结核分枝杆菌散在重复单元分型技术在监狱结核病暴发中的应用

目的 探讨结核分枝杆菌散在重复单元在监狱结核病暴发中的应用价值.方法 应用结核分枝杆菌散在重复单位(MIRU)基因分型技术,对监狱结核病患者结核分枝杆菌分离株DNA进行基因型检测分析.结果 7例监狱结核病患者结核分枝杆菌分离株中,6例结核分枝杆菌分离株MIRU基因型为233325153533,另一分离株MIRU基因型为242325152322;6例监狱结核病患者为同一传染源直接传播的结果,而另1例患者和其他6例患者非同一传染源传播.结论 MIRU基因分型技术中结核病暴发时追踪传染源是可行的.     

悬浮阵列技术在结核分枝杆菌检测中的研究进展

悬浮阵列技术(Luminex xMAP技术)是一种将编码微球捕获特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等分子的有效方法。本文综述了结核分枝杆菌检测的研究进展,探讨以结核分枝杆菌的Rpo B基因和CYP141基因为靶标应用Luminex xMAP技术,构筑悬浮阵列体系,建立一种快速、灵敏、特异的方法,实现结核分枝杆菌及其耐药基因联合检测,拓展出一条更为经济、迅速、便捷的结核分枝杆菌快速检测新路径。     

浙江省宁波地区结核分枝杆菌VNTR基因分型研究

目的初步探讨数目可变串联重复序列(VNTR)技术在宁波地区结核分枝杆菌基因分型中的应用。方法根据文献选取7个分型效果较好的VNTR基因位点,应用聚合酶链反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳,分析结核分枝杆菌DNA多态性。结果本研究组共对138株结核分枝杆菌的7个VNTR位点进行了检测,共产生7个基因簇和123个独立基因型,成簇率为5.80%,VNTR-7位点基因分型技术分辨率指数(HGI)为0.999 1。结论VNTR-7位点基因分型技术对宁波地区结核分枝杆菌的分析有较高的分辨力,操作简便,适用于宁波地区结核病分子流行病学研究。     

一起学校结核病暴发疫情临床株基因同源性分析

结核分枝杆菌的基因多态性和基因分析检测对追踪传染源,鉴别内源性复发和外源性再感染和评价防控措施作用很重要。自Supply等在分枝杆菌基因组中发现了可变数目的串联重复序列(MIRU)并建立了12个MIUR位点多态性结核分枝杆菌基因分型检测方法以来,此技术以其操作简便,分辨率高已经广泛应用。运用MI-RU-VNTR基因位点扩增,对某地区1所学校体检中发现的6株结核分枝杆菌临床分离株进行MIRU-VNTR基因分型,分析其同源性。     

应用压电基因传感器芯片检测结核分枝杆菌DNA

目的 由结核分枝杆菌引起的医院感染快速诊断问题已为越来越多的研究者所重视，压电基因传感器芯片技术主要依据晶体液相振荡理论，运用压电传感器与基因芯片技术结合，对标本中靶基因进行检测。方法 使用压电基因传感器芯片技术检测结核分枝杆菌ＤＮＡ。先以结核分枝杆菌ＤＮＡ探针结合在基因芯片表现，然后将１０６例结核患者标本ＤＮＡ分别与之杂交，将杂交信号通过数频处理器以频率变化值的形式输入电脑，再以专用分析软件进行结果分析。结果 检测阳性率为４２．５％，以ＰＣＲ扩增法及涂片法对相同标本进行检测，阳性率分别为３６．８％和１７．０％，同时对压电基因传感器芯片技术的特异性及灵敏度进行检测。结论 实验结果表明压电基因传感器芯片技术是一种比ＰＣＲ扩增法更简便、快速的结核分枝杆菌检测方法。     

实时荧光定量PCR检测耐药结核分枝杆菌中耐药相关基因whiB7的表达

目的探讨结核分枝杆菌耐药性与whiB7基因表达水平之间的关系。方法以耐受利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇和氟喹诺酮的结核分枝杆菌临床分离株为研究对象,利用实时定量PCR的方法,检测药物刺激结核分枝杆菌后whiB7基因表达水平的变化。结果除利福平刺激相应的菌株后,whiB7基因的表达水平变化不明显外,其余药物的刺激均会引起结核分枝杆菌耐药株的whiB7基因表达水平发生显著变化。结论结核分枝杆菌的whiB7基因是对多种抗生素刺激发生反应的基因,推测whiB7的表达参与结核分枝杆菌的耐药过程。     

PCR-SSCP银染法检测结核分枝杆菌rpsL基因突变

目的 探讨结核分枝杆菌对链霉素（SM）的耐药分子机制,建立快速、准确的SM耐药性检测方法。方法 应用PCR－SSCP银染分析技术,检测87例结核分枝杆菌临床分离株链霉素耐药性及rpsL基因变异情况,以结核分枝杆菌H37Rv标准株做对照。结果 25株对SM敏感的临床分离株rpsL基因未见异常,62株耐SM的临床分离析中48株rpsL基因SSCP分析结果异常。结论 rpsL基因突变是SM耐药性的重要分子机制,PCR－SSCP技术可以快速、准确地检测结核分枝杆菌对SM的耐药性。     

河南省部分地区结核分枝杆菌散在分布重复单位及多位点串联重复序列(MIRU-VNTR)基因分型技术的研究

[目的]初步探讨结核分枝杆菌散在分布重复单位(Mycobacterial interspersed repetitiveunits)和多位点串联重复序列(variablenumber of tandem repeats)技术基因分型技术在河南省结核病分枝杆菌基因分型中的应用,初步了解河南省局部地区MIRU-VNTR基因型种类及其分布。[方法]2007年在河南省的嵩县、新密、扶沟、中牟4个县及南阳市的结核病防治机构实验室分离培养的317株结核分枝杆菌,设计引物,应用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分枝杆菌进行分型检测分析,基因分型聚类分析采用Bio-Numerics软件。[结果]对317株结核分枝杆菌临床分离株的12个MIRU位点检测结果显示明显的基因多态性。经基因聚类分析,可分5个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群和Ⅴ群),292个基因型。其中Ⅰ群占4.7%,含15个基因型;Ⅱ群占67.8%,含198个基因型;Ⅲ群占22.7%,含64个基因型;Ⅳ群1.8%,含4个基因型;Ⅴ群3.5%,含11个基因型。[结论]初步表明河南省结核分枝杆菌MIRUs基因存在明显的多态性,至少存在5个MIRU型,主要流行型为Ⅱ型。     

巢式荧光PCR结合高分辨熔链曲线检测奶粉中的结核分枝杆菌

目的建立一种PCR方法检测市售奶粉中是否存在结核分枝杆菌及其亚型。方法根据人型及牛型结核分枝杆菌硝酸还原酶基因启动子区215位上T-C的转换,以卡介苗菌液、人型结核分枝杆菌标准株(H37Ra)、人型/牛型临床分离株与奶粉混悬液混合物为标本,与商品化结核分枝杆菌基因荧光PCR定量试剂对比,设计建立巢式荧光PCR结合高分辨熔链曲线方法检测结核分枝杆菌及其亚型,并调查20种60批次品牌市售奶粉中是否存在结核分枝杆菌及其亚型。结果巢式荧光PCR特异性地检出结核分枝杆菌nar GHJI基因,其敏感性比荧光定量PCR可高1个数量级;人型及牛型结核分枝杆菌nar GHJI基因PCR产物的高分辨熔链温度分别为83.08℃±0.08℃和83.96℃±0.09℃,两者差异有统计学意义(P0.05)。结论成功建立巢式荧光PCR结合高分辨熔链曲线方法敏感、特异地检测分析结核分枝杆菌及其人型或牛型亚型,在调查的20种60批次奶粉中未检出结核分枝杆菌。     

聚合酶链反应鉴定结核分枝杆菌常用靶基因序列的研究进展

分枝杆菌种类繁多,至今已发现有150余种,包括结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌以及非结核分枝杆菌,而结核分枝杆菌复合群是引起人类结核病的主要病原菌。分子生物学技术的发展为实现结核分枝杆菌的快速鉴定提供了方向,建立了各种以核酸序列为靶基因,如IS6110、16S rRNA、16S-23S rRNA ITS、hsp65、rpoB和gyrB等的快速鉴定方法。本文对聚合酶链反应(PCR)检测方法中鉴定结核分枝杆菌常用靶基因序列鉴定方法的敏感度和特异度研究进展进行综述。     

多位点可变串联重复序列技术用于西藏地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究

目的初步探讨多位点数目可变串联重复序列(MLVA)技术在西藏地区结核分枝杆菌基因分型中的应用和初步了解西藏地区结核分枝杆菌数目可变串联重复序列(VNTR)基因型种类及其分布。方法在拉萨、山南、林芝、日喀则、那曲、昌都6个地区结核病防治中心收集结核分枝杆菌临床分离菌株,设计引物,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分枝杆菌20个VNTR位点进行检测,并通过BioNumerics 4.5软件进行DNA指纹图谱多态性分析。结果共收集到217株结核分枝杆菌,分为19个不同的VNTR基因型,其中以Ⅺ型为主要基因型占87.6%(属于北京家族),其次Ⅵ型、ⅩⅤ型、ⅩⅥ型各占1.38%,Ⅰ型、Ⅶ型、ⅩⅢ型各占0.92%,12株结核分枝杆菌为单一的基因型。不同地区之间,以Ⅺ型为主要基因型,分别占各地区的86.8%、91.3%、78.95%、88.2%、95.05、89.3%。结论西藏地区的结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为VNTRⅪ型(即北京家族基因型),初步研究结果显示北京家族基因型与卡介苗接种和耐药性无相关性。MLVA分型方法简单、快速,可以有效地用于结核分枝杆菌的基因分型和病原监测。     

辽宁省与日本流行北京基因型结核分枝杆菌基因的异同

目的探讨辽宁省与日本流行北京基因型结核分枝杆菌基因的异同。方法选取辽宁省各市结核病防治所经菌种鉴定得到的144株结核分枝杆菌菌株,以及84株来自日本神奈川县卫生研究所的结核分枝杆菌菌株,采用以聚合酶链式反应(PCR)为基础的分型方法鉴定是否为北京基因型结核分枝杆菌。对引物4扩增辽宁省北京基因型和非北京基因型结核分枝杆菌的条带进行双向测序并比较。结果 144株辽宁省结核分枝杆菌中,北京基因型结核分枝杆菌129株(89.58%),非北京基因型结核分枝杆菌7株(4.86%),北京基因型结核分枝杆菌和非北京基因型结核分枝杆菌混合感染8株(5.56%)。引物4扩增辽宁省7株非北京基因型结核分枝杆菌菌株得到308bp条带,扩增129株辽宁省北京基因型结核分枝杆菌菌株,116株(89.92%)北京基因型结核分枝杆菌出现270 bp左右条带。随机对3株辽宁省北京基因型结核分枝杆菌的270 bp左右条带进行双向测序,序列一致,与非北京基因型结核分枝杆菌的308 bp条带序列不同。84株日本神奈川县的结核分枝杆菌菌株中,北京基因型结核分枝杆菌53株(63.10%),非北京基因型结核分枝杆菌31株(36.90%),引物4扩增日本神奈川非北京基因型结核分枝杆菌菌株得到308 bp条带,扩增北京基因型结核分枝杆菌无条带。结论辽宁省以北京基因型结核分枝杆菌菌株流行为主,存在北京基因型和非北京基因型结核分枝杆菌混合感染。辽宁省流行北京基因型结核分枝杆菌的基因与日本流行的北京基因型结核分枝杆菌存在着不同的特点。     

344株结核分枝杆菌的基因分型研究

目的研究间隔区寡核苷酸序列基因分型技术、结核分枝杆菌散在分布重复单位(MIRU),以及多位点串联重复序列(VNTR)在河南省结核病分枝杆菌基因分型中的应用,了解河南省局部地区MIRU-VNTR基因型种类与分布,以及北京家族基因型在河南省的分布特征。方法应用2007年在河南省的嵩县、新密县、扶沟县、中牟县等4个县及南阳市的结核病防治机构实验室分离培养的344株结核分枝杆菌,设计引物,应用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术及间隔区寡核苷酸分型技术对结核分枝杆菌进行VNTR分型检测分析,基因分型聚类分析采用Bio-Numerics软件。结果对344株结核分枝杆菌临床分离株的间隔区寡核苷酸分型结果显示,有299株为北京家族基因型,占86.9%;12个MIRU位点检测结果显示明显的基因多态性;经基因聚类分析,可分5个基因群(Ⅰ~Ⅴ群),292个基因型,Ⅰ~Ⅴ群分别占5.1%、67.8%、21.9%、1.4%、2.8%。结论河南省结核分枝杆菌MIRUs基因存在明显的多态性,存在≥5个MIRU型,主要流行型为Ⅱ型;北京家族基因型占主导地位,北京家族基因型与耐药无明显相关性。     

肺癌组织中结核杆菌L-型感染检测

目的 检测肺癌组织中结核分枝杆菌L-型的感染状况,以分析结核分枝杆菌L-型在肺癌形成过程中的作用.方法 选择肺癌患者手术切除后经石蜡包埋的组织标本共102份;采用原位分子杂交技术检测结核分枝杆菌L型MPB64基因片段的存在及定位;同时,用抗酸染色法检测标本中的结核分枝杆菌L-型.结果 原位分子杂交检测石蜡包埋肺组织中MPB64基因片段,102份肺癌组织中结核菌阳性83例,阳性率为81.4%;染色检测结核L-型分枝杆菌,在102份肺癌组织中阳性69份,阳性率67.6%;原位分子杂交(81.4%)与染色法检出率(67.6%)比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 结核分枝杆菌L-型感染在肺癌的形成过程中可能起到一定作用.     

自贡市44株临床非结核分枝杆菌的鉴定

目的对自贡市2012—2016年临床分离44株疑似非结核分枝杆菌进行菌种鉴定。方法使用PCR-荧光探针法对自贡市临床44份疑似非结核患者的菌株进行初步筛查,并对44份菌株的hsp65及rpoB基因进行扩增并测序,通过序列比对获得菌株型别。结果 44株菌株分枝杆菌经PCR-荧光探针法检测结果显示均为非结核分枝杆菌.对44株分枝杆菌进行hsp65及rpoB基因测序比对,进一步菌种鉴定结果显示,44株分枝杆菌分别为11种非结核分枝杆菌。结论自贡市非结核分枝杆菌种类较多,44株菌即分为11个种。PCR-荧光探针法及基因测序法可对临床非结核分枝杆菌进行快速、准确的鉴定。     

唐山市人群结核分枝杆菌基因型分析

目的初步探讨唐山市结核分枝杆菌基因型特征。方法选取结核分枝杆菌基因组中的10个数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTRs)位点,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、琼脂糖凝胶电泳技术和BioNumerics(Version 3.0)软件,对从2012年唐山市结核病医院确诊的肺结核患者痰液中分离培养获得的结核分枝杆菌进行基因分型。结果 125株结核分枝杆菌具有明显的多态性,共分成5个不同的基因群,最大的一个群包含87株,占69.6%,其他型别呈散在分布。结论唐山市结核分枝杆菌的基因型具有明显的多态性,且具有成簇性分布的特点。     

甘肃省228株临床分离结核分枝杆菌DNA分型初步研究

目的了解目前甘肃结核分枝杆菌流行株的基因型特征,并评价两种基因分型方法的应用价值。方法收集甘肃省结核分枝杆菌临床分离菌株,分别采用多位点数目可变串联重复序列分析(multiple-locus variable number tandem repeat analysis,MLVA)和间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)技术进行基因分型,用BioNumerics软件进行聚类分析后,进行结果综合分析、比对。结果利用MLVA分型方法,228株结核分枝杆菌被分为4大基因群,7个主要基因型;Spoligotyping可将228株结核分枝杆菌分为4个基因群,8个主要基因型,其中最大的基因型为北京家族基因型。两种方法在基因型分型方面经卡方检验差异无统计学意义(χ2=0.06,P0.05)。结论两种方法对结核分枝杆菌的分型效果良好,重复性高,操作简便,可试用于大规模分子流行病学调查。北京家族是甘肃最主要的流行基因群。     

结核分枝杆菌利福平耐药株rpoB基因突变特征研究

目的了解郑州市结核分枝杆菌耐利福平临床分离株的相关耐药rpoB基因突变特征。方法应用PCR方法对40株结核分枝杆菌利福平耐药、40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株中包含"利福平耐药决定区(RRDR)"在内的rpoB基因片段(385bp)进行扩增,并将扩增产物进行测序,以H37Rv结核分枝杆菌标准株的DNA序列作为参比序列,分析结核分枝杆菌临床分离株的突变特征。结果 40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株均未检测到突变,结核分枝杆菌耐利福平临床分离株中有36株检测到突变,突变率92.3%,且突变均位于RRDR区域内;突变位点为8个,共有8个突变类型;最常见的突变热点依次为531位点,该位点突变率为64.1%;526位点,其突变率为12.8%和516位点,其突变率为10.3%。结论 rpoB基因是郑州市结核分枝杆菌对利福平耐药的最相关基因,其中在RRDR内的531位点基因突变率最高,并可通过对rpoB基因的突变检测,对耐多药结核病进行预测。     

PCR-反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌及其耐药基因的突变

目的探讨PCR-反向斑点杂交技术用于检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的效果,了解绍兴地区结核分枝杆菌耐药基因的突变情况。方法根据结核分枝杆菌基因特征,运用反向斑点杂交技术构建特异性的PCR反应体系,并用10株非结核分枝杆菌、3株其他菌株（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌）和1株H37Rv结核分枝杆菌对该反应体系进行验证,同时用该体系对来源于绍兴市立医院的125份抗酸杆菌涂片阳性痰液样本及150株结核分枝杆菌进行5种耐药突变基因（rpoB、katG、inhA、embB、rpsL）的检测。结果构建的PCR-反向斑点杂交体系用于10株非结核分枝杆菌、3株其他菌株的检测结果均为阴性,H37Rv标准株可检出,但未检出耐药突变位点。275份结核分枝杆菌样本中对4种抗结核药物均敏感的菌株有201份（73．1％）,单药耐药20份（7．3％）,耐多药54份（19．6％）;共检出133个耐药突变位点,其中对利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的耐药突变位点数分别为41个、51个、30个、11个;前5位突变位点为315M、43M、S531L、15M和H526Y。结论绍兴地区耐药结核分枝杆菌以耐多药为主。构建的PCR．反向斑点杂交体系用于检测结核分枝杆菌特异性强、灵敏度高,可快速检测结核分枝杆菌的耐药基因。     

间隔区寡核苷酸分型和多位点可变数量串联重复序列分析在结核分枝杆菌基因分型中的应用

目的评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)方法在结核分枝杆菌基因分型研究中的应用。方法收集224株结核分枝杆菌临床分离株,分别采用Spoligotyping及MLVA方法进行基因分型,比较两种方法的分型效果,评价两种方法在结核分枝杆菌基因分型中的应用。结果使用Spoligotyping方法,224株结核分枝杆菌呈现出55种基因型,39株具有独特的基因型,其余185株菌呈现出16种基因型;使用MLVA方法时,224株结核分枝杆菌呈现出160种基因型,132株具有独特的基因型,余下的92株菌呈现出28种基因型;当两种方法联合使用时,224株结核分枝杆菌呈现出179种基因型,159株结核分枝杆菌具有独特的基因型,余下的65株菌表现为20种基因型。湖南省和安徽省的菌株中北京家族菌株所占的比例差异有统计学意义(P<0.001),安徽省北京家族菌株所占的比例明显高于湖南省。结论MLVA在结核分枝杆菌株水平的鉴定方面,其分辨能力高于Spoligotyping,但是Spoligotyping在鉴定北京家族菌株和M.bovis方面有一定的优势。将Spoligotyping方法作为一线分型技术,MLVA作为二线分型技术联合应用时,将提高结核病的流行病学调查和病原学监测效果。不同地区的菌株有不同的特点。