外源蛋白表达过程中谷氨酸棒状杆菌转录组及代谢物的多变元分析

以谷氨酸棒状杆菌为研究对象,在发酵罐水平30%溶解氧条件下对野生菌及表达EGFP的工程菌进行平行培养,对培养20 h的菌体进行转录组分析,并对不同时间点所取样品进行代谢物检测。利用多变元分析方法分析转录组和代谢物数据,其中主要利用主成分分析法进行关键因素分析,利用正交偏最小二乘法判别分析进行转录组数据分析,继而通过S-plot得到不同溶解氧下的生物标记物(biomarkers),最终找到了8个关键基因。代谢数据分析结果表明ATP、谷氨酸、乙酸、胞内谷氨酸、甲硫氨酸及乳酸是外源蛋白表达的关键代谢物;通过不同时间点代谢物含量变化分析发现外源蛋白表达的代谢变化类似于低氧环境下的代谢变化现象,即糖酵解增强,TCA溢流,回补途径增加,乙酸、乳酸生成增加。通过对比外源蛋白表达工程菌与野生菌的转录组数据及代谢物含量数据,为今后在代谢工程中菌株改造、优化代谢获得高效表达外源蛋白的谷氨酸棒状杆菌表达宿主奠定基础。     

细胞凋亡调控因子BCL-2促进工程酵母合成橙花叔醇

工程酵母菌发酵过程中因氧化胁迫、蛋白质错误折叠等压力致使生产能力降低.该研究发现,在甲羟戊酸途径增强的酵母工程菌中,过表达人源细胞凋亡调控因子B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)和还原型谷胱甘肽合成酶(glutathione synthase,GSH1)编码基因可以促进橙花叔醇的合...     

重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的研究

探讨重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的特性,以期能够通过基因工程和发酵工程技术大规模的生产活性重组藻蓝蛋白。先用甘油作碳源培养重组巴斯德毕赤酵母工程菌,达到一定生物量后,再用甲醇诱导外源重组藻蓝蛋白基因的表达,并测定了甘油浓度、细胞干重、细胞光密度和藻蓝蛋白含量的变化。结果表明:所获得的细胞干重最高达41.93g/L,细胞光密度最高为182.77,藻蓝蛋白的最高产量为61.20mg/L,分泌到胞外的藻蓝蛋白的最高产量为24.32mg/L。该研究为实现藻蓝蛋白的产业化生产奠定了良好的基础。     

蛋白转运组件SecDF对副干酪乳杆菌生长、分泌及黏附特性的影响

SecDF作为Sec蛋白移位酶体系组分之一,对细菌生理功能产生重要影响,但乳杆菌基因组缺失其编码基因。以副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)L14野生菌和携带地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SecDF的L paracasei基因工程菌为研究对象,分析了SecDF对L paracasei L14不同培养条件下生长、菌体分泌和细胞黏附等生理功能的变化。结果表明:在22℃和15℃培养条件下,异源表达SecDF的L paracasei L14菌株对低温的敏感度减弱,菌体的自发自溶率和Triton X-100诱导自溶率均出现下降,细胞表面疏水性明显提高,对HT-29细胞的黏附能力显著增强。此外,SecDF还可以促使L paracasei L14胞外分泌物产生DPP-Ⅳ酶抑制活性。     

共表达HAC1基因对重组毕赤酵母分泌表达葡萄糖氧化酶的影响

通过增强不可折叠蛋白质响应(UPR)信号途径以及研究不同培养温度下的影响,来提高重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。影响毕赤酵母外源蛋白表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力。通过共表达HAC1基因对不可折叠蛋白信号通路进行调控,摇瓶中改造菌株PP-G-HAC1胞外酶活达到161 U/m L,相比于原始重组葡萄糖氧化酶菌株提高了34%。进一步研究不同温度下过量表达HAC1基因对菌株的生长和分泌外源蛋白的影响,菌株PP-G-HAC1在3 L发酵罐中28℃培养,酶活达到1 008 U/m L,胞外重组蛋白质达到14.43 g/L,相比原始菌株在相同条件下提高了3.12倍。     

尿素吸收型工业黄酒酵母单倍体工程菌的构建

氨基甲酸乙酯是黄酒生产中的副产物,具有致癌性。尿素是氨基甲酸乙酯(EC)的主要前体物质,为降低黄酒中EC的含量,通过提高尿素转运蛋白基因DUR3的表达水平,构建了尿素吸收型工业黄酒酵母单倍体工程菌。采用融合PCR技术,将DUR3基因置于强启动子PGK1p后,构建过表达组件"URA3-PGK1p-DUR3-PGK1tURA3",转化工业黄酒酵母单倍体Na(MATa),获得单倍体工程菌Na-uD。通过实验室黄酒发酵,工程菌所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了55.0%,EC含量降低了10.9%,其他理化指标无明显差异。因此过表达DUR3基因的工程菌Na-uD具有"吸收尿素"的能力,能够降低发酵液中尿素的含量,且无外源抗性基因的引入。     

共表达透明颤菌血红蛋白提高脂肪酶在毕赤酵母中的表达

为了克服巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中的溶氧限制,提高外源蛋白的表达量,本文以启动子YPT介导透明颤菌血红蛋白(VHb)在培养过程中组成型表达。同时以启动子AOX1介导的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因作为报告基因,使CALB在甲醇诱导阶段表达。另外,还将绿色荧光蛋白在过氧化物表面表达,将红色荧光蛋白在过氧化物基质中表达以检测信号肽能否定位在相应的位置。最后,将VHb分别在过氧化物酶体表面和基质两个位置表达,以观察表达位置的不同所产生的影响。通过SDS-PAGE和Western Blot分析表明,CALB和VHb在重组菌中成功实现了共表达。在限氧条件下,重组菌株GS115/ExVHb、GS115/VHbSKL的外源蛋白CALB的表达量比对照菌株GS115/CALB分别提高了27.57%和20.52%。这说明VHb与外源基因共表达可以改善酵母在发酵过程中的摄氧情况,提高外源蛋白的表达量。     

Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403谷氨酸脱羧酶的克隆表达、分离纯化及活性研究

谷氨酸脱羧酶(GAD)是功能因子γ-氨基丁酸(GABA)生物合成过程中的重要酶。为了得到一种有高效活性的GAD基因工程菌,克隆到一种GAD基因,来源于微生物Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403。以pET-22b(+)为载体质粒,Escherichia coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的重组GAD过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约54 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明,该重组GAD的转化活性比野生菌株有明显提高,野生菌株经5h细胞转化,反应底物转化率为55.8%,而工程菌20min后转化率达到82.1%,30min后转化可达到98.3%。     

利用淀粉的酿酒酵母基因工程菌研究进展

酿酒酵母是发酵工业的重要微生物，主要用于酒精、啤酒和面包工业。在酿酒酵母中已表达的淀粉酶基因包括α-淀粉酶基因和糖化酶基因。外源淀粉水解酶能在酵母中高效表达并分泌，其主要因素在于：在构建载体时组入强启动子；酿酒酵母中带有合适的酵母受体系统；具有外源淀粉酶蛋白的分泌信号；外源淀粉酶基因的遗传稳定性和生长介质。构建分解淀粉酿酒酵母已取得相当大的进展，但在构建的多数菌株利用糊精及淀粉的能力仍然有限，而且降解速率较慢。构建直接分解和利用淀粉的酵母工程菌，可简化工艺、节省能源和酶制剂、降低成本，有重要的应用前景。(孙悟)     

鲑精蛋白基因工程菌高效表达条件的优化

为了提高鲑精蛋白基因工程菌融合蛋白的表达量,本文对工程菌的发酵培养基组分、培养基初始pH值、发酵种子接种量、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时机、诱导时间等因子进行了筛选。试验结果表明,培养基组分、诱导温度、诱导时机和诱导时间是影响融合蛋白表达量的主要因素。经筛选,最佳发酵条件是以PYJ-2为发酵培养基,37℃下培养3～5h后,以5mmol/L的乳糖诱导工程菌6～8h表达融合蛋白,融合蛋白表达量从18.90%提高到40.10%。