Apoptin基因/壳聚糖缓释微球的制备及其对A375细胞的凋亡诱导作用

目的:以羧甲基壳聚糖为基质材料,制备apoptin基因缓释微球.方法:采用复凝聚法制备apoptin/壳聚糖微球,分别用光镜观察微球形态、内切酶研究其稳定性、DNA电泳阻滞分析apoptin/壳聚糖最佳比例、PCR测定apoptin基因作为复制摸板能力、用MTT法检测其抗肿瘤活性.结果:壳聚糖与apoptin基因可形成稳定的微球,其直径在200～300 nm之间,成球性较好、apoptin/壳聚糖微球P/N最佳质量比为5.5:1、微球能够有效防止DNA酶的降解作用、apoptin/微球载体中的基因仍具有DNA复制模板功能,并能有效地转染A375细胞,诱导A375细胞发生凋亡,从而抑制瘤细胞生长.结论:apoptin基因与羧甲基壳聚糖可形成稳定的缓释微球,并能有效地转染肿瘤细胞,诱导肿瘤细胞发生凋亡.     

肿瘤特异性凋亡基因诱导人淋巴瘤细胞凋亡的机制

目的:研究肿瘤特异性凋亡基因(apoptingene)在诱导人淋巴瘤细胞U937凋亡时,cJun氨基末端激酶(JNK)信号通路的作用。方法:用含有apoptin基因的真核表达载体,瞬时转染体外培养的人淋巴瘤细胞U937。采用流式细胞仪、Westernblot、台盼蓝染色及RTPCR等研究其在不同时间条件下诱导U937细胞凋亡的作用。结果:Apopin基因瞬时转染U937细胞48h,可出现明显的凋亡;而且凋亡细胞的数量与apoptin基因的转染时间有关。诱导后24h,U937细胞中出现磷酸化的JNK蛋白的表达,诱导后48h达高峰;而非磷酸化的JNK蛋白表达无明显变化。结论:Apoptin基因具有诱导U937细胞凋亡的作用。JNK信号通路的激活,可能在apoptin基因诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥着重要作用。     

一种新型纳米基因载体的制备及体外实验

本实验以聚乳酸和O-羧甲基壳聚糖为基质材料，采用超声波法制备了聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米微球，并用环境扫描电镜和XPS对其进行了表征，将聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米微球携带寡核苷酸转染TJ905人脑胶质瘤细胞，并通过RT-PCR方法对细胞的转染情况作了一系列的体外检测，结果表明，携带寡核苷酸的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米微球能有效地转染TJ905人脑胶质瘤细胞，同时也能有效地抑制胶质瘤细胞中端粒酶RNA，端粒酶催化亚基RNA的表达和端粒酶的活性，从而抑制人脑胶质瘤细胞生长，达到基因治疗的目的。     

冬凌草甲素增强巨噬细胞对凋亡的U937细胞的吞噬作用

目的：研究具有诱导肿瘤细胞凋亡活性的冬凌草甲素，促进巨噬细胞对因凋亡的肿瘤细胞的吞噬作用。 方法： DNA凝胶电泳检测UV照射（2.4 J/cm2, 4 min）的人组织淋巴瘤U937细胞凋亡；Giemsa染色，Hoechst 33258染色，镜下检测计数吞噬作用。 结果： UV照射（2.4 J/cm2, 4 min）诱导U937细胞发生凋亡，琼脂糖凝胶电泳可见凋亡典型的DNA梯带。2.7 μmol·L^-1的冬凌草甲素具有增强U937分化的巨噬细胞对UV照射诱导凋亡的U937细胞的吞噬作用，并呈时间剂量依赖性，但对非特异性荧光颗粒的吞噬效果较弱。加入抗TNFα和抗IL-1β的抗体，培养12 h, 吞噬增强作用明显受抑制。冬凌草甲素在人外周血来源的巨噬细胞吞噬凋亡的U937细胞过程中同样发挥增强吞噬的效果。 结论： 冬凌草甲素可特异地增强巨噬细胞对凋亡的U937细胞的吞噬作用，其吞噬机制是通过诱导巨噬细胞TNFα和IL-1β的释放。     

D,L-聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物微球防龋基因疫苗的体外研究

目的 制备防龋基因疫苗的DNA／PEIA微球,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法采用改进的溶剂挥发法双乳液(W1/O／W2)体系制备基因疫苗的DNA／PELA微球;测定了微球的形态大小、包封率及细胞毒性,将基因疫苗微球转染哺乳动物细胞,用流式细胞仪和RT-PCR测定在其中表达的情况。结果制备的DNA／PELA复合物多呈球状,平均粒径1．806μm,对细胞无毒性,可在体外转染哺乳动物细胞,并能正确地转录表达;结果证实基因疫苗微球转染效率低,提示微球中的DNA具有缓慢释放的特征。结论PEIA可作为防龋基因疫苗的投递系统,是一种安全、有效的释放体系。     

Apoptin基因通过激活caspase-3诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡

目的研究caspase-3在肿瘤特异性凋亡基因诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡中的作用。方法用含有apoptin基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色瘤细胞A375;采用RT-PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞术检测A375细胞的凋亡;以比色法检测caspase-3的相对活性。结果Ap-optin基因瞬间转染的A375细胞可出现典型的细胞凋亡所具有的DNA梯状带;流式细胞术发现实验组细胞凋亡率明显高于其他各组(P<0.01);转染后24h实验组caspase-3的活性开始升高,72h达高峰,明显高于其他各组(P<0.01)。结论Apoptin基因可通过激活caspase-3诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡。     

抗人DR5单克隆抗体对白血病U937细胞凋亡的作用

目的：研究鼠抗人DR5单克隆抗体（mDRA-6）对白血病细胞U937的凋亡诱导作用。方法：光镜下观察mDRA。6作用后U937细胞的形态变化；流式细胞术检测15937细胞表面DR5表达率；MTT法检测mDRA-6对U937细胞生长的影响；AnnexinV—FITC／PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率；琼脂糖凝胶电泳检测U937细胞DNA的片段化降解；JC-1单染流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位改变。结果：mDRA-6作用U937细胞后呈现典型的细胞凋亡特征；MTT法检测显示mDRA-6作用U937细胞24小时死亡率为61．09％，并呈时间、浓度依赖性；流式细胞仪检测显示10mg/L的mDRA-6作用4小时，U937细胞凋亡率为79．12％；琼脂糖凝胶电泳显示DNA呈现明显梯状带型；mDRA-6作用U937细胞后线粒体膜电位明显下降。结论：mDRA-6能够诱导白血病U937细胞凋亡，是具有诱导细胞凋亡活性的功能性抗体。     

ARHI基因抑制U937白血病细胞株生长并诱导其G_2/M期阻滞及凋亡

目的:探讨抑癌基因ARHI在急性髓细胞白血病中的表达情况,同时探索其对U937细胞生长的影响。方法:RT-PCR方法检测急性髓细胞白血病细胞株、人胚肾细胞293FT、白血病原代细胞以及健康志愿者血细胞中ARHI mRNA的表达情况。构建高表达ARHI的MSCV-IRES-GFP-ARHI质粒转染U937细胞,MTT法连续8 d检测细胞活性绘制生长曲线。新鲜培养基重悬U937细胞24 h后,采用流式细胞术检测细胞周期以及细胞凋亡。结果:293FT细胞、健康志愿者血细胞中均检测到ARHI mRNA表达,而白血病细胞株以及白血病患者原代细胞中未检测到该基因的表达。生长曲线显示高表达ARHI基因的U937(U937-ARHI)细胞在第6~8天细胞活力低于对照(U937-GFP)组。高表达ARHI的U937细胞G2/M期细胞比例及细胞凋亡率均高于对照组(P0.05)。结论:ARHI在急性髓系白血病细胞中的表达减低;高表达ARHI基因能抑制U937细胞生长、阻滞其细胞周期在G2/M期并促进细胞凋亡。     

抗人DR5单抗致白血病U937细胞凋亡的作用机制

目的探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对白血病细胞U937凋亡诱导作用及机制。方法 MTT法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测mDRA-6对U937细胞的生长抑制及凋亡诱导作用,Western blotting检测caspase8、10、3、9及Cytochome C在U937细胞凋亡过程中的表达及激活情况;选用caspase8、10、3抑制剂预处理U937细胞,观察是否抑制mDRA-6对U937细胞的凋亡诱导作用。结果MTT结果显示:10mg/L的mDRA-6作用U937细胞24h,细胞死亡率为61.09%,呈时间、浓度依赖性;流式细胞仪检测显示mDRA-6作用4h,细胞凋亡率为69.03%;Western blotting结果显示caspase10、3、9及Cytochome C均有活性片断表达,而caspase8无明显激活;caspase10和caspase3抑制剂部分抑制mDRA-6的凋亡诱导作用,caspase8抑制剂作用不明显。结论抗人DR5单克隆抗体mDRA-6通过死亡受体和线粒体途径诱导白血病U937细胞凋亡。     

甘露聚糖结合凝集素诱导人白血病细胞系U937细胞凋亡

目的研究甘露聚糖结合凝集素（MBL）对白血病细胞系U937凋亡的影响。方法不同浓度MBL处理U937细胞后,应用CCK-8法分析细胞增殖情况,Hoechst33258染色观察细胞核及染色质,AnnexinV/PI双染流式细胞术分析细胞凋亡率,real-timePCR和免疫印迹分析凋亡相关基因及蛋白表达。结果 30～50μg/mlMBL培养72h,U937细胞增殖明显受抑,出现不同程度核固缩、核碎裂;随MBL浓度升高或作用时间延长,凋亡细胞数逐渐增多;Fas、Caspase-3mRNA、Fas和FasL蛋白表达量升高,Caspase-3和多腺苷二磷酸多聚酶（PARP）蛋白被剪切激活或失活。结论 MBL可诱导白血病细胞U937细胞凋亡,其机制与上调Fas表达、剪切Caspase-3和PAPR有关。     

肿瘤特异性凋亡基因诱导人黑色素瘤细胞凋亡机制的研究

目的研究肿瘤特异性凋亡基因(Apoptin gene)在诱导人黑色素瘤细胞A375发生凋亡时,c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路在细胞发生凋亡中的作用。方法用含有肿瘤特异性凋亡(Apoptin)基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色素瘤细胞A375;采用流式细胞仪、免疫印迹法(W estern b lot)、台盼蓝染色法及RT-PCR等方法研究其在不同时间条件下对人黑色素瘤细胞A375诱导凋亡的作用。结果Apoptin基因瞬间转染的人黑色素瘤A375细胞出现明显的细胞凋亡,凋亡细胞的数量随Apoptin转染时间延长而增多,磷酸化型JNK蛋白在转染Apoptin 24 h开始表达,48h和72h过表达,而非磷酸化型JNK蛋白表达无明显变化。结论Apoptin基因具有诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡的作用,JNK信号通路的激活可能在Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥作用。     

Apoptin特写:新治疗展望

Apoptin诱导人转化细胞而不是正常细胞的凋亡,特异性地感知转化细胞的信号并被激活。这些特性使得Apoptin成为一种用于与细胞转化相关的肿瘤以及自身免疫性疾病(如风湿性关节炎)的前景型制剂。不同研究小组相继报道了细胞转化特异性过程和Apoptin凋亡诱导的相关性,如肿瘤特异激酶激活以及p53阴性转化细胞中细胞分裂后期启动复合物(APC)即起关键作用。体内外前临床基因治疗研究和蛋白转导试验充分显示Apoptin作为治疗制剂的有效性和安全性。化疗药物,如etoposide、paclitaxel或methotrexate(甲氨蝶呤)与Apoptin的联合治疗,协同增强了对肿瘤细胞的毒效应。对Apoptin感知的细胞转化信号通路的深入研究,将有助于在分子水平上进一步揭示癌发生或风湿性关节炎疾病的病理机制。Apoptin工艺与其它化疗制剂的结合,将为细胞转化相关疾病提供新颖的治疗策略。     

ATP对人白血病细胞U937凋亡的影响

目的　探讨ATP诱导人白血病细胞U937细胞凋亡的机理。　方法　应用ATP(0 2 3g L)作用于培养的U937细胞 ,应用免疫荧光细胞化学方法检测连接蛋白Cx4 3、F 肌动蛋白 (F actin)、纽蛋白 (vinculin)的表达。　结果　ATP诱导U937细胞凋亡小体形成的同时Cx4 3表达增强、F 肌动蛋白重组 ,纽蛋白组装改善。　结论　ATP诱导人白血病细胞凋亡时 ,凋亡小体的形成与间隙连接蛋白Cx4 3表达、F 肌动蛋白重组 ,纽蛋白组装有着平行关系 ,表明它们在U937凋亡小体形成过程所起的重要作用     

The tumor-selective viral protein apoptin effectively kills human biliary tract cancer cells

Biliary tract cancer, or cholangiocarcinoma, has a poor prognosis. Resection is the only curative treatment, but only a minority of patients are eligible. Chemotherapy and gamma-irradiation are merely palliative, as they are unable to remove the malignancy completely. The chicken anemia virus-derived protein apoptin induces apoptosis in a wide range of human tumor cells and is not hindered by mutations inactivating p53 or by overexpression of Bcl-2, changes known to frustrate chemotherapy and radiation therapy. We examined whether apoptin kills human biliary tract cancer cells. Expression of apoptin by means of plasmids caused extensive cell death in three independent cholangiocarcinoma cell lines, CC-LP, CC-SW, and Mz-ChA-1, regardless of their oncogenic mutations, which included inactivated p16 and p53 and the disruption of the transforming growth factor beta signaling pathway. In vitro delivery of apoptin by an adenoviral vector completely eradicated cholangiocarcinoma cells. Moreover, coexpression of the broad-spectrum caspase inhibitor p35 with apoptin only delayed the induced cell death. Changes in nuclear morphology still occurred early after transfection, and nuclei eventually disintegrated, suggesting that apoptin-induced cell death in these cells is not blocked by mutations in either the initiation or execution phase of apoptosis. The efficient induction of cell death by apoptin in cholangiocarcinoma cell lines makes apoptin an attractive candidate for molecular therapy of biliary tract cancer.     

槲皮素对U937细胞系抑制增殖和诱导凋亡作用的研究

目的 探讨黄酮类化合物槲皮素（Que）对人类单核细胞白血病U937细胞系的抑制增殖和诱导凋亡的作用。方法 应用MTT法检测不同浓度槲皮素对U937细胞的增殖抑制作用；AO／PI荧光染色后倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳测定细胞DNA的片段化；应用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期分布。结果槲皮素能明显抑制U937细胞增殖，并存在剂量-效应关系和时间-效应关系；诱导U937细胞出现凋亡所具有的形态学和生化特征；随着槲皮素浓度升高，凋亡细胞和坏死细胞比例增加；将细胞特异性地阻滞在S期，出现凋亡峰。结论 槲皮素能抑制U937细胞增殖，诱导细胞凋亡，并具有细胞周期特异性。     

Rapid aqueous photo-polymerization route to polymer and polymer-composite hydrogel 3D inverted colloidal crystal scaffolds

Regarding safety concerns, nonviral gene delivery vehicles that have the required efficiency and safety for use in human gene therapy are being widely investigated. The aim of this study was to synthesize and evaluate a thiolated chitosan to improve the efficacy of oral gene delivery systems. Thiolated chitosan was synthesized by introducing thioglycolic acid (TGA) to chitosan via amide bond formation mediated by a carbodiimide. Based on this conjugate, nanoparticles with pDNA were generated at pH 4.0 and 5.0. Cytotoxicity of the thiolated chitosan/pDNA nanoparticles on Caco-2 cells was evaluated. The diameter of thiolated chitosan/pDNA nanoparticles was in the range of 100-200 nm. The zeta potential was determined to be 5-6 mV. Due to stability toward nucleases, the transfection rate of thiolated chitosan/pDNA nanoparticles was fivefold higher than that of unmodified chitosan/pDNA nanoparticles. Lactate dehydrogenase tests for thiolated chitosan/pDNA (pH 4.0 and 5.0) showed that (3.79 +/- 0.23)% and (2.9 +/- 0.13)% cell damage. According to these results, thiolated chitosan represents promising excipients for preparation DNA nanoparticles in nonviral gene delivery system.