,并进行种子抗高温胁迫萌发实验.结果显示:At Hsf A6a表达量随高温胁迫持续而不断积累,45℃高温处理后,热激转录因子At Hsf A6a的表达量最高上调28倍.转基因烟草株系(L2,L3)与野生型烟草(WT)相比,在45℃高温处理12 h、18 h和24 h后,最终萌发率分别为100%、98%和80%,98%、94%和76%以及97%、92%和70%.根长实验表明转基因株系L2和L3的根长为未处理时的74%和60%,而WT根长为未处理时的52%.上述结果说明超表达烟草株系的萌发和根系生长较之WT对热激处理更不敏感,呈现出更高的抗性;可为种子特异启动子加抗性基因的组合提高转基因植株抗胁迫能力提供直接实验证据,为基因工程育种提供种子特异启动子和抗胁迫新策略.     

水稻锌指蛋白基因OsWIP6的克隆、表达及RNAi载体转化

为了解水稻C2H2型锌指蛋白转录因子基因的表达调控机理及生物学功能,克隆了水稻的一个C2H2型锌指蛋白转录因子基因(OsWIP6),并构建其RNA干涉植物表达载体,通过农杆菌介导转化获得转基因植株.生物信息学分析显示,OsWIP6氨基酸序列与拟南芥两个WIP家族转录因子高度同源.组织差异性表达分析表明,该基因在水稻花发育上具有表达偏向性.与野生型相比,转基因水稻表现为抽穗延迟,结实率及千粒重降低,半定量分析显示转基因植株OsWIP6表达量明显下降.因此,推断OsWIP6基因与水稻育性密切相关.     

团头鲂谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及其在氨氮胁迫中的表达分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是一类多功能蛋白家族,主要参与解毒和抗氧化防御过程。为了研究GST在团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏解毒过程中的作用,克隆并分析了团头鲂1个谷胱甘肽S-转移酶基因(命名为MaGST)cDNA序列,采用实时荧光定量PCR研究了其在氨氮胁迫下的表达规律。MaGST包含1个长218个氨基酸的完整开放阅读框,具有GST蛋白家族的保守碱基和保守结构域。通过MEGA 5.0软件分析系统进化树发现,团头鲂GST与其他动物mu型GST聚为一簇,表明团头鲂GST属于mu型GST。荧光定量PCR结果显示MaGST基因在团头鲂各组织中均有表达,在肝脏和鳃中表达量最高,肌肉中表达量最低,同时在氨氮胁迫过程中该基因在肝和鳃中的表达规律相似,均在胁迫期间表达量显著上调;氨氮胁迫24 h时鳃和肝组织均存在组织损伤。研究结果提示在团头鲂肝脏和鳃组织中GST基因参与了氨氮胁迫的解毒过程。将该基因的编码区重组到p ET-21(a+)载体后在大肠杆菌中得到诱导表达,重组MaGST的GST活力为(10.36±0.68)U·mg~(-1)蛋白。     

铬离子对藻类生长的影响

利用自然光照条件,在不同铬离子质量浓度下,对5种藻类的生长进行了实验研究.研究结果表明:5种藻类在不同的光波长下,其吸收光谱存在两个最强的吸收区: 420～440 nm的蓝紫光部分和660 nm 的红光部分;在不同铬离子质量浓度0～20.63 mg·L-1范围内,5种藻类生长受到不同程度的抑制,其耐受性也尽不相同,经过分析和比较后得出5种藻类对铬的耐受性大小顺序为:微囊藻(Microcystis)＞水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)＞细长聚球藻(Synechococcus elongatus)＞斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)＞蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidose).     

异源表达胡杨PeCPD基因提高烟草对盐、高氮和干旱胁迫的抗性

油菜素类固醇(Brassinosteroids,BRs)在调节植物生长发育和提高植物对非生物胁迫的抗性中起着重要作用,CPD(Constitutive Photomorphogenesis and Dwarfism)基因编码一种甾醇类23a羟化酶,在BR的生物合成中发挥着重要作用.本研究克隆胡杨Pe CPD基因的c DNA序列,并利用农杆菌介导法,将Pe CPD基因植物过表达载体p BI121-35S::Pe CPD转化野生型烟草,筛选得到Pe CPD基因过表达的转基因烟草植株,并利用Na Cl、高氮和甘露醇分别对转基因和野生型烟草进行胁迫处理,检测转基因烟草的耐受性和相关的生理生化指标.结果表明:(1)在正常条件下,转基因烟草的鲜重是野生型烟草的1.47倍;(2)在Na Cl、高氮以及甘露醇的胁迫处理下,转基因烟草植株的根长、叶片叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著高于野生型植株,抗氧化酶SOD和POD活性以及渗透调节物质脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量也同样表现为转基因烟草显著高于野生型,而野生型植株的丙二醛(MDA)含量显著高于转基因植株.因此在烟草中异源过表达胡杨Pe CPD基因不但能够增加烟草的生物量,而且能够提高烟草对盐、高氮和干旱胁迫的抵抗能力.     

一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1是课题组前期通过基因工程改造得到的一株核黄素高产菌,为了进一步提高核黄素的产量,需要对该菌株进行进一步的基因工程改造.本研究首先将编码的链丝菌素乙酰基转移酶基因sat克隆到p MA5质粒上,构建具有诺瓦丝菌素Norseothricin(NTC)抗性的重组质粒p MA5-sat,实验证实该重组质粒能够用于B.subtilis RF1的抗性筛选.随后将核黄素合成相关的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf克隆到重组质粒p MA5-sat上,获得重组质粒p MA5-sat-zwf,并成功构建重组菌B.subtilis RF1/p MA5-sat-zwf.结果显示,重组菌胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力比原始菌提高了近50倍,说明葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在重组菌中成功过量表达;根据发酵特性分析,重组菌B.subtilis RF1/p MA5-sat-zwf最终核黄素产量达到12.01 g/L,比原始菌B.subtilis RF1提高了30.3%.综上,本研究构建的新型抗性质粒能够成功运用于核黄素生产菌枯草芽孢杆菌的基因工程改造.     

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达载体的构建及鉴定

为构建携带冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)的过表达载体,首先从4℃条件下冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP基因的c DNA序列,然后扩增CIRP基因的编码区,将其克隆到真核表达载体p Lenti6/V5中,酶切鉴定并测序.将克隆成功的质粒转染HEK293T细胞,用Western blot检测CIRP的表达水平.成功扩增CIRP编码区,并将其克隆至载体p Lenti6/V5中;当将CIRP过表达载体转染HEK293T细胞后,Western blot检测结果显示CIRP蛋白表达水平明显增加(P<0.01).本研究成功构建了CIRP过表达载体,为进一步研究CIRP的作用机制提供了基础工具.     

木聚糖酶基因xynB在不同大肠杆菌表达系统中的表达比较

从黑曲霉(Aspergillus niger)nl-1中克隆获得木聚糖酶基因xynB.该基因全长745 bp,含有67 bp内含子,与公布的黑曲霉xynB基因有较高的同源性.将PCR扩增的木聚糖酶成熟肽基因和含有信号肽的基因分别连接到表达载体肠杆菌Top10 F’、DH10B和两种BL21宿主中获得重组菌株.通过IPTG诱导,xynB基因在重组菌株中获得特异性表达.表达产物以胞内可溶性蛋白和不溶性包涵体形式存在.诱导4 h,重组菌株pTrc-99a-xynB[BL21 condon plus(DE3)]表达量最高,胞内酶活达到299 IU/L.重组质粒pTrc-99a-xyn B(S)在不同宿主胞内和胞外均能分泌目的蛋白,诱导10 h,胞外酶活pTrc-99a-xynB(S)[BL21 condon plus(DE3)]达到347 IU/L.而pET-20b-xynB(S)在两种BL21宿主中均不表达.经SDS-PAGE分析,以pTrc-99a和pET-20b作为表达载体时,重组蛋白相对分子质量分别约为45×103和30×103.与pET-20b相比,pTrc-99a以及自身信号肽的引导更有利于重组木聚糖酶的表达.     

小麦蛋白翻译起始因子5A(eIF5A)表达载体构建及原核表达

真核生物的翻译起始因子5A(eIF5A)是调控生物生长发育、衰老及环境适应等的重要因子.在对小麦eIF5A基因进行克隆和序列分析的基础上,成功构建了小麦蛋白翻译起始因子5A(eIF5A)的表达载体pET28a( )-eIF5A,并且经IPTG的诱导进行了原核表达,结果表明,eIF5A能够体外高效表达;进一步的Western blot分析表明,所表达的约18×103特异蛋白确为小麦eIF5A蛋白.图4参19     

番茄SIZ1-like1基因的克隆与功能

SUMO(Small ubiquitin-related modifi er)化修饰是植物体内一种重要的蛋白质功能调节方式.它调控植物细胞中蛋白的降解与定位,植物抗性及激素调节等.SIZ1是SUMO的E3连接酶并在SUMO化中起重要作用.为了解SIZ1基因在番茄中的功能,成功克隆番茄(Solanum lycopersicum)SIZ1基因(SIZ1-like1)并构建番茄SIZ1-like1RNA干涉和过表达载体后,通过农杆菌介导转入野生型番茄,成功获得6个独立的转基因阳性植株.荧光定量PCR(Real-time PCR)分析野生型番茄中SIZ1-like1基因的组织表达特异性,发现SIZ1-like1在植物的各个组织中都有表达.构建SIZ1-like1黄色荧光蛋白融合表达载体,通过对SIZ1-like1融合黄色荧光蛋白转基因番茄的根尖进行荧光显微观察,证实番茄SIZ1蛋白定位于细胞核.干旱胁迫实验分析显示,过表达转基因植株抗旱性强于野生型,且脯氨酸含量是野生型的3倍左右,而RNAi植株抗旱能力则较弱.因此SIZ1基因对番茄抗旱起到了正调控作用.     

中华猕猴桃‘红阳’Alase家族基因的克隆及表达分析

在高等植物中醛糖酸内酯酶(Alase)催化L-半乳糖酸(L-Gal A)形成抗坏血酸(Ascorbic acid,As A)的前体物质L-半乳糖-1,4-内酯(L-Ga IL),是As A合成分支途径D-半乳糖醛酸途径中的关键步骤.基于最新的猕猴桃基因组数据库,分离并克隆到3个Alase家族基因,分别命名为Alase1、Alase2、Alase3,并从基因信息、蛋白质理化性质、二级结构及序列特征方面对其进行预测及分析.结果表明,Alase为亲水性蛋白,二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,3个Alase基因具有高度的相似性.定量RT-PCR分析表明3个Alase家族基因在不同组织中均有表达,且在成熟的叶片中表达量最高.同时在猕猴桃果实发育及成熟过程中,Alase家族基因在幼果中的表达水平较低,而在果实发育后期及果实成熟过程中表达量不断升高.本研究可为Alase家族基因后续功能研究及猕猴桃中As A生物合成和积累分子机制解析奠定基础.     

滇池水华蓝藻藻蓝蛋白的分离纯化与毒性研究

采用从昆明滇池机械收获的产毒水华蓝藻为材料,通过采用抽提、粗过滤、微滤、超滤脱毒(截留分子量100 kDa)、低温静置离心、真空干燥等提取纯化方法,从1kg微囊藻粉中制备纯度(A620/A280)高达1.80的57g藻蓝蛋白干粉,小鼠急性毒性试验显示,纯化的藻蓝蛋白无毒性;LD50大于3.71 g·kg-1,而对照原料藻粉的LD50为0.10 g·kg-1,Ames试验结果显示,5个藻蓝蛋白剂量组回变菌落数均未超过阴性对照菌落数2倍,亦无剂量一效应关系,Ames实验结果阴性,初步通过食品安全性毒理学评价程序.     

播娘蒿DsCOR蛋白纯化、抗体制备及对冷诱导的响应

为揭示播娘蒿(Descurainia sophia)极强的抗寒特性,在大肠杆菌中重组表达已克隆的播娘蒿抗寒基因DsCOR,比较Ni亲合层析和煮沸-透析袋电洗脱蛋白纯化方法,制备纯化的DsCOR重组蛋白多克隆抗体,Western Blotting检测播娘蒿在寒冷胁迫下DsCOR的表达特性.结果表明,两种纯化技术均能纯化DsCOR蛋白,透析袋电洗脱法纯化蛋白浓度为1.21mg/mL,是Ni亲和层析法纯化蛋白浓度的2倍,且经PEG8000浓缩后的蛋白总量分别为9.075mg和4.256mg;制备的DsCOR抗体效价达1:12800,Western Blotting检测显示只有经过低温冷诱导的播娘蒿DsCOR蛋白才表达,证明了DsCOR基因受低温诱导的规律.     

干燥和复吸水条件下发菜过氧化物氧还蛋白差异表达与基因克隆

发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生固氮蓝藻,为探讨其耐旱的分子机理及对极端干旱环境的适应和保护机制,运用双向电泳技术(2-DE)、凝胶图像分析、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,分析发菜过氧化物氧还蛋白(Peroxiredoxin)在持续干燥48 h和复吸水4 h后的差异表达水平,根据鉴定的过氧化物氧还蛋白已知氨基酸序列设计简并性引物克隆该基因,分析基因和氨基酸序列的同源性及对蛋白质二级结构进行预测,并研究其原核表达.结果表明,发菜过氧化物氧还蛋白在复吸水后的表达量明显高于干燥状态下的表达量。根据简并性引物克隆获得长度为639 bp的过氧化物氧还蛋白基因,GenBank登陆号为HM854286.序列比较分析显示该基因具有较高的保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋、β折叠和随机卷曲构成.将过氧化物氧还蛋白基因在大肠杆菌中表达,获得符合预期的外源重组蛋白(26.5×103),经Western blotting验证,该外源蛋白为过氧化物氧还蛋白.图10表1参25     

海马齿小热激蛋白SpHSP18.1基因的克隆及盐胁迫表达分析北大核心CSCD

为探究海马齿高盐环境耐受性的分子机制,根据海马齿c DNA文库序列设计引物,采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术克隆得到海马齿小分子热激蛋白Sp Hsp18.1基因序列.Blast分析表明,该c DNA序列(968 bp)含完整开放阅读框(ORF)全长为489 bp,编码162个氨基酸.等电点(p I)为6.19,分子量(Mr)大小为1860 5.90.Sp HSP18.1编码氨基酸序列具有分子伴侣蛋白特有的ACD保守区域(Alpha crystallin domain),与拟南芥、西瓜等植物的细胞质I型小热激蛋白具较高同源性(>75%).将Sp Hsp18.1基因克隆到PUCm-T原核表达载体上,得到重组菌株,通过过量表达探究其耐热胁迫能力.结果表明,在37℃下重组菌株与野生型菌株的生长曲线基本相似,但在高温(45℃)下,重组菌株较对照组菌株存活率有显著提高.荧光实时定量PCR分析表明,在不同浓度海水培养条件下,海马齿根部均表达Sp Hsp18.1基因,且随着海水浓度的增加,该基因的表达量呈现上升的趋势.说明Sp Hsp18.1基因在海马齿应答高盐胁迫过程中起到一定的作用.     

异源表达胡杨PeBAK1;1基因增强烟草对Pst DC3000的抗性

BAK1(BRI1-associated receptor kinase 1)是一个富亮氨酸重复序列(LRR)的膜受体蛋白激酶,除参与植物油菜素内酯信号的转导外,还可以结合其他的LRR-RLKs蛋白来启动植物的先天免疫反应.为明确胡杨Pe BAK1;1基因在烟草中抗Pst DC3000(丁香假单胞杆菌种番茄致病变种)的功能及其在植物抗病中的调控方式,克隆胡杨Pe BAK1;1基因c DNA序列构建Pe BAK1;1基因的过量表达载体p BI121-35S::Pe BAK1;1,并利用农杆菌介导法将其转化野生型烟草,筛选获得Pe BAK1;1基因过表达的转基因烟草植株.生物信息学分析结果表明胡杨Pe BAK1;1蛋白具有植物SERK家族的全部结构特征,系统进化树分析表明胡杨Pe BAK1;1与毛果杨Pt BAK1的序列同源性最高;组织表达分析表明Pe BAK1;1基因主要在根和叶中表达;Pst DC3000侵染试验结果显示,野生型烟草植株接种Pst DC3000后表现出明显的感病症状,而Pe BAK1;1基因过表达的转基因烟草植株表现出明显的抗病症状;Real-time PCR及quantitative real-time-PCR分析结果表明,与野生型相比,转基因烟草中抗病防御相关基因PR1、PR3、PR4和PR5的表达量显著升高,且参与植物生长发育与先天防卫反应的基因BIR1和BON1的表达量也明显升高.上述结果表明,异源表达胡杨Pe BAK1;1基因在烟草抗Pst DC3000过程中起正调控作用,能够增强植物的抗病能力.     

利用 S-层蛋白CTC在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白PMGA1.2的可行性及其免疫原性,为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础.用部分pmga1.2基因(pmga1.2p)代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段,构建了2个融合基因ctc-pmga1.2p和csa-ctc-pmga1.2p(csa表csaAB操纵元,其与S-层蛋白牢固地锚定到细胞表面密切相关);将含融合基因的重组质粒电转化入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中,获得了2个重组菌株BCCG(含ctc-pmga1.2p和携带csaAB操纵元的质粒)和CG(含csa-ctc-pmga1.2p).血凝和血凝抑制试验结果显示,2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组蛋白PMGA1.2P;小鼠免疫学实验证实,2个重组菌株所展示的重组蛋白均具有免疫原性,其中,重组菌株CG的免疫效果优于BCCG.结果表明,苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可被用来研制热稳定性禽用口服疫苗.