转录因子XBP1S基因表达谱差异分析

目的 应用基因表达谱芯片技术了解XBP1S在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法 构建pcDNA3.1(-)-XBP1S真核表达载体,转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1(-)处理相同细胞系作为对照.48 h后制备细胞裂解液,提取mRNA,应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行基因表达谱芯片技术分析.经过差异基因表达谱的筛选,发现HepG2细胞转染XBP1S以后,有38个基因表达水平显著上调,30个基因表达水平显著下调.结论 成功构建XBP1S的真核表达载体pcDNA3.1(-)-XBP1S,运用基因表达谱芯片技术成功筛选了XBP1S转染细胞后的差异表达基因,这些差异表达基因包括细胞周期、蛋白质的翻译合成及运输、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号转导等方面起重要作用及肿瘤发生相关的基因,为进一步阐明XBP1S可能存在的调控机制及XBP1S蛋白可能的生物学功能提供理论依据.     

乙型肝炎病毒X蛋白转录抑制抑癌基因p53表达的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白对抑癌基因p53基因表达的调节作用。方法 以寡核苷酸芯片技术筛选的HBx反式调节基因结果为基础，利用生物信息学技术确定抑癌基因p53的启动子区域（p53p），构建真核报告基因表达载体pCAT3-p53p；以该质粒单独及与pcDNA3．1（-）-X共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。进一步采用半定量RT-PCR技术检测HBV X蛋白对p53基因表达的调节。结果 成功构建报告载体pCAT3-p53p，克隆的p53启动于有顺式激活下游基因的活性；pCAT3-p53p与pcDNA3＋1（-）-X共转染时CAT的表达活性明显下降，说明HBVX蛋白抑制p53基因启动子的转录。RT-PCR结果表明，转染了pcDNA3．1（-）-X的HepG2细胞中p53基因mRNA表达减少。结论 HBV X蛋白在转录水平上反式抑制抑癌基因p53的表达，本实验不仅验证了基因芯片的筛选结果．而且为HBx在致肝细胞癌发生中的作用提供分子基础。     

乙型肝炎病毒x基因转染HepG2细胞后差异表达基因的筛选

目的建立稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞系,利用基因芯片技术分析HBx转染肝癌细胞株引起的表达谱变化。方法首先PCR扩增HBx基因片段,与真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组子,脂质体转染HepG2细胞经抗生素G418筛选后获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞系,采用流式细胞术、Western blot鉴定HBx蛋白在细胞中的表达。利用基因芯片技术分析HBx转染肝癌细胞株引起的表达谱变化。结果经HindⅢ和XbaⅠ内切酶酶切和测序鉴定表明成功构建了HBx基因真核表达载体,流式细胞术、Western blot均证实HBx蛋白在HepG2细胞高效表达,基因芯片结果显示在检测的35 000个基因中有98个基因转录显著上调,24个基因转录显著下调。结论成功构建了稳定、高效表达HBx的HepG2细胞,HBx转染HepG2细胞可导致部分基因显著差异表达,差异表达的基因可能参与了肝癌的发生发展。     

HBV adr亚型体外感染肝细胞模型的建立

目的:构建1.1倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因的真核表达载体,稳定转染L-02细胞,建立HBVadr亚型体外感染的细胞模型。方法:以pVUⅡ酶切质粒p3.6Ⅱ获得1.1倍HBV DNA片段,用牛小肠碱性磷酸酶将经EcoRV线性化的pcDNA3去磷酸化,以T4DNA连接酶连接1.1倍HBV DNA片段和线性化的pcDNA3,将构建的pcDNA3-1.1HBV以脂质体转染L-02肝癌细胞,经G418稳定筛选。ELISA检测转染细胞培养上清中HB-sAg、HBeAg的表达。RT-PCR检测转染细胞中HBpreS2、HBX的表达。结果:成功构建了1.1倍HBV全基因真核表达载体,稳定转染L-02后,建立了新的肝细胞系L-02.1Z,其培养上清中可检测到HBsAg、HBeAg的稳定表达,并可检测到HBpreS2、HBX RNA在转染细胞中表达。结论:该表达载体可介导病毒复制,其稳定转染的细胞可作为一种新型的HBV体外感染模型。     

基因芯片筛选HepG2与HepG2.2.15细胞中的差异表达基因

目的 探讨HepG2细胞及HepG2.2.15细胞中差异表达的基因并对其基因表达谱进行生物学信息分析.方法 用Trizol一步法提取HepG2细胞及HepG2.2.15细胞的总RNA,并纯化mRNA,反转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针,与基因芯片杂交;采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,最后以差异为2倍的标准来确定差异表达基因.结果 在54614个基因表达谱的筛选中,发现有4462个基因表达水平显著上调,2592个基因表达水平显著下调.结论 HBV基因组及其表达产物对于肝细胞基因表达谱有显著影响,可能参与了肝癌的发生发展.     

人源性抗HBc单链抗体真核表达载体的构建及其细胞内表达

目的：构建人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体并在细胞内表达。方法： 采用DNA重组技术将特异性人源性抗HBc单链抗体基因插入真核表达载体pEGFP-c1；转染HepG2细胞，经G418筛选细胞，荧光倒置显微镜观察细胞内抗HBc单链抗体与绿色荧光蛋白融合表达情况，并用ELISA法检测HBc单链抗体基因的细胞内表达。结果： 成功地构建了人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体。转染HepG2细胞并筛选后，经荧光倒置显微镜观察，细胞内有绿色荧光蛋白表达；ELISA检测细胞内表达的单链抗体片段具有HBcAg结合活性。结论： 人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体的构建并在细胞内成功表达，为胞内抗HBc单链抗体的进一步研究奠定了基础。     

SP-TAT-Apoptin融合蛋白对HepG2细胞周期的影响

目的: 研究SP-TAT-Apoptin融合基因诱导人肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期阻滞, 探讨其用于肝癌治疗的可能性.方法: 通过DNA重组技术, 以pcDNA3.1/Apoptin质粒11为模板, 构建SP-TAT-Apoptin融合基因 plenti6-V5-D-TOPO真核表达载体.用SP-TAT-Apoptinplenti6-V5-D-TOPO真核表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO), 转染后Blasticidin霉素进行筛选, 并进行鉴定得到稳定表达SP-TAT-Apoptin的CHO细胞株.收集含有TAT-Apoptin融合蛋白的筛选细胞培养上清, 用于HepG2细胞培养.于共培养后的不同时段收集HepG2细胞, 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期.结果: 用包含SP-TAT-Apoptin融合基因的plenti6-V5-D-TOPO真核表达载体瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO), 成功筛选出稳定表达SP-TAT-Apoptin融合蛋白的CHO细胞, 收集细胞培养上清, 继续用于HepG2细胞培养, 可观察到HepG2细胞阻滞于G1期并引起细胞凋亡.结论: SP-TAT-Apoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞.     

HBV基因组各基因真核表达载体的构建及转染

目的 构建HBV基因组各基因真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系.方法 采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBV基因的各基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用细胞流式技术及细胞免疫组化技术检测HBV各基因产物在细胞内的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/HBs、pcDNA3.1( )/HBc、pcDNA3.1( )/HBe、pcDNA3.1( )/HBp、pcDNA3.1( )/HB-preS1、pcDNA3.1( )/HB-preS2、pcDNA3.1( )/HBx真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究各基因的功能奠定良好的实验基础.     

针对S基因的siRNA抑制HepG2 2.2.15细胞中HBV基因的表达

目的 构建针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA（short interfering RNA）表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,观察其对HepG2 2.2.15细胞中的HBV基因表达的影响.方法 设计并合成针对HBV S区基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG2 2.2.15细胞,经200μg/ml潮霉素抗性筛选,4周后获得稳定细胞克隆,对所得细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,免疫荧光染色检测细胞内抗原的表达,同时用RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果.结果 成功构建了针对HBV S基因的siRNA表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,两种siRNA均能明显抑制HepG2 2.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,抑制率分别为83%和78%,免疫荧光染色显示siRNA能抑制细胞内抗原的合成,RT-PCR结果证实HBV的mRNA表达降低,而无关序列的siRNA和对照则无此作用.结论 载体产生的针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达.     

ATF-2基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定

目的:构建活化转录因子2(ATF-2)基因RNA干扰的真核表达载体,观察其对HepG2肝癌细胞株增殖及凋亡的影响。方法:根据ATF-2 mRNA序列,合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入质粒载体PBA-siU6,DNA测序鉴定重组质粒PBA-siATF-2。脂质体介导质粒转染HepG2细胞。Westernblot法检测ATF-2蛋白表达;MTT方法检测细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。结果:ATF-2基因RNA干扰载体经测序分析证实插入64 bp序列正确无误;Westernblot法显示干扰组细胞内ATF-2蛋白表达量明显降低;ATF-2基因的下调导致HepG2细胞增殖阻滞和凋亡发生。结论:成功构建了ATF-2基因RNAi真核表达载体,下调HepG2细胞ATF-2基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

HCV核心蛋白在HepG2细胞中对COX-2表达的影响

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是否影响环氧化酶-2(COX-2)的表达。方法用PCR从含HCVH77株全长基因组序列质粒中扩增HCV核心蛋白基因,并克隆至pcDNA3.1载体中,构建HCV核心蛋白基因的真核表达载体HCV-C/pcDNA3.1。用HCV-C/pcDNA3.1和含COX-2启动子的荧光素酶报告载体COX2pro1.5kb/luc瞬时共转染HepG2细胞,测定萤火虫荧光素酶的活性,并用Westernblot检测COX-2蛋白的表达水平。结果成功地构建了HCV-C/pcD-NA3.1重组质粒。瞬时转染后的HepG2细胞中,COX2启动子荧光素酶的活性显著增强。Westernblot检测,发现COX-2的表达明显升高。结论HCV核心蛋白在HepG2细胞中激活COX-2启动子,并且明显诱导COX-2的表达,为进一步研究COX-2与HCV致病性的关系提供了新的实验依据。     

真核表达载体pcDNA3.1(+)-vIL-10的构建及其在SD大鼠骨髓基质干细胞的表达

目的构建携带免疫调节因子vIL-10c DNA的真核表达载体,转染至SD大鼠骨髓基质干细胞,观察免疫调节因子vIL-10在骨髓基质干细胞的表达。方法PCR扩增原核载体PET-28α/vIL-10,获得目的基因vIL-10,目的基因在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体Pc DNA3.1(+),转染大鼠骨髓基质干细胞。用G418筛选得到vIL-10高表达的细胞,对照组为pcDNA3.1(+)直接转染的骨髓基质干细胞。结果经PCR、酶切、测序鉴定显示按设计构建的载体pc DNA3.1(+)-vIL-10,已成功转染骨髓基质干细胞。RT-PCR检测到510bp目的片段vIL-10在骨髓基质干细胞表达,SDS-PAGE电泳表明在骨髓基质干细胞有vIL-10蛋白的表达。结论vIL-10 mRNA和蛋白在骨髓基质干细胞中表达。     

pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体的构建及蛋白表达

目的克隆NF-κB(p65)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/NF-κB(p65),并进行体外表达研究。方法提取B16总RNA,RT-PCR扩增出NF-κB(p65)基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1载体中进行序列分析,转染到B16细胞中,Real-time PCR和Western-blot检测NF-κB(p65)的抗原性和表达量。结果获得高质量的B16总RNA,RT-PCR扩增出1.65kb的cDNA片段,成功构建了pcDNA3.1/NF-κB(p65)载体,Blast序列分析与GenBank中NM_009045.4完全一致。NF-κB(p65)重组蛋白具有抗原性,其基因和蛋白表达高于B16细胞组和空质粒pcDNA3.1组。结论成功构建pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体和表达出具有NF-κB(p65)抗原性的重组蛋白。     

核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建

目的将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合，研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性。方法用touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因，同时引入核小体Th表位（H2B14-28）。将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B。将表达质粒转染COS-7细胞，Western blot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达。将构建表达CTLA4Ig—H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB／c小鼠，取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B质粒转染后48h细胞裂解上清中，检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达，该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。重组蛋白在BALB／c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达。结论成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体。     

p75真核表达载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的：构建人神经生长因子低亲和力受体p75真核表达质粒,并在前列腺癌细胞PC-3中表达。方法：运用RT-PCR技术从人脑胶质细胞瘤组织中分离扩增编码人p75完整基因,与pcDNA载体重组,并通过酶切和测序鉴定;用脂质体介导法将重组质粒转染到PC-3细胞中,经G418筛选后,用RT-PCR、间接免疫荧光化学和细胞免疫组织化学法在转录和翻译两个水平上检测表达产物。结果：酶切和测序证实所获得的重组质粒包含p75完整基因;在转染pcDNA3．1( )-p75的PG3细胞中检测到转录和翻译产物。结论：成功地构建了p75真核表达质粒并在PC-3细胞中表达,为深入研究p75在前列腺癌中的生物学功能奠定了基础。     

大鼠GLUT1真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的：构建大鼠葡萄糖转运体1（GLUT1）的真核表达载体。 方法： 以RT-PCR方法从大鼠脑组织中获取GLUT1全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1，随后用lipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组化的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。 结果： 以构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体1的表达。 结论： 成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Glut1，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因，为进一步研究外源性GLUT1表达对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定了基础。     

雌激素受体2对前列腺癌细胞系PC-3M增殖的影响

目的： 构建带有人雌激素受体2（ESR2）全长cDNA的重组质粒pcDNA3.1-hERβ,转染人前列腺癌PC-3M细胞株,观察ESR2对细胞增殖能力的影响。 方法：RT-PCR方法从人正常卵巢组织中获取ESR2全长cDNA,利用基因重组技术与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hERβ;瞬时转染前列腺癌PC-3M细胞株,应用细胞计数、MTT法及流式细胞术检测细胞增殖能力的改变;半定量RT-PCR法及Western blotting法分别检测增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1 mRNA及蛋白表达。 结果：DNA测序结果显示扩增的ESR2序列与GenBank（NM_001437）所公布的序列完全一致。重组质粒pcDNA3.1-hERβ瞬时转染人PC-3M细胞48 h后,与质粒对照组相比：RT-PCR法及Western blotting法显示,ESR2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显增加;细胞计数及MTT结果发现,细胞数目减少,细胞增殖活性下降（P<0.01）;流式细胞实验显示,G0/G1期细胞比例增加（P<0.05）,S期及G2/M期细胞比例减少（P<0.05）;RT-PCR及Western blotting结果还发现cyclinD1的表达减弱,而P21Cip1的表达增强。 结论：成功构建pcDNA3.1-hERβ重组质粒;带有ESR2全长基因的重组质粒转染PC-3M细胞后,细胞的增殖活性受到抑制;RSR2可能通过影响细胞增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1的表达抑制细胞的增殖。     

应用抑制性消减杂交技术克隆PS1TP1的反式激活基因

目的 应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建乙型肝炎病毒（HBV）前-S1蛋白（preS1）反式激活蛋白1（PS1TP1）的相关基因cDNA消减文库,克隆PS1TP1反式激活相关基因,以期发现PS1TP1蛋白反式激活作用的靶位点.方法 以PS1TP1表达质粒PcDNA3.1（-）-PS1TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1（-）为对照;提取mRNA并逆转录为cDNA,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库.结果 文库扩增后得到90个阳性克隆,随机挑选43个克隆测序,并进行同源性分析,获得12种编码基因,其中10个为已知功能基因,另外2个为未知功能序列.结论 成功构建PS1TP1反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.为进一步研究PS1TP1蛋白的功能及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.     

丙型肝炎病毒F蛋白对p21基因的调节作用

目的研究丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白对细胞p21基因转录、表达的影响。方法PCR扩增HCV1b来源的F基因，克隆至pcDNA3．1真核表达载体。F基因质粒转染HepG2细胞，48h后抽提细胞总RNA和总蛋白，实时定量PCR及Westem blot检测p21基因表达变化。结果HCVF蛋白在HepG2细胞内瞬时表达，相对于空载体对照（目标基因表达量为1），HCVF基因质粒转染细胞的p21转录水平为3．2，蛋白表达水平为1．4。结论HCVF蛋白增加p21转录和表达，其生物学效应值得进一步研究。