自制辅助装置完成超声微泡介导pEGFPC1-Akt1基因转染

目的初步探讨超声微泡介导基因转染的可行性.方法 自制辅助装置,联合应用超声辐射和SonoVue超声微泡介导pEGFPC1-Akt1基因转染293FT细胞,用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报告基因,转染后荧光显微镜下计数细胞转染率.实验分4组:A组,单纯质粒组;B组,质粒+微泡组;C组,质粒+超声组;D组,质粒+超声+微泡组.结果自制辅助装置制作成功,符合实验要求的条件.转染结果为 A组和B组未见荧光表达,C组转染率约为4.26%,D组转染率为34.56%,D组转染率高于C组(P<0.05).结论 使用自制辅助装置,联合应用超声辐射和微泡法能够有效介导pEGFPC1-Akt1基因转染.     

兔骨骼肌钝挫伤恢复过程中碱性成纤维细胞生长因子的变化及按摩的干预作用

目的：研究新西兰兔股四头肌经重物外力损伤后,在肌组织损伤修复过程中,按摩对肌肉组织的病理修复、超声影像学观察以及对碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）的影响,探讨按摩促进肌肉损伤修复的作用机制。方法：健康成年雄性新西兰大白兔 32 只,体质量（2.0±0.5） kg,按随机抽样法分为正常对照组（A 组,n=4）和模型组,模型组分为按摩前对照组（B组,n=4）、自然恢复组（C 组,n=12）和按摩组（D组,n=12）。A 组实验动物不作任何处理,作为正常对照;B、C、D组实验动物用自制打击器制备兔右后肢股四头肌损伤模型。C 组不予按摩,D 组于制模后第 5天开始按摩。C、D 组于伤后第7、14天及第21天各取4只实验动物股四头肌样本,免疫组化学方法检测bFGF蛋白表达,HE 染色观察其组织病理变化,微泡超声影像技术检测制模后第7、14天的组织坏死情况。结果：按摩干预后,C组和D组比较,第7天bFGF表达量Ｄ组＞Ｃ组（P=0.016）,而在制模后第14、21天bFGF表达量C组均﹥D组（P=0.000,P=0.020）。超声微泡造影及HE染色显示,D组与C组比较,损伤部位较轻,血供较丰富,坏死区明显减轻且血管恢复较快。结论：按摩可有效防止肌细胞的萎缩、退变及坏死,为损伤区域提供丰富血供,促进血管生成,其利于损伤修复及新生血管形成的机制可能与bFGF有关。     

微泡造影剂结合超声介导一氧化氮合成酶基因转染血管平滑肌细胞

目的 探讨微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因转染体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的可行性.方法 实验分为A、B、C、D、E5组,分别为空白对照组、单纯质粒浸泡组、质粒+微泡造影剂组、质粒+超声辐照组、质粒+超声辐照+造影剂组.用重组真核表达载体pcDNA3.1- eNOS经微泡造影剂及超声辐照介导转染体外培养的大鼠VSMCs,辐照条件为超声探头频率为10 MHz,机械指数为1.9,辐照时间为10 min,重组真核细胞表达载体pcDNA3.1-eNOS 5μg/mL.辐照48 h后,采用RT-PCR、Western blot及免疫组化检测VSMCs内eNOSmRNA和蛋白的表达.结果 RT -PCR检测E组eNOS mRNA的表达最显著,积分吸光度(IA)比值为(91.11±3.41)％,B、C、D组也有少量表达,IA比值分别为(26.10±1.32)％、(31.42±2.43)％、(35.05±2.25)％,与E组相比均P＜0.05.蛋白印迹分析eNOS蛋白表达,A组有极少量表达,B、C、D组也有少量表达,IA比值分别为(22.12±1.33)％、(25.42±2.41)％、(33.11±3.11)％,而E组表达最明显,IA比值为(84.22±9.22)％,与各组相比均P＜0.05.结论 超声辐照结合微泡造影剂能显著提高eNOS基因在VSMCs的转染效率,提高细胞内一氧化氮合成酶的表达.     

超声联合微泡造影剂携p53基因转染宫颈癌HeLa细胞的实验研究

目的 探讨超声联合微泡造影剂介导野生型p53(wtp53)基因转染宫颈癌HeLa细胞的可行性、效率性及作用效果.方法 以前期实验所筛选的超声辐照参数(300 kHz,0.5 W/cm~2,30 s)为实验条件,将HeLa细胞分为质粒组(A组)、质粒+超卢组(B组)、质粒+超声+微泡组(C组)、质粒+脂质体组(D组)、空白对照组(E组),分别进行处理.转染24～48 h后,收集各组细胞,荧光显微镜观察细胞基因转染效率、RT-PCR检测p53 mRNA表达,流式细胞仪检测细胞周期,M1Tr检测细胞增殖抑制情况.结果 荧光显微镜下见C、D组均有较多绿色荧光蛋白表达的细胞(转染率分别为14.15%和10.86%),B组仅有极少的荧光细胞(0.81%);A组和E组无荧光表达;RT-PCR结果 显示,C组和D组均可见特异性p53电泳条带,C组的电泳条带的光密度比值高于D组(P<0.05);流式细胞仪测细胞周期展示,转染野生型p53基因能使细胞周期出现明显的G_1期阻滞,C、D组与E组相比差异有显著性(P<0.05);MTT测定结果 显示c组细胞生长明显受抑,且随时间的延长,抑制程度逐渐增强.结论 适当浓度的微泡和优化的超声辐照条件可增强基因转染效率,野生型p53基阒能使HeLa细胞产生G_1期阻滞,抑制宫颈癌细胞生长.     

超声微泡促腺病毒载体转染MDR1基因效率的体外实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂在体外促进腺病毒载体介导的MDRl基因转染兔骨髓单个核细胞的效率,并初步探讨其安全性.方法 根据是否加入超声微泡造影剂和超声辐照将分选的兔骨髓单个核细胞分为常规培养组(A)、腺病毒MDRl基因转染组(B)、腺病毒MDRl基因转染+超声辐照组(C)、微泡造影剂+腺病毒MDRl基因转染组(D)、微泡造影剂+腺病毒MDRl基因转染+超声辐照组(E).收集各组细胞,应用RT-PCR法、流式细胞技术等分别从基因、功能及细胞生物学特性等方面检测外源性MDR1基因在骨髓单个核细胞内的功能性表达及安全性.结果 收获高滴度的Ad5-MDR1腺病毒载体并成功制备腺病毒微泡造影剂;RT-PCR结果 显示,除A组外其余4组在194 bp处均观察到特异性MDR1电泳条带,证实外源性MDR1基因通过腺病毒载体整合到细胞基因组中,且E组MDR1电泳条带的光密度比值明显高于B、C、D组(P<0.05);柔红霉素排出实验证实外源性MDR1基因表达产物P-gP有药物外排泵功能,且E组P-gp阳性率最高(P<0.05),而柔红霉素阳性率显著降低;一定强度的超声辐照及微泡造影剂对骨髓单个核细胞的细胞周期无明显影响.结论 低频超声波击碎微泡造影剂,能促进以腺病毒为载体介导的外源性MDR1基因转染兔骨髓单个核细胞的效率,且安全可行.     

超声联合携抗ICAM-1微泡的双靶向载体系统增强基因转染受损内皮细胞

目的:探讨超声联合携抗细胞间黏附分子(ICAM)-1阳离子微泡的双靶向载体系统介导基质细胞衍生因子(SDF)-1α基因转染受损内皮的效果。方法:实验分组,A组:携SDF-1α基因抗ICAM-1阳离子微泡;B组:携SDF-1α阳离子微泡;C组:空白对照。体外实验:人白细胞介素-1β刺激制备大量表达ICAM-1的血管内皮细胞模型,各组联合超声辐照介导基因转染后测定基因转染率、基因和蛋白表达情况。体内实验:结扎冠状动脉前降支制备兔心肌梗死模型,超声辐照介导基因转染后取心肌组织,Western blot检测各组心肌SDF-1蛋白的表达情况,RT-PCR检测各组SDF-1 mRNA的表达情况。结果:无论是体外实验还是体内实验,A组:携SDF-1α基因抗ICAM-1阳离子微泡组超声辐照后的基因转染率、hSDF-1α基因mRNA表达和hSDF-1α蛋白表达情况均高于其他各组。结论:超声联合携抗ICAM-1微泡的双靶向载体系统能增强SDF-1α基因转染受损内皮细胞。     

超声微泡联合pDsRed2-N1-CD/UPRT融合自杀基因对肺癌细胞的杀伤作用

目的：探讨超声微泡联合pDsRed2-N1-CD/UPRT融合自杀基因在肺癌A549细胞中的表达水平及其杀伤作用。方法：提取前期构建的pDsRed2-N1-CD/UPRT质粒,转染肺癌A549细胞,分为A组：空白对照组;B组：脂质体+质粒;C组：超声照射+脂质体+质粒;D组：超声照射+微泡+脂质体+质粒。荧光显微镜下观察质粒的转染情况,免疫细胞化学法及Western blot法检测胞嘧啶脱氨酶（Cytosine deaminase,CD）、尿嘧啶磷酸核糖转移酶（Uracil phosphoribosyltransferase,UPRT）在各组细胞中的蛋白表达水平,MTT法检测超声微泡联合CD/UPRT质粒对肺癌A549细胞的生长抑制作用。结果：超声微泡能提高A549细胞中CD/UPRT质粒转染率达（54.8±2.59）%。免疫细胞化学与Western blot结果均显示联合超声微泡后CD、UPRT蛋白表达明显增加（P<0.05）。在前体药物５－氟尿嘧啶（５－Fluorouracil,5-FU）作用下,CD/UPRT质粒转染对细胞有一定的杀伤作用,联合超声微泡后,细胞的生长抑制率明显升高（P<0.05）。结论：超声微泡能提高CD/UPRT质粒在肺癌A549细胞中的转染率及CD、UPRT在细胞中的蛋白表达,从而增强CD/UPRT对肺癌A549细胞的杀伤作用。     

超声微泡造影剂介导pEGFP-N_1质粒转染HGFs的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡介导pEGFP-N_1质粒转染人牙龈成纤维细胞的可行性、优化转染的条件及转染效率.方法 体外原代培养HGFs.以pEGFP-N_1质粒为报告基因,微泡造影剂为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N_1转染HGFs.实验组分为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组按不同的转染条件分成亚组.转染48 h后倒置荧光显微镜下观察GFP的表达,MTT检测HGFs活性.结果 超声微泡介导pEGFP-N_1质粒对HGFs的转染效率明显高于其他实验组(P<0.05).优化转染条件后,频率300 KHz,声强1.5 W/cm~2,连续波,辐照时间60 s,微泡浓度10%,质粒浓度6.67 μg/ml时,转染率较高.结论 在一定条件下,超声微泡造影剂能够促进外源基因对HGFs的转染.     

应用UTMD技术联合脂质体转染介导人肝癌细胞表达miRNA-122的研究

目的:探讨应用超声靶向微泡破坏(UTMD)技术和脂质体介导质粒miRNA-122在人肝癌HCCLM3细胞表达后细胞增殖、迁移和侵袭能力以及耐药性的变化。方法:构建pLMP-miR-122质粒。将对数期肝癌细胞株HCCLM3分组转染:A组(对照组)、B组(脂质体+质粒组)、C组(超声微泡+质粒+超声辐照组)、D组(脂质体+超声微泡+质粒+超声辐照组)。采用荧光定量PCR法检测pre-miRNA-122表达水平比较各组细胞转染效率,以CCK-8法检测细胞活性,应用划痕实验和Transwell实验检测细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质免疫印迹检测蛋白表达情况。结果:HCCLM3细胞miRNA-122过表达后,细胞的增殖、迁移、侵袭能力与对照组比较均显著受到抑制,且对化疗药物敏感性增加,抗凋亡蛋白Bcl2表达下调。结论:UTMD技术结合脂质体转染法可以提高质粒转染人肝癌细胞HCCLM3效率,并且miRNA-122上调后可以明显抑制HCCLM3增殖、迁移和侵袭能力,有可能成为肝癌基因治疗的新靶点。     

FKBP12.6基因转染对心衰犬心功能及心肌病理变化的影响

目的 探讨白蛋白微泡介导的pcDNA3.1-FKBP12.6质粒转染对心衰犬心功能及心肌病理变化的影响.方法 28只快速起搏心衰犬分为2组.转染组以白蛋白微泡为载体,在超声破坏下将人工合成的pcDNA3.1-FKBP12.6质粒转染入心肌,以不含质粒的微泡作为对照组.两组又分为转染后4 d(转染Ⅰ组)和14 d(转染Ⅱ组).分别在起搏器安置前、转染前、转染后,采用超声测量左室内径、心功能评价FKBP12.6基因对心衰的治疗效果.通过HE染色和透射电镜观察心肌病理变化.应用RT-PCR检测各组FKBP12.6基因的表达情况.结果 超声微泡介导的转染可以提高心肌FKBP12.6 mRNA的表达.心肌病理显示转染组病变轻于对照组,而且未转染组病变进一步恶化.转染组EF、FS在第4天可见明显好转,并在14 d时保持稳定,但一直低于正常水平.在第4天时转染组LVEDD与对照组无变化,而LVEDV下降(P=0.04),在14 d时两指标与对照组比较均缩小(LVEDD和LVEDV的P值分别为0.012和0.005).结论 通过超声微泡介导转染FKBP12.6基因可以改善心脏功能,逆转心肌重塑,减轻心肌病理变化.     

超声微泡介导H-FABP基因改善慢性心衰大鼠的心功能

目的 研究超声靶向破坏微泡(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)技术转染H-FABP基因对心肌梗死后心功能的影响.方法 通过结扎成年雄性Wistar大鼠46只,体质量(220±20)g,冠状动脉前降支建立心肌梗死模型.于心肌梗死8周后,将存活的31只心衰大鼠...     

超声微泡介导肝细胞生长因子促进大鼠梗死心肌血管新生

目的探讨超声靶向破坏微泡介导肝细胞生长因子(HGF)促进大鼠梗死心肌血管新生的可行性。方法将40只Wistar大鼠制备成心肌梗死模型后随机分为4组:(1)HGF 超声 微泡组(HGF US/MB);(2)HGF 超声组(HGF US);(3)HGF 微泡组(HGF MB);(4)单纯手术组(SA)。于基因转染后14d处死各组大鼠,采用免疫组织化学法(IHC)检测缺血心肌周围CD34表达,并在显微镜下计数心肌内新生微血管密度(MVD)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌组织内HGF蛋白表达情况,并对心肌内HGF含量与MVD进行相关性分析。结果IHC结果显示,CD34定位于血管内皮细胞胞膜和胞浆,显示为棕黄色或棕褐色颗粒,新生的微血管被染成棕黄色,显微镜下计数每高倍镜视野下的MVD,结果表明在HGF US/MB组心肌中MVD最高,为(266.9±39.8)个/高倍镜视野,与其他各组比较差异均有显著性(P<0.01)。ELISA结果显示HGF在HGF US/MB组心肌中表达最高,为(5.54±0.81)ng/g,且前壁表达高于后壁(P<0.05),与其他各组心肌HGF含量相比差异也均有显著性(P<0.01)。相关分析表明,心肌HGF含量与MVD呈明显正相关。结论超声靶向破坏微泡可介导HGF基因在缺血心肌内的高效转移并促进血管新生,为心肌梗死的基因治疗提供了一个新途径。     

超声联合微泡促进大鼠损伤跟腱及肉芽组织局部基因转染的实验研究

目的 探讨超声联合微泡促进基因局部转染大鼠损伤跟腱及肉芽组织的最适超声转染条件。方法 建立双侧大鼠跟腱损伤模型,在大鼠双侧损伤跟腱内局部注射微泡与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒混合溶液,应用不同输出功率、占空比及超声辐照时间的超声辐照双侧损伤处跟腱,根据荧光染色及免疫组化染色下EGFP表达结果判断转染效果。根据基因转染效果最高,同时正常组织损伤坏死最小筛选出最合适的照射条件。将大鼠分为4组:①质粒+微泡+超声辐照组,②质粒+微泡组,③质粒+超声辐照组,④单纯质粒组。根据前几步所选取的条件辐照损伤跟腱,观察跟腱及肉芽组织内的EGFP表达情况及正常组织损伤情况。 结果 在超声输出功率2 W/cm2、占空比20%、超声辐照10 min条件下,跟腱及肉芽组织内EGFP表达明显,且无明显正常组织损伤。超声辐照+微泡+质粒组跟腱及肉芽组织内EGFP表达高于其余3组（P<0.05）,其余各组间差异无统计学意义。结论 在适合的超声辐照条件下,超声联合微泡能明显增强损伤肌腱及肉芽组织的基因转染效果,且不损伤正常组织,这为肌腱损伤的基因治疗的可行性提供了实验基础。     

超声破坏微泡联合G-CSF促进心肌梗死大鼠血管新生

目的：探讨超声破坏微泡联合粒细胞集落刺激因子（G-CSF）刺激大鼠梗死心肌血管内皮生长因子（VEGF）分泌、促进血管新生的有效性．方法：心肌梗死模型Wistar大鼠40只,随机分为：超声＋微泡造影剂＋G—CSF（A组）;超声＋微泡造影剂组（B组）;单纯G—CSF组（C组）;单纯手术（SA）组（D组）．于治疗后2wk处死大鼠取材,采用免疫组化法检测心肌组织CD34的表达,并在显微镜下计数心肌内新生血管密度（MVD）．采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测心肌组织内VEGF蛋白表达情况．结果：免疫组化显示A组心肌组织中有大量CD34表达,新生血管最多,MVD计数为（231±24）个／高倍镜视野,明显高于B组（148±19）,C组（100±12）,D组（86±8）个／高倍镜视野,差异具有统计学意义（P〈0．05）．ELISA检测结果显示A组心肌组织中VEGF蛋白表达量为（3．14±0．21）ng／g,明显高于B组（2．56±0．17）,C组（1．91±0．14）,D组（0．97±0．11）ng／g,差异具有统计学意义（P〈0．05）．结论：超声破坏微泡可刺激缺血心肌内源性VEGF分泌,促进心肌血管新生,联合G—CSF能明显增强其血管新生作用．     

超声空化致犬前列腺损伤的形态学观察

目的 探讨微泡激励的超声空化效应对正常犬前列腺组织的损伤作用.方法 15只健康成年雄性犬随机分为超声微泡组、单纯超声组和微泡假照组.在开腹情况下,联合经静脉推注微泡0.1 ml/kg和脉冲式超声辐照前列腺10 min,治疗后获取前列腺组织,进行大体、光镜和电镜检查.结果 超声微泡组,光镜见前列腺细胞间隙可见显著的微血管破裂、大量出血和血肿形成;电镜可见细胞器肿胀,桥粒等细胞连接断裂,红细胞露出.结论 超声激励的微泡空化效应对犬前列腺有明显的机械损伤作用.     

超声破坏微泡介导骨髓间充质干细胞移植的实验研究

目的 初步探讨超声破坏微泡介导骨髓间充质干细胞(MSCs)移植的可行性.方法 21只Wister大鼠分为3组:干细胞静脉移植组(MSCs-iv)、超声+干细胞组(US+MSCs-iv)、超声+微泡+干细胞组(US+MB+MSCs-iv).各组分别取1只大鼠的骨骼肌行HE染色观察显微结构.移植后7 d取各组剩余大鼠下肢股薄肌、半膜肌行免疫组化检测,观察MSCs移植数量;另外US+MB+MSCs-iv组同时取重要脏器行免疫组化检测,评估靶向性.结果 US+MB+MSCs-iv组大鼠股薄肌、半膜肌染色可见红细胞外溢到组织间隙,同时免疫组化结果显示股薄肌、半膜肌及脾脏可见较多移植的MSCs.而其他组骨骼肌未观察到阳性细胞.结论 超声靶向破坏微泡有可能成为提高干细胞移植效率的新方法.     

翻转静脉桥接加碱性成纤维细胞生长因子修复面神经缺损的实验研究

目的探讨利用翻转静脉桥接加碱性成纤维细胞生长因子形成的再生室修复兔面神经缺损的可行性.方法手术制作兔左侧面神经下颊支15 mm缺损模型,分3组不同方法修复:常规静脉桥接加注生理盐水组、翻转静脉加注生理盐水组、翻转静脉加注碱性成纤维细胞生长因子组.术后100 d进行大体观察、神经电生理检测、组织学观察,以评价神经再生情况.结果翻转静脉加注碱性成纤维细胞生长因子组较单纯应用翻转静脉桥接技术或常规静脉桥接加注生理盐水而言,其神经传导速度恢复得到显著提高、组织学表现更接近正常.结论翻转静脉桥接加注碱性成纤维细胞生长因子修复周围神经缺损的效果好于单纯使用翻转静脉桥接或常规静脉桥接.     

Combined pluronic P85- and ultrasound contrast agents-mediated gene transfection to HepG2 cells

This study examined the effect of P85 (a pluronic block copolymer) and microbubble (MB)ultrasound contrast agents under ultrasound irradiation on gene transfection and expression.The pEGFP plasmids tha...     

HIFU联合载HSV-TK基因的纳米级超声分子探针治疗对裸鼠肝移植瘤血管生成的影响

目的 观察高强度聚焦超声(HIFU)治疗裸鼠肝移植瘤后,再注入载单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-TK)的纳米级超声分子探针治疗效果,并探讨其治疗机制.方法 用人肝癌HepG2细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型60只,采用CZF型HIFU机治疗后,分别经鼠尾静脉注射200 μL的微泡+HSV-TK+磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)(A组)、微泡+HSV-TK(B组)、HSV-TK+ GPC3(C组)、HSV-TK(D组)、微泡+GPC3(E组)、PBS液(F组),每3天1次,共注射3次.每次注射后,根据超声监测微泡到达靶组织的情况,对A、B、D、E组用DZC型超声转染仪给予2 W/cm2、1 MHz、5 min超声辐照.首次注射48 h后,各组经腹腔注射0.2 mL更昔洛韦(GCV,100 mg·kg-1·d-1),连续注射14d.治疗结束后,用免疫组织化学法测残瘤中微血管密度(MVD)水平,用Western blot和免疫组织化学法测量残癌中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管肉皮生长因子(VEGF)的变化情况,用Q-PCR检测肿瘤中HIF-1α、VEGF基因的转录水平.结果 治疗14 d后,B、C、D、E、F组肿瘤组织中HIF-1α、VEGF蛋白表达量,VEGF及HIF-1α mRNA水平,MVD均明显高于A组(P＜0.05).结论 载HSV-TK的纳米级超声分子探针治疗可降低HIFU治疗后残瘤组织中的VEGF、HIF-1α及MVD水平,从而抑制肿瘤的生长,提高HIFU的治疗效果.