猕猴桃溃疡病菌拮抗菌筛选、鉴定及发酵条件优化

目的:从不同地区猕猴桃根际土壤中筛选拮抗猕猴桃溃疡病菌的菌株,优化其产生抑菌活性物质的发酵条件,为猕猴桃溃疡病的生物防治提供潜在的资源菌。方法:采用平板稀释法从猕猴桃根际土壤中分离获得菌株,采用抑菌圈法筛选拮抗菌;通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析对其进行鉴定;并采用单因素及正交试验优化培养基组分及发酵条件。结果:从土壤中共分离到288株放线菌,其中编号为NA-TXL-1的菌株对猕猴桃溃疡病菌的拮抗效果最佳,采用预防法、治疗法进行盆栽实验,发酵原液的防治效果分别为73.06%、55.62%,初步鉴定该菌株为抗生链霉菌。其最佳发酵配方和培养条件为:乳糖30 g/L、酵母粉3 g/L、NaCl 1 g/L、K_2HPO_4 0.5 g/L、MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L、FeSO_4 0.01 g/L,种子培养基为乳糖-酵母粉培养基,接种量为2%,起始pH值为7.0,发酵原液、上清液、重悬液分别培养5、14、5 d。结论:经鉴定,拮抗菌株为Streptomyces antibioticus。在优化的发酵条件下,该菌株对猕猴桃溃疡病菌具有更好的拮抗效果。     

滤纸片法筛选抑制嗜水气单胞菌群体感应的乳酸菌及抑制作用分析

采用滤纸片法从传统发酵蔬菜中筛选抑制嗜水气单胞菌群体感应的乳酸菌菌株,应用96?孔板法测定其对生物膜的抑制率,光学显微镜和扫描电镜观察其对嗜水气单胞菌生物膜形成的影响,同时以蛋白酶、嗜铁素、群集及泳动为指标研究其对嗜水气单胞菌毒力作用的影响。结果表明：来源于辽宁锦州酸菜的乳酸菌菌株SCT-2对嗜水气单胞菌群体感应有明显抑制作用,当其代谢产物粗提物质量浓度为8?mg/mL时,对嗜水气单胞菌生物膜抑制率为45.16%,光学显微镜下显示菌株SCT-2粗提物可有效抑制嗜水气单胞菌生物膜的形成,扫描电镜结果进一步表明菌株SCT-2粗提物不仅降低了嗜水气单胞菌生物膜的生成量,而且使其生物膜断裂。8?mg/mL的SCT-2粗提物可使嗜水气单胞菌蛋白酶和嗜铁素的分泌量分别减少27.18%和22.11%,对信号分子的降解率为32.27%,且对嗜水气单胞菌的群集和泳动现象抑制明显。经生理生化和16S?rRNA鉴定菌株SCT-2为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。从传统东北酸菜中获得对嗜水气单胞菌群体感应有抑制作用的植物乳杆菌SCT-2,为开发一种抑制嗜水气单胞菌群体感应的乳酸菌生物制剂提供了理论支持。     

传统发酵蔬菜中抑制嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成乳酸菌的筛选与鉴定

目的:从来源于传统发酵蔬菜的乳酸菌中筛选对嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成有抑制作用的菌株。方法:采用牛津杯打孔法筛选乳酸菌菌株,测定其对N酰基高丝氨酸内酯(AHLs)信号分子的降解率。利用96孔板法测定其对生物膜的抑制率,应用光镜和扫描电镜观察其对生物膜形成的影响。最终通过生理生化试验和16S rRNA序列分析鉴定乳酸菌菌株。结果:分离自安徽绩溪酸豆角的菌株AJS2-4对嗜水气单胞菌群体感应有抑制作用,当其代谢产物粗提物质量浓度为4 mg/mL时,对嗜水气单胞菌AHLs的降解率为49.36%,对其生物膜抑制率为32.25%;当其质量浓度达到8 mg/mL时,可使嗜水气单胞菌的AHLs完全降解。该粗提物经121℃处理30 min活性基本不变,蛋白酶处理使其活性完全丧失,可初步判定菌株AJS2-4粗提物中的抑制群体感应活性成分为蛋白类物质,且具有热稳定性。光镜结果显示:菌株AJS2-4粗提物可有效抑制嗜水气单胞菌生物膜的合成。扫描电镜结果显示:菌株AJS2-4粗提物不仅能有效降低其生物膜的生成量,还可使其结构破裂变得疏松。经生理生化和16S r RNA鉴定菌株AJS2-4为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。结论:从安徽绩溪酸豆角中获得1株抑制嗜水气单胞菌群体感应和生物膜形成的植物乳杆菌AJS2-4。     

冷藏鲣鱼优势腐败产胺菌分离鉴定及其致腐产胺能力分析

为探究鲣鱼中优势腐败产胺菌的种类,从冷藏的鲣鱼中筛选出3种优势腐败产胺菌,通过16S rDNA分子鉴定技术对菌株进行鉴定为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）,将鉴定出的优势腐败产胺菌接种至无菌鱼肉中4 ℃条件下贮藏,通过测定菌落总数和挥发性盐基氮（TVB-N）变化,以腐败代谢产物产量因子（Y_TVB-N/CFU）分析3种优势腐败产胺菌对鲣鱼的致腐能力,并通过样品中生物胺的含量比较3种优势腐败产胺菌的产胺能力。结果表明:在贮藏8 d后接种荧光假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌和嗜水气单胞菌组的菌落总数分别达到8.36、8.27和8.13 lg CFU/g,TVB-N值分别为28.21、30.30和31.29 mg/100 g,3种优势腐败产胺菌对鲣鱼的致腐能力大小为嗜水气单胞菌>弗氏柠檬酸杆菌>荧光假单胞菌。接种荧光假单胞菌组、弗式柠檬酸杆菌组和嗜水气单胞菌组的组胺含量分别为196.23、83.43和261.22 mg/kg,3组样品中总生物胺含量为嗜水气单胞菌>荧光假单胞菌>弗氏柠檬酸杆菌。综合比较得出,嗜水气单胞菌对4 ℃冷藏鲣鱼致腐产胺能力最强,本研究增加对冷藏鲣鱼中优势腐败产胺菌种类的了解并提供了部分理论基础。     

乳酸链球菌素与L-乳酸对嗜水气单胞菌的协同抑杀作用

为探讨乳酸链球菌素(Nisin)与L-乳酸对嗜水气单胞菌的协同抑杀作用,分别采用比浊法、活菌计数法、膜电动势探针等检测Nisin与L-乳酸对嗜水气单胞菌(ATCC 35654、CICC 10500两株菌)生长、存活、生物被膜形成以及菌体膜完整性的影响。结果表明,Nisin与低浓度(3.5 mmol/L)L-乳酸协同,显著抑制了两株嗜水气单胞菌的生长,使生长延滞期延长,最大比生长速率下降,成熟期最高活菌数量降低,且抑制效果随Nisin浓度增加而增强。Nisin和L-乳酸对指示菌有协同致死作用,Nisin与L-乳酸协同处理12 h,可显著(P<0.05)降低嗜水气单胞菌活菌数,造成菌体细胞死亡。机理初探表明:低浓度L-乳酸可以使菌株外膜脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)释放,Nisin进一步使菌体膜电动势消散。研究结果为利用Nisin与L-乳酸或二者的产生菌控制水产品中的嗜水气单胞菌提供了理论依据。     

海洋细菌Pseudoalteromonas sp.HL9的筛选鉴定及产磷脂酶B性质

从黄海海泥中筛选产磷脂酶菌株,其中酶活力最高的HL9鉴定为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas).该菌株最佳生长培养基组成为米糠与酵母粉,最佳生长pH 8.0、NaC1质量浓度30 g/L、培养温度25℃.优化后产酶最高发酵条件:发酵培养基配方为10 g/L麸皮和5 g/L鱼粉蛋白胨,NaC120 g/L...     

嗜水气单胞菌(Aeromonase hydrophila)引起人类腹泻的流行病学意义

为了预防和控制嗜水气单胞菌引起疾病的暴发流行，对567例散发性肠道门诊腹泻病人粪便标本进行了分析和对一起食物中毒进行了调查。检出嗜水气单胞菌51株，其中检出含有气溶毒素Aero基因的菌株18株，占35．3％。用流行病学方法对其病原学进行分析，同时针对近几年来腹泻病人嗜水气单胞菌检出率增高的趋势，开展嗜水气单胞菌对人类致病性的研究和疫情监测，提出进一步认识和评价嗜水气单胞菌引起人类腹泻的流行病学意义，以指导对该病的防治工作。     

传统腌渍蔬菜中抑制嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成乳酸菌的筛选

从传统腌渍蔬菜分离的乳酸菌中筛选对嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成具有抑制作用的菌株。采用牛津杯打孔法从21株乳酸菌中筛选出具有抑制活性的6株乳酸菌,其中分离自辽宁大连酸黄瓜的菌株DLH513效果较好。当菌株DLH513粗提物质量浓度为16.0 mg/mL时,对嗜水气单胞菌AHLs信号分子降解率为51.1%,对其生物膜抑制率为40.9%;当粗提物质量浓度为20.0 mg/mL时,可使其AHLs信号分子完全降解。应用不同蛋白酶处理菌株DLH513粗提物后,对嗜水气单胞菌群体感应无抑制作用,表明其粗提物具有蛋白特性;在40～121℃处理30 min,其粗提物仍具有抑制群体感应活性,表明其粗提物具有耐热特征;在pH 3.0～4.5范围,菌株DLH513粗提物表现出抑制群体感应活性,在酸性条件下较稳定。光镜和扫描电镜结果表明,菌株DLH513粗提物对嗜水气单胞菌生物膜形成有显著的破坏作用。经生理生化反应和16S r RNA鉴定菌株DLH513为植物乳杆菌。研究表明植物乳杆菌DLH513可作为革兰氏阴性菌群体感应的抑制剂,以期为研发一种新的用于控制引起食品腐败和食源性疾病的革兰氏阴性菌群体感应的抑制剂提供理论基础。     

一株嗜水气单胞菌的分离鉴定和不同条件对其群体感应AHLs活性的影响

本研究从腐败的大菱鲆中分离得到一株具有群体感应(Quorum Sensing,QS)的细菌,通过生理生化试验、16S r RNA鉴定其为嗜水气单胞菌(Ah-11),采用报告平板打孔法探究其生长阶段N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)活性变化以及环境因素对其分泌的AHLs活性的影响。结果显示,菌株Ah-11能够诱导报告菌株紫色杆菌CV026和根癌农杆菌A136产生颜色反应;菌株Ah-11在生长阶段的AHLs活性随着培养时间的增加呈现先升高后降低趋势;不同碳源的液体培养基对Ah-11分泌AHLs的影响能力由高到低为麦芽糖葡萄糖蔗糖果糖乳糖木糖;Ah-11在弱酸或者强碱条件下AHLs活性较低,p H=8.0时AHLs活性最大;较高浓度的氯化钠不仅会抑制Ah-11的生长,同时也抑制其AHLs的分泌,0.5~1.0 g/100 g的氯化钠质量浓度可以增强Ah-11的AHLs活性;菌株Ah-11分泌AHLs的最适温度为28℃,高温和低温都会影响其AHLs的分泌。研究证实细菌的群体密度和外界环境因素能够调控嗜水气单胞菌AHLs的分泌。     

齐口裂腹鱼肠道气单胞菌的分离鉴定

本研究从健康齐口裂腹鱼肠道内分离到3株气单胞菌株,采用单重PCR及多重PCR技术进行鉴定。结果表明,16S rRNA扩增长度为350bp,与Gen Bank数据库中的基因序列进行比对发现其与亚洲地区已报道的同类基因片段相似度均达到了90%以上。气单胞菌气溶素基因(aer)和嗜水气单胞菌溶血素基因(AHH)扩增长度分别为300bp和130bp,而温和气单胞菌溶血素基因(ASA)未扩增到条带。通过基因序列比对发现,aer和ASA与已报道的嗜水气单胞菌的对应的基因片段相似度均达到90%以上。结论,从健康齐口裂腹鱼肠道内所分离的3株气单胞菌菌株,均为致病性嗜水性气单胞菌。     

一株广谱拮抗细菌的鉴定、发酵条件及其抗菌物质性质

[目的]菌株S46是一株对多种植物病原菌有较好拮抗作用的细菌,为有效防治植物病害,进行菌种的鉴定、发酵培养工艺及抗菌物质性质研究。[方法]通过培养特性、形态特征、生理生化特性和16S rDNA同源性序列分析明确菌株的分类地位;通过发酵单因素实验和各因素正交试验确定菌株的发酵工艺;通过热、酸碱、紫外和日光等处理测定明确活性物质的稳定性。[结果]鉴定菌株S46为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli),其对多种植物病原菌有拮抗作用,最适发酵培养基配方为大豆粉10g/L,玉米粉15g/L,蔗糖15g/L,磷酸氢二钾1 g/L,酵母粉5g/L;最适培养条件为接种量6%,发酵时间72 h,装瓶量30 mL/250mL,初始pH值7.0,转速180 r/min,温度30℃。该菌株发酵液有较好的热稳定性、紫外光和日光稳定性,但对强酸、强碱和有机试剂都较敏感。[结论]为植物病害的防治提供新的生物防治资源。     

嗜冷普鲁兰酶产生菌NX-1的筛选及产酶条件优化

从南极海泥样品中分离得到一株产嗜冷普鲁兰酶的假交替单胞菌菌株（Pseudoalteromonas sp.）NX-1。以菌株NX-1为研究对象,对菌株NX-1产嗜冷普鲁兰酶的酶学性质进行了初步研究,并通过单因素试验和正交试验对其产嗜冷普鲁兰酶的最佳培养条件进行研究。结果显示,菌株NX-1所产嗜冷普鲁兰酶的最适作用温度为20 ℃,最适作用pH值为7.0,在最适条件下,酶的半衰期约为120 min;菌株NX-1的最适产酶条件为：培养温度20 ℃、接种量1%、培养基各组分含量分别为蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl2 0.5 g/L、Na2HPO4 6 g/L。优化后菌株产酶可达25.172 U/mL,相比优化前提高25.1%。     

降解嗜水气单胞菌群体感应AHLs信号分子的乳酸菌筛选及淬灭作用

AHLs是一类介导革兰氏阴性菌群体感应的氮酰基高丝氨酸内酯类信号分子,从自然界中寻找对AHLs具有降解活性的乳酸菌,探究应用乳酸菌群体感应抑制剂控制致病菌的新途径。采用96孔板法从传统发酵食品和海水鱼肠道中分离的156株乳酸菌中初筛到56株对嗜水气单胞菌群体感应AHLs具有降解作用的菌株,初筛率为35.90%。采用琼脂扩散法对初筛菌株复筛得到12株降解活性较强的乳酸菌,其中来源于牙鲆肠道的菌株YP 4-1-1降解活性接近100%。GC-MS分析表明:菌株YP 4-1-1对嗜水气单胞菌C4-HSL和C6-HSL信号分子的降解活性分别为98.31%和81.81%。经生理生化和16S rRNA序列分析确定菌株YP 4-1-1为清酒乳杆菌。菌株YP 4-1-1酶解AHLs的活性来源于其粗细胞提取物的可溶性部分,可能是一种AHLs-酰基转移酶或氧化还原酶。YP 4-1-1粗提物对紫色杆菌CV026和嗜水气单胞菌的MIC分别为2.0 mg/mL和4.0 mg/mL,3个不同亚MIC(0.25 MIC,0.50 MIC,0.75 MIC)对紫色杆菌素的降解作用具有剂量依赖性。在体外共培养试验中,菌株YP 4-1-1可减弱嗜水气单胞菌溶血性、蛋白酶、DNA酶和嗜铁素等毒力因子的表达,并对其群体感应的群集和泳动行为具有抑制活性。本文从自然生态环境中获得对革兰氏阴性菌AHLs具有降解活性的乳酸菌,为研发乳酸菌生物制剂控制革兰氏阴性菌导致的水产动物疾病奠定理论和应用基础。     

茶多酚对嗜水气单胞菌致病力的抑制作用

针对嗜水气单胞菌污染水产品所致动物感染和消费者食源性疾病等问题,筛选能够抑制嗜水气单胞菌致病力的天然产物茶多酚。溶血试验表明茶多酚对气溶素溶血活性具有直接抑制作用,通过荧光热漂移和七聚体形成试验分析其作用机制。结果表明,茶多酚虽在128μg/mL以下不抑制嗜水气单胞菌的生长,但能在1～8μg/mL直接抑制其主要毒力蛋白气溶素的溶血活性。荧光热漂移和七聚体试验发现,茶多酚通过与气溶素直接结合,降低了气溶素七聚体的形成并抑制其活性。细胞试验结果表明,4～8μg/mL茶多酚能对气溶素导致的人肺癌上皮细胞死亡具有显著的保护作用。此外,50 mg/kg茶多酚治疗可使斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型的存活率提高至60%。综上,茶多酚通过直接与气溶素结合,抑制气溶素形成功能性七聚体而降低其活性,从而显著降低嗜水气单胞菌的体内、外致病力。研究结果提示茶多酚可作为抗生素替代或辅助药物用于治疗嗜水气单胞菌相关感染。     

澳门市售即食海产中嗜水气单胞菌的污染情况及其致泻性毒力基因分析

目的 对澳门地区市售即食海产品进行嗜水气单胞菌的分离鉴定及致泻毒力基因检测。方法 从甲壳类、鱼类、贝类、头足纲类共4类80份样本中分离嗜水气单胞菌,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法检测菌株16S rRNA基因进行菌株鉴定,使用多重PCR测定分离菌株4种致泻毒力基因。结果 澳门地区市售的80份即食海产品中,有57份样本(71.25%)分离出嗜水气单胞菌,其中6份(10.53%)带有致泻毒力基因。在6株携带毒力基因的嗜水气单胞菌中,4株携带2种毒力基因,其余的只携带1种毒力基因。其中携带alt有4株(7.02%)、aerA 3株(5.36%)、ast 2株(3.51%)及act 1株(1.75%)。即食海产品的4个分类与嗜水气单胞菌检出率,经χ2检验分析差异无统计学意义(P>0.05)。此外,在15个经烹煮过样本中分离鉴定出13株嗜水气单胞菌。结论 嗜水气单胞菌有较高的检出率可能是因不当包装、运输及处理过程中受到交叉污染。致泻性毒力基因检出率不高,但存在嗜水气单胞菌的致病风险。     

1株耐高温高盐生香酵母的选育及特性分析

以豆瓣酱为材料筛选出86株产酯菌,以期从中得到1株耐高温高盐生香酵母菌。通过耐高温、耐高盐和产酯能力试验,获得1株耐高温高盐生香酵母菌PX-8,其在温度高达40℃和Na Cl质量浓度高达180 g/L的条件下能正常生长。经过26S r DNA鉴定,确定菌株PX-8为鲁氏结合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。经过产酯发酵条件优化试验,菌株PX-8的最佳产酯培养条件为:葡萄糖80 g/L,酵母粉40 g/L,KH_2PO_41 g/L,Mg SO_40.5g/L,p H 6.0,32℃,150 r/min,发酵培养6 d,总酯产量高达2.615 g/L;在高温高盐条件下(发酵培养温度为40℃,盐质量浓度为180 g/L),发酵培养21 d,总酯产量可达1.518 g/L。     

嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对中华绒螯蟹免疫因子的影响

为检测嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对中华绒螯蟹免疫机能的影响,在基础饲料中分别添加0(对照)、1、3和6 g/kg的嗜水气单胞菌微胶囊疫苗冻干粉(菌含量为1.5×1012cfu/g),制成颗粒饲料后投喂中华绒螯蟹7 d;然后3个试验组改投对照组饲料.在停喂试验组饲料后第0、1、2和3周,测定中华绒螯蟹血清POD、ACP、ALP、NOS活性和肝胰腺中的SOD与LSZ活性.结果显示:一定剂量的嗜水气单胞菌微胶囊疫苗能显著增强中华绒螯蟹血清POD、ACP、ALP、NOS和肝胰腺中的SOD与LSZ活性(P＜0.05);且以6 g/kg饲料的添加量的免疫刺激效果最佳.     

枯草芽孢杆菌抗菌脂肽对嗜水气单胞菌抑菌效果

为了研究Bacillus subtilis fmbJ 产生的抗菌脂肽对嗜水气单胞菌的抑菌效果,采用抑菌圈法测定抗菌脂肽对嗜水气单胞菌的最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC),并从其对嗜水气单胞菌形态结构、膜通透性来探讨其抗菌作用。结果表明,嗜水气单胞菌对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽具有较高的敏感性,最小抑菌质量浓度(MIC)为20μg/mL,最小杀菌质量浓度(MBC)为32μg/mL;该抗菌脂肽导致嗜水气单胞菌细胞膜通透性增加,使细胞内一些离子以及大分子的蛋白质和核酸泄漏到细胞外,从而引起细胞的死亡;显微结构影响的研究表明,该抗菌脂肽还可以造成嗜水气单胞菌细胞壁缺失、鞭毛散失、胞内物质模糊不清等现象,抑菌效果较明显,可用于嗜水气单胞菌感染引起的水生动物疾病预防和控制。     

离子注入以及响应面法选育L-组氨酸产生菌

以一株枯草芽孢杆菌Y1为出发菌株,以90个单位,每单位注入量为2.5×1013/cm3的N+进行诱变。经筛选和摇瓶发酵培养最终获得一株产酸量较高遗传性状稳定的突变株Y-217(6-MPR,transketolase-,histidase-),产酸量为2.57g/L,由原先的1.76g/L增长到2.57g/L。在单因素实验的基础上,利用响应面法对菌株的发酵条件进行进一步优化,得出最佳发酵条件为:豆饼粉14g/L,葡萄糖10g/L,硫酸铵1.5g/L,玉米粉11.2g/L,KH2PO4 1.5g/L,Mg SO4·7H2O 1.8g/L,碳酸钙5g/L,优化后菌株的产酸能力由2.57 g/L增长到4.61g/L.     

锁掷孢酵母产胞外多糖发酵条件优化

为进一步提高酵母菌产酵母胞外多糖（EPS）的能力,该研究以近粉红锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）PFY-Z1为出发菌株,筛选出其最适产糖发酵培养基,并以此为基础,联合应用单因素试验、Plackett-Burman（PB）试验和中心组合设计（CCD）试验,优化菌株产EPS的最佳发酵条件。结果表明,菌株最佳培养基配方为葡萄糖15 g/L,硫酸铵15 g/L,硫酸镁1.8 g/L,氯化钙0.28 g/L,磷酸氢二钾0.24 g/L,氯化钠0.6 g/L。菌株最佳培养条件为培养温度28 ℃、摇床转速210 r/min、接种量5%、装液量100 mL/250 mL、培养时间6 d,培养基初始pH值5.10条件下,EPS含量最高,为（4.60±0.13）g/L,是优化前的1.40倍。该研究为今后利用S. pararoseus PFY-Z1产胞外多糖奠定了基础,同时也为酵母菌EPS的工业化制备和生产提供了理论依据。