手足口病病原体实时荧光RT-PCR反应体系的建立与临床应用

目的 建立一种快速、准确、特异件高的方法 检测手足口病病原体.方法 根据引起手足口病常见致病原肠道病毒71(EV71)、柯萨奇病毒A16(CA16)及肠道病毒(EV),设计相应的引物、探针对35例临床诊断的手足口病患儿及20例正常健康婴儿的粪便进行EV、EV71、CA16三种病原体实时荧光RT-PCR检测,同时对55分标本进行EV71病毒培养分离.结果 35例临床诊断手足口病患儿粪便中EV全部阳性,EV71阳性25例,CA16阳性8例,其中3例为EV71、CA16同时阳性,与临床诊断符合率为85.71%,20例健康体检婴儿粪便中EV病毒5例阳性,EV71、CA16均阴性.结论 荧光RT-PCR对手足口病病原体检测准确性高、特异性强,具有快速、廉价等特点,适合于手足口病的早期诊断.     

西安地区2008年肠道病毒71型基因特征分析

目的 研究西安地区2008年引起手足口病病原构成及EV71的基因特征.方法 采集124例临床诊断手足口病病例标本,RT-PCR检测肠道病毒血清型别;挑选EV71阳性标本进行病毒分离,扩增7株EV71病毒,扩增其VP1区,测序并与EV71各血清型代表株序列比对,进行进化分析.结果 2008年西安地区手足口病（HFMD）的病原中CA16占49.45%,EV71占30.76%,其他肠道病毒占19.78%.7株EV71 VP1区与标准株序列比对,亲缘进化分析显示本地区EV71与中国大陆其他地区毒株相似.结论 2008年西安地区引起手足口病的病原以CA16为主,而EV71属于C4亚型.     

2009-2011年上海市手足口病病原学检测及其临床特点分析

目的 了解上海市手足口病不同病原体的感染现状以及所致的手足口病的临床特点之间的差异,为制定观察、治疗方案,做好手足口病防控工作提供参考.方法 采集2009年3月至2011年12月在本院传染科门诊诊断为手足口病的357例病例的咽拭子、疱疹液、粪便共551份标本进行病原学检测.用RT-PCR法对肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)、肠道病毒通用型(PE)进行鉴别.结果 357例手足口病患儿共采集到551份标本,检测病毒总阳性率为79.7％,2009年手足口病以CoxA16流行为主,2011年以EV71流行为主,三年病毒流行株差异有统计学意义(P =0.005);疱疹液病毒检出率最高;EV71、CoxA16、PE病毒感染的手足口病患儿在发热、易惊的发生比例比较差异有统计学意义(P＜0.05);EV71感染的患儿外周血白细胞计数和中性粒细胞比例要高于CoxA16和PE感染的患儿,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 上海市手足口病在不同时期病原体呈现交替流行;对不同病原体临床特征的分析比较有助于EV71感染的防控、早期治疗、重症病例的筛查.     

2009年徐州地区疑似肠道病毒感染病例病原学研究

目的 了解2009年徐州地区肠道病毒感染引起手足口病情况,为手足口病防控工作提供科学依据.方法 采用荧光RT-PCR方法对240例临床诊断为肠道病毒感染的手足口病例中的222例肛拭子和咽拭子标本同时进行EV和EV71、CA16特异性RNA检测,用ELA方法对其中的114例急性期血清标本进行EV71-IgM抗体检测.同时检测健康儿童254份咽拭子和258份血清标本以及密切接触者咽拭子54份标本.结果 240例疑似肠道病毒感染者,总EV感染率为72.50%(174/240),其中EV71感染率为57.92%(139/240),CoxA16感染率为9.17%(22/240),其他EV感染率为5.42%(13/240).240例疑似肠道病毒感染者中的222份肛拭子标本EV71-RNA阳性率为45.94%(102/222)、咽拭子EV71-RNA阳性率为25.68%(57/222),114份急性期血清中EV71-IgM抗体阳性率为86.84%(99/114).254份健康儿童咽拭子EV71-RNA阳性率为1.57%(4/254),未检出CoxA16-RNA;258份健康儿童血清标本EV71-IgM抗体阳性率是2.71%(7/258).密接(医护人员)咽拭子54份,EV-RNA检测均为阴性.结论 徐州地区手足口病流行主要由EV71型引起.3岁以下儿童流行期间存在被EV71型隐性感染,并产生IgM抗体.成人即使密切接触传染源也不易被感染EV71.疑似病例急性期血清中EV71-IgM抗体检测阳性率最高(86.84%),其次为肛拭子EV71(45.94%)和咽拭子EV71(25.68%)的RNA检测阳性率.ELA试剂盒用于EV71型感染的早期诊断,具有操作简单快速经济,值得在基层推广.     

2009年徐州地区疑似肠道病毒感染病例病原学研究

目的 了解2009年徐州地区肠道病毒感染引起手足口病情况,为手足口病防控工作提供科学依据.方法 采用荧光RT-PCR方法对240例临床诊断为肠道病毒感染的手足口病例中的222例肛拭子和咽拭子标本同时进行EV和EV71、CA16特异性RNA检测,用ELA方法对其中的114例急性期血清标本进行EV71-IgM抗体检测.同时检测健康儿童254份咽拭子和258份血清标本以及密切接触者咽拭子54份标本.结果 240例疑似肠道病毒感染者,总EV感染率为72.50%(174/240),其中EV71感染率为57.92%(139/240),CoxA16感染率为9.17%(22/240),其他EV感染率为5.42%(13/240).240例疑似肠道病毒感染者中的222份肛拭子标本EV71-RNA阳性率为45.94%(102/222)、咽拭子EV71-RNA阳性率为25.68%(57/222),114份急性期血清中EV71-IgM抗体阳性率为86.84%(99/114).254份健康儿童咽拭子EV71-RNA阳性率为1.57%(4/254),未检出CoxA16-RNA;258份健康儿童血清标本EV71-IgM抗体阳性率是2.71%(7/258).密接(医护人员)咽拭子54份,EV-RNA检测均为阴性.结论 徐州地区手足口病流行主要由EV71型引起.3岁以下儿童流行期间存在被EV71型隐性感染,并产生IgM抗体.成人即使密切接触传染源也不易被感染EV71.疑似病例急性期血清中EV71-IgM抗体检测阳性率最高(86.84%),其次为肛拭子EV71(45.94%)和咽拭子EV71(25.68%)的RNA检测阳性率.ELA试剂盒用于EV71型感染的早期诊断,具有操作简单快速经济,值得在基层推广.     

2009年夏季174例手足口病患儿病原分析

目的分析本院2009年夏季手足口病患儿病原及其血清型特征,为临床早期诊断和疾病防控提供实验依据。方法2009年4—9月,首都儿科研究所附属儿童医院门诊就诊的174例手足口病患儿咽拭子和疱疹液,实时荧光RT—PCR方法检测肠道病毒通用型（EV）、柯萨奇A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）。131例患儿双份血清,同时检测CA16、EV71IgM抗体。CA16和EV71阳性标本扩增VP1区基因片段后测序,进行同源性和系统进化分析。结果（1）EV、CA16、EV71阳性例数分别为167、112、46;阳性率为96．O％、64．4％、26．4％,CA16：EV71为2．43：1。（2）首诊血清CA16和EV71IgM阳性例数为51、25,阳性率为38．9％、19．1％,复诊阳性例数为98、32,阳性率为74．8％、24．4％。（3）CA16VP1区核苷酸同源性为88．7％-98．5％,EV71VP1区核苷酸同源性为94．9％-99．7％,与c4亚型参比序列核苷酸同源性92．1％～95．3％。结论2009年夏季本院手足口病患儿病原以CA16、EV71为主,EV71阳性率较之前报道有较大幅度升高。EV71病毒株以c4亚型为主。实时RT-PCR法较血清学检测特异性IgM抗体更适于疾病早期诊断。     

深圳市某地2011年正常人群手足口病隐性感染调查研究

目的了解深圳市某地2011年成人及健康儿童手足口病隐性感染情况。探讨健康人群隐性感染与儿童患手足ISl病的关系。方法随机选取该区域幼儿同学生和老师共150人,分为0～、2～、5-岁组各30人,15～、24～、〉50岁组各20人。每人采集粪便标本5～8g,进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A16型（CA16）核酸检测。结果共采集150份样本,EV通用型阳性13份（8．67％）,其中5岁以下的有11例（84．6％）。CA16阳性2份,EV71阳性1份,均属于0-岁组。结论肠道病毒在人群中隐性感染较为普遍,5岁以内儿童为主要感染人群。健康人群中引起手足口病常见的EV71和CA16阳性肠道病毒隐性感染率低。     

柯萨奇病毒A组6型与肠道病毒71型感染所致手足口病临床特征比较

目的 了解柯萨奇病毒A组6型、肠道病毒71型手足口病临床特点,为指导临床诊断,调整手足口病防控策略提供科学依据.方法 采用前瞻性调查的方法,收集2013至2014年在北京市西城区手足口病临床确诊病例信息,将手足口病原核酸检测阳性的病例分为CA6、EV71组,分析比较2组的临床特点、流行特征、预后等.结果 CA6组130例,EV71组121例.2组的年龄、性别分布差异无统计学意义.CA6组发热比例高达82.3％,明显高于EV71组(34.7％,P＜0.05),其中大于等于38℃占85.0％.CA6组出现大疱疹(7.4％)、恢复期脱皮(16.9％)、脱甲(10.0％)的比例高于EV71组(P＜0.05).不同年份流行主要毒株不同.结论 与EV71感染相比,CA6感染引起的高热比例较高,部分病例可表现为大疱疹、脱皮、脱甲,整体预后较好.CA6和EV71感染所致的HFMD发病高峰季节不一致.     

2008-2009年广东手足口病非CA16非EV71肠道病毒株的鉴定及其VP1基因分型研究

目的 探讨2008-2009年广东省手足口病非CAI6非EV71肠道病毒株的流行情况以及毒株型别.方法 从2008-2009年广东省手足口病粪便样本中采用RD细胞和HEp-2细胞分离病毒毒株,待出现细胞病变后收集上清采用RT-PCR进行鉴定.非CA16非EV71毒株再进行VP1测序分析,序列通过BLAST程序鉴定型别,用MEGA4.0软件进行基因进化分析.结果 共分离到22株非CA16非EV71毒株,通过BLAST程序鉴定犁别.2008年9株非CA16、非EV71的毒株有CA2型、CA4、CB3型;2009年13株有EV80、E13、E30、CB5、E24、PV1、CA10、CA6和CA2.各毒株间同源性低,各毒株分别归属CoxA、CoxB、埃可肠道病毒、新型肠道病毒和脊灰病毒组.结论 广东省2008-2009年两年来,手足口病除了CA16和EV71占主导地位外,并不存在其他的优势株,其他型肠道病毒分布比较广,既有CoxA组病毒、CoxB组,也有E13、E24、E30、新型病毒EV80和脊髓灰质炎病毒PV1,儿组病毒伴随流行.     

2008-2009年北京分离的肠道病毒71型基因组3'末端序列分析

目的 了解2008-2009年北京分离的肠道病毒71型(EV71)基因组3'末端的基因特征(未包括多聚腺苷尾),探讨是否与病毒的致病性有关.方法 于2008-2009年手足口病流行期间采集来首都儿科研究所附属儿童医院就诊的普通手足口病患儿和合并重症神经系统并发症患儿的咽/鼻拭子或疱疹液标本.将标本接种Vero细胞进行肠道病毒分离,同时设计肠道病毒通用引物、EV71和柯萨奇病毒A组16型(CA16)特异性引物通过巢式RT-PCR对分离到的肠道病毒进行型别鉴定.对引起不同临床类型感染的10株EV71分离株的基因组3'末端进行序列测定和分析.结果 10株EV71的3'末端均包含1386 nt的3D、终止密码子TGA和81 nt的3'UTR,由3D核苷酸序列所推导的3D蛋白含462个氨基酸.10株EV71的3D和3'UTR核苷酸同源性分别为95.8%～99.6%和96.3%～100%,重症来源的4株毒株中有3株在3Dpol第140位和第263位同时出现了相同的氨基酸变异(R140K和I263V).10株EV71的3D与C4亚型代表株具有最高的核苷酸和氨基酸同源性,分别为92.7%～94.2%和96.8%～97.6%;在3'UTR与CA16/G10具有最高的核苷酸同源性(88.9%～91.4%).3D区的遗传进化分析表明10株EV71在亲缘关系上与C4亚型最密切,与CA16/G10较密切,而与EV71其他基因型和亚型较疏远.结论 基因组3'末端在EV71进化中可能有一定的作用.     

Relationship between serologic response and clinical symptoms in children with enterovirus 71-infected hand-foot-mouth disease

This study aimed to explore the correlation between clinical symptoms, including rash and fever, and serum antibody reaction to enterovirus 71 (EV71) infection in children hospitalized due to hand-foot-mouth disease (HFMD). From May 2014 to July 2014, a total of 547 children hospitalized due to HFMD in Children’s Hospital of Fudan University were enrolled retrospectively. RNA levels of EV71 and CA16 in fecal, serum, and cerebrospinal fluid specimens were measured using quantitative real-time RT-PCR, and EV71-IgM antibody in the serum was detected using immune colloidal gold assays. Of the 547 fecal specimens, 296 were EV71 RNA positive, 109 were CA16 RNA positive, and 8 were positive for both EV71 RNA and CA16 RNA. The total positive rate for either EV71 or CA16 in feces was 72.58% (397/547). Additionally, 544 serum specimens were collected, and 409 were EV71-IgM positive (75.18%). The duration of rash and fever was found to be correlated to the positive rate of serum EV71-IgM, and the positive rate of serum EV71-IgM plus EV71 RNA in feces. The positive rates of serum EV71-IgM and serum EV71-IgM plus EV71 RNA in fecal collected at day 3 of fever were 79.7% and 52.8%, respectively. In conclusion, EV71 and CA16 were found to be the major pathogens responsible for the epidemics of HFMD in children during May to July 2014 in Shanghai, China. There is a close relationship between the positive rate of serum EV71-IgM and the duration of fever and rash.     

河北省手足口病病例的病原构成及EV71病毒基因特征分析

目的了解河北省不同地区、不同严重程度手足口病病例的病原构成情况及EV71病毒的基因特征。方法采集河北省不同地区的HFMD患者粪便、疱疹液、咽拭子标本进行核酸检测和病毒分离,同时结合所收集的HFMD患病例的居住地、疾病严重程度信息加以分析。选取18株EV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增和核苷酸序列测定和分析,与其它38株各基因型和基因亚型的EV71代表株构建系统发生树。结果2009年河北省HFMD临床诊断病例的EV阳性率为65．13％,其中以EV71为主,占阳性病例的58．0％（752／1296）。秦皇岛、邯郸、保定、邢台地区手足口病例以EV71感染为主,而衡水、沧州等地区则以CA16为主。轻型病例中EV71阳性率为37．74％,重症病例中EV71阳性率为80．64％,死亡病例检测13例,均为EV71阳性。18株EV71分离株的VP114核苷酸同源性为94．9％～99．8％,与C4亚型代表株的VP1区核苷酸同源性最高,为91．9％～99．6％。进化树结果显示,河北省EV71分离株与c4亚型代表株处于同一分支,并在C4a进化分支的不同簇中。结论2009年引起河北省手足口病流行的病原体主要为EV71和CA16。秦皇岛、邯郸、保定、邢台地区手足口病例以EV7I感染为主,而衡水、廊坊、沧州等地区则以CA16为主。EV71是重症病例的主要致病病原体。河北省EV71分离株为c4亚型C4a进化分支。     

2008年深圳地区手足口病病原学调查

目的 研究2008年深圳地区手足口病病原体EV71和CoxA16感染情况,为手足口病的防治提供依据.方法 应用RT-PCR技术检测307例手足口病患儿标本病原体EV71、CoxA16基因,将PCR产物测序,并应用ChstaIW2在线分析软件进行序列分析、进化树分析.结果 不同标本中EV71的阳性率分别为:大便标本24.4%(75/307)、咽拭子为7.8%(24/307)、外周血12.5%(1/8);CoxA16的阳性率分别为,大便13.8%(28/203),咽拭子11.0%(20/181),其中EV71和CoxA16同时为阳性的有3份(0.98%);脑脊液标本未检测到EV71和CoxA16.与标准株BrCr序列比对分析,测序的14例标本中,8例的EV71新出现多个位点变异,其中2例标本的A2528G变异导致氨基酸改变,即N595D,1例标本的A2714G变异引起氨基酸改变,即1658V.进化树分析显示,有2例标本的病毒株与anhui毒株亲缘关系较近,与标准株BrCr及深圳株SHH02-6、SHZH02-40、SHZH03-58等亲缘关系较远;而其余12株与上述毒株亲缘关系较远.根据文献报道的EV71基因分型方法分析,测序的14株EV71基因型为C型.结论 在引起2008年深圳手足口病病原体中相当的比例是EV71,且可能部分是anhui病毒株的入侵.     

2009年徐州地区疑似肠道病毒感染病例病原学研究

目的了解2009年徐州地区肠道病毒感染引起手足口病情况,为手足口病防控工作提供科学依据。方法采用荧光RT-PCR方法对240例临床诊断为肠道病毒感染的手足口病例中的222例肛拭子和咽拭子标本同时进行EV和EV71、CAl6特异性RNA检测,用ELA方法对其中的114例急性期血清标本进行EV71．IgM抗体检测。同时检测健康儿童254份咽拭子和258份血清标本以及密切接触者咽拭子54份标本。结果240例疑似肠道病毒感染者,总EV感染率为72．50％（174／240）,其中EV71感染率为57．92％（139／240）,CoxAl6感染率为9．17％（22／240）,其他EV感染率为5．42％（13／240）。240例疑似肠道病毒感染者中的222份肛拭子标本EV7l-RNA阳性率为45．94％（102／222）、咽拭子EV71-RNA阳性率为25．68％（57／222）,114份急性期血清中EV71．IgM抗体阳性率为86．84％（99／114）。254份健康儿童咽拭子EV7l-RNA阳性率为1．57％（4／254）,未检出CoxAl6-RNA;258份健康儿童血清标本EV71-IgM抗体阳性率是2．71％（7／258）。密接（医护人员）咽拭子54份,EV-RNA检测均为阴性。结论徐州地区手足口病流行主要由EV71型引起。3岁以下儿童流行期间存在被EV71型隐性感染,并产生IgM抗体。成人即使密切接触传染源也不易被感染EV71。疑似病例急性期血清中EV71-IgM抗体检测阳性率最高（86．84％）,其次为肛拭子EV71（45．94％）和咽拭子EV71（25．68％）的RNA检测阳性率。ELA试剂盒用于EV71型感染的早期诊断,具有操作简单快速经济,值得在基层推广。     

157例手足口病病例密切接触者病原学监测结果分析

目的 分析2010年北京市西城区手足口病密切接触者病原学监测结果.方法 收集2010年北京市西城区手足口病暴发、聚集性疫情相关手足口病例密切接触者流行病学信息及病原学检测结果,采用Epi Info3.5.1进行统计分析.结果 157例密切接触者便标本、咽拭子标本手足口病毒核酸检测总阳性率21.0％,其中以7月份最高(...