PCR技术检测RH株弓形虫组织内感染的实验研究

目的：建立敏感，特异的聚合酶链反应（PCR），以检测组织内弓形虫感染。方法：优化PCR反应关键步骤的条件。以相同的B1引物扩增相近的病原体判断其特异性，扩增倍比稀释的DNA检测其灵敏度，并以PCR法检测实验鼠肝，血中DNA的动态变化。结果与免疫组化法进行比较。评价其检测生物学样本的可行性。结果：实验建立的PCR技术的灵敏度能达到检测出一个虫体的DNA，且特异性强，不扩增鼠DNA，人DNA，隐孢子虫，卡氏肺孢子虫，鼠疟原虫的DNA，检测实验感染小鼠血，肝脏样本，在感染后2天，3只鼠血样本PCR结果阳性，3只小鼠肝标本2只阳性；感染后3天至濒死前后有小鼠检测结果均阳性；血样本阳性检出率100%（11/11），肝脏组织样本阳性检出率81.8%(9/11)。结论：PCR方法是一种敏感，特异快速的诊断方法，可用于诊断血和肝脏组织内的弓形虫。     

地高辛标记探针对泰泽氏菌PCR结果的鉴定

用泰泽氏菌可疑的小鼠肝组织匀浆腹腔注射SCID鼠和 BAL B/c小鼠肝、肾、肺、脾的 DNA,PCR扩增 ,核酸杂交。根据泰泽氏菌的保守序列合成引物扩增泰泽氏菌的基因组 DNA,建立了泰泽氏菌的套式 PCR方法 ,并将此方法应用于 SCID小鼠和 BAL B/c小鼠以及可疑样品的检测 ,其中 SCID小鼠肝、肾组织和 BAL -B/c小鼠的肝组织及可疑组织得到特异性扩增带 ,其他动物样品和组织 DNA均为阴性结果。进一步对该DNA片段进行核酸杂交 ,结果证实 ,凡 PCR套式扩增为阳性的 ,均有杂交带。因此 ,泰泽氏菌套式 PCR方法在实际检测中是切实可行。…     

弓形虫病基因诊断的动物实验研究

目的：建立敏感、特异、稳定的PCR法，用于弓形虫病诊断。方法：选择与合成引物并确立最佳扩增条件，用PCR法检测实验感染鼠血液中弓形虫DNA，并与ELISA法检测循环抗原(CAg)作比较。结果：该PCR检测弓形虫DNA法特异性强，对其他7种寄生虫DNA均不扩增；敏感性高，可检测到0．2pg DNA；检测急性感染弓形虫小鼠血液最早于感染后第2天出现用性，与ELISA法查CAg比较。PCK检测弓形虫DNA法阳性出现时间早、检出率高。结论：该PCR法可应用于弓形虫感染的早期诊断。     

检测弓形虫的PCR法和ELISA法的比较

目的:建立快速、敏感、特异的PCR方法,用于检测弓形虫感染。方法:选择弓形虫B1基因194bp片段作为扩增模板,优化反应条件,并测定其敏感性和特异性;以104弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠,用PCR法检测感染动物全血DNA,并与ELISA法检测血清IgM进行比较。结果:本实验中,PCR方法的检测阈值为0.2pg弓形虫DNA,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。用PCR法检测感染动物全血DNA,感染后第2d即可测出阳性,总阳性数为1(313/15);而ELISA法检测血清IgM则到感染后第6d才测出阳性,总阳性数为2(2/15)。经统计学检验,二者存在显著差异(P<0.05)。结论:PCR是一种快速、敏感、特异的检测方法,可用于弓形虫病的早期诊断。     

Chelex-100法快速提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA

目的探索一种快速、高效提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA的方法。方法采用Chelex-100法提取14株革兰氏阳性杆菌的基因组DNA,利用PCR技术扩增16SrRNA基因及4个单拷贝管家基因以评价提取核酸的质量。结果 Chelex-100法能够在20min内从革兰氏阳性杆菌中提取出基因组DNA,所提取的DNA可直接用于PCR扩增。所有菌株的16SrRNA基因及棒状乳杆菌的4个单拷贝管家基因均扩增成功,PCR产物经电泳检测目的条带清晰特异,与预期目的片段长度相符。结论 Chelex-100法具有快速、高效、安全、经济的特点,采用这种方法提取的革兰氏阳性杆菌的基因组DNA可直接作为PCR扩增的模板。     

实验小鼠弓形虫检测方法的建立和应用

目的 建立小鼠弓形虫抗体检测方法。方法 制备抗原片和可溶性抗原，免疫小鼠制备阳性对照血清，确定了IFA和ELISA检测方法的最适工作条件。根据弓形虫B1基因序列，合成一对寡聚脱氧核糖核苷酸片断，建立PCR检测体系。结果 与IHA法相比较，ELISA、IFA的抗体检出率均显著高于IHA，抗体滴度分析，ELISA抗体滴度高于1FA法。对弓形虫感染鼠不同组织进行PCR检测，可检出特异性扩增条带。结论 建立的IFA和ELISA检测方法具有灵敏度高、重复性好，结果判定明确等优点，是比较有效的监测方法。建立了弓形虫PCR检测体系，经对弓形虫DNA及病鼠各组织的初步检测，证明本PCR体系具有较高的敏感性和特异性。     

检测藻类16SrDNA特异性片段在溺死诊断中的应用

目的建立藻类16SrDNA特异性片段扩增方法,探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法35只实验兔随机分组：生前入水
组（溺死组）15只,死后入水组（空气栓塞致死后入水）15只,对照组（空气栓塞死后不作处理）5只;微波消解-真空抽滤-电镜扫描
法检测过的20例水中尸体肝脏样本20份（硅藻阳性14份,阴性6份）。7种已知藻（直链藻、菱形藻、针杆藻、舟形藻,铜绿微囊
藻,小环藻,小球藻）作为对照。提取组织样本及藻类DNA,扩增产物银染显带。结果生前入水组肺、肝、肾检出率分别为
100%,86%,86%;死后入水组肺、肝、肾检出率分别为13%,0%,0%。对照组肺、肝、肾藻类未检出。生前入水组与死后入水组各
种脏器中藻类检出率差异显著（P<0.05）。20份经微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测的水中尸体肝脏样本中,使用本方法15
份样本结果为阳性（包括1份硅藻阴性样本）。7种藻类DNA扩增结果为阳性。结论本文所建立的PCR法检测藻类16SrDNA
灵敏度高,可对多种溺死藻类同时检测,有较好的应用前景。
     

弓形虫529 bp重复序列基因的PCR阳性质控质粒的构建

目的：构建含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒,为基于该基因的弓形虫病分子生物学诊断建立标准阳性对照品。方法：以弓形虫RH株基因组DNA为模板,对529 bp的基因片段进行扩增,将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转入大肠埃希菌DH-5α中,提取重组质粒PCR及测序鉴定。以弓形虫529 bp基因为靶基因设计的检测引物,扩增弓形虫基因组DNA及质粒DNA。结果：PCR产物序列与GENBANK中弓形虫529 bp基因序列完全一致。以弓形虫基因组DNA和质粒DNA为模板,成功扩增出预期的249bp基因片段。结论：成功构建可作为标准阳性对照品的含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒pMD-18-Tox,为经济实用的弓形虫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

弓形虫(Toxoplasma gondii)的PCR检测方法在笼养猕猴群中的应用

目的建立快速、灵敏、特异及检测结果易判断的PCR方法，并应用于大规模猕猴种群的弓形虫常规检测中。同时比较巢式PCR和单一PCR的一致性。方法根据弓形虫保守基因p30（SAG1）设计了内、外两对进行巢式PCR扩增以及B1基因设计一对引物进行单一PCR扩增，将DNA样本进行10倍倍比稀释，以检测巢式PCR反应的灵敏度；并对医学生物学研究所自繁猕猴共150只进行了弓形虫检测。结果巢式PCR检测法检测限度可达10^-3ng/uL，而且方法特异。两种PCR法检测结果基本一致，其中巢式PCR检测阳性率（10％）稍高于单一PCR检测阳性率（8．67％）。结论巢式PCR和一次PCR方法都可应用于猕猴弓形虫的常规检测中，并提示巢式PCR比单一PCR更敏感、检出率更高。     

以dotA基因为靶标的LAMP法快速检测嗜肺军团菌

目的建立一种简便、高效、特异、灵敏的快速检测军团菌肺炎致病原-嗜肺军团菌的方法。方法本研究分析了NCBI数据库中嗜肺军团菌IVB型分泌系统的序列,经过筛选建立了以dotA基因为靶标的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测法。为了验证该法的特异性,提取了约旦军团菌、马氏军团菌、沙门菌、不同血清型的嗜肺军团菌基因组DNA进行检测;为了验证该法的灵敏度,对梯度浓度的阳性模板进行了检测,并与普通PCR对比;最后还将该法实际应用于环境水样的检测。结果本法可于30 min内完成扩增;扩增产物电泳呈现LAMP特有的梯形条带,酶切产物的片段大小符合理论值;阳性产物中可见白色沉淀,加入溴乙锭后在紫外光下可见明亮的荧光,阴性产物无此现象。结论该dotA-LAMP嗜肺军团菌检测法的特异性好,灵敏度高于普通PCR,可在简易的实验环境中快速、特异、灵敏、直观地检测出嗜肺军团菌,具备现场检测及基层推广的应用潜力。