增殖腺病毒SG600-IL24与非增殖腺病毒Ad-IL24的抗肿瘤效果比较

利用DNA克隆和重组技术,构建增殖腺病毒SG600-IL24.ELISA检测比较SG600-IL24和非增殖腺病毒Ad-IL24分别感染肝癌细胞BEL-7402、Hep3B、HepGⅡ、SK-Hep-1和成纤维细胞BJ细胞后IL24的表达量,表明SG600-IL24病毒能在肿瘤细胞内大量表达IL-24,最高可达773 ng/mL(MOI=1),且在多数肿瘤细胞内IL24表达量显著高于Ad-IL24,而在正常细胞内表达量与Ad-IL24基本相同.半数组织感染剂量(TCID50)法检测SG600-IL24 48 h和96 h的增殖情况,发现SG600-IL24可在上述4种肿瘤细胞内大量增殖,96 h的最高增殖倍数可达到246153.MTT法和CPE法对比SG600-IL24和Ad IL24对不同细胞的杀伤作用结果显示上述4种肿瘤细胞SG600-IL24对上述4种肿瘤细胞的50%杀伤剂量(IC50)和90%杀伤剂量(IC90)均明显低于Ad-IL24.以上结果表明SG600-IL24体现了病毒治疗与基因治疗的双重抗肿瘤用,其效果明显好于Ad-IL24,为该病毒治疗肝癌的体内研究打下基础.     

增殖腺病毒SG600-IL24与非增殖腺病毒Ad-IL24的抗肿瘤效果比较

利用DNA克隆和重组技术,构建增殖腺病毒SG600-IL24。ELISA检测比较SG600-IL24和非增殖腺病毒Ad-IL24分别感染肝癌细胞BEL-7402、Hep3B、HepGⅡ、SK-Hep-1和成纤维细胞BJ细胞后IL24的表达量,表明SG600-IL24病毒能在肿瘤细胞内大量表达IL-24,最高可达773 ng/mL（MOI=1）,且在多数肿瘤细胞内IL24表达量显著高于Ad-IL24,而在正常细胞内表达量与Ad-IL24基本相同。半数组织感染剂量（TCID50）法检测SG600-IL24 48 h和96 h的增殖情况,发现SG600-IL24可在上述4种肿瘤细胞内大量增殖,96 h的最高增殖倍数可达到246153。MTT法和CPE法对比SG600-IL24和Ad-IL24对不同细胞的杀伤作用结果显示上述4种肿瘤细胞SG600-IL24对上述4种肿瘤细胞的50%杀伤剂量（IC50）和90%杀伤剂量（IC90）均明显低于Ad-IL24。以上结果表明SG600-IL24体现了病毒治疗与基因治疗的双重抗肿瘤用,其效果明显好于Ad-IL24,为该病毒治疗肝癌的体内研究打下基础。     

携带11R穿膜肽-p53融合蛋白基因的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用

p53是研究较为广泛的抑癌基因,可通过不同的途径来抑制或杀伤肿瘤细胞.为增强p53的抗瘤活性,将穿膜肽11R与p53的融合蛋白基因插入增殖型腺病毒载体中,在293细胞中经同源重组筛选获得重组溶瘤病毒SG7605-11R-p53;利用Western blot检测11R-p53的表达情况,TCID50方法测定病毒滴度;应用细胞活力检测实验(MTT)比较病毒杀伤肿瘤及正常细胞的效果.结果显示:SG7605-11R-p53所携带的11R-p53基因在所选细胞株中都能正确表达,与SG7605-p53、AD5-p53相比具有更好的杀伤肿瘤细胞的效果,显示了较强的抗肿瘤效应.说明SG7605-11R-p53是一种有潜力的治疗肿瘤的新型基因-病毒治疗系统.     

AFP调控的携带Mn-SOD基因的腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用

利用改造后的溶瘤腺病毒Ad.enAFP-E1A-△E1B55Kd作为载体携带治疗基因Mn- SOD,得到目的病毒Ad.enAFP-E1 A-△E1B55Kd-MnSOD;通过PCR方法鉴定病毒构建正确;MTT法检测病毒对肝癌细胞的特异杀伤能力和对肝正常细胞的安全性;Hoechst33342染色实验观察细胞凋亡的现象.结...     

携带Kallistatin的溶瘤腺病毒载体构建及其对肝癌细胞的体外杀伤效应

采用靶向基因-病毒治疗策略,通过同源重组的方式构建了携带Kallistatin（KAL）的重组溶瘤腺病毒ZD55-KAL,并研究其对肝癌细胞的杀伤作用。通过PCR方法鉴定病毒构建正确;MTT法检测病毒对肝癌细胞的杀伤能力和对正常细胞的安全性;结晶紫染色观察细胞凋亡现象。结果显示：经目的病毒ZD55-KAL感染后肝癌细胞出现明显的病变和生长抑制,而正常细胞未出现病变现象,表明目的病毒具有较高的安全性和对肿瘤细胞的特异性杀伤能力。此外ZD55-KAL感染肝癌细胞后引起凋亡,所携带的治疗基因KAL能通过促进肿瘤的凋亡达到抑制肿瘤细胞生长的效果。     

GSK-3抑制剂增强携带TRAIL的溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用

研究携带TRAIL基因的溶瘤腺病毒联合化疗药物GSK-3抑制剂(氯化锂和SB-415286)对人肝癌细胞的体外杀伤作用.采用MTT法检测病毒ZD55-TRAIL联合化疗药物氯化锂和SB-415286对肝癌细胞株HepG-2、BEL-7404以及正常细胞株L02、QSG-7701增殖的抑制作用,并通过结晶紫实验检测进一步证明联合用药的杀伤作用和安全性;利用Hoechst33342染色对肝癌细胞株BEL-7404的细胞凋亡进行形态学观察;通过Western blot检测肝癌细胞HepG-2细胞凋亡信号通路的变化.结果表明:低剂量的氯化锂和SB-415286能显著提高ZD55-TRAIL对肝癌细胞株HepG-2、BEL-7404的杀伤作用,对人体肝正常细胞株L02、QSG-7701无明显的抑制作用.说明GSK-3抑制剂能够解除肝癌细胞对TRAIL的抗性,增强携带TRAIL基因的溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤.     

顺铂增强携带IL-24基因的双调控溶瘤腺病毒对结肠癌细胞株的杀伤作用

研究端粒酶逆转录酶启动子hTERT启动子和缺氧反应元件HRE双调控的溶瘤腺病毒SG500-IL24联合化疗药物时人结肠癌细胞株的体外杀伤作用.采用MTT法检测病毒联合化疗对结肠癌细胞株HCT-116、SW620以及人正常细胞株L02增殖的抑制作用;利用Hoechst 33342染色对病毒一化疗疗法诱导的HTT-116细胞凋亡进行形态学观察;通过Western blot检测病毒-化疗疗法诱导的HCT-116细胞凋亡信号通路的变化.结果表明SG500-IL24或不携带外源基因的SG500联合低剂量的顺铂后,其对结肠癌细胞株HCT-116、SW620的杀伤作用显著提高(p<0.05);相同条件下对人正常细胞株L02无明显抑制作用.通过Western blot对联合疗法作用机制的初步探索表明,联合疗法增强caspase依赖性细胞凋亡通路的信号.     

携带5／35嵌合型fiber的溶瘤腺病毒对胃癌细胞的杀伤能力研究

鉴定5/35嵌合型溶瘤腺病毒对人胃癌细胞BGC-823的杀伤能力.使用荧光显微镜观察,流式细胞仪检测,病毒产量测定和MTT等一系列实验方法对5/35嵌合型溶瘤腺病毒的杀伤能力进行测定.结果表明,与5型溶瘤腺病毒相比,5/35嵌合型溶瘤腺病毒表现出更强的杀伤胃癌细胞BGC-823的能力.     

Survivin启动子介导的溶瘤腺病毒载体抗肿瘤研究

肿瘤特异性启动子用于调控溶瘤腺病毒载体靶向于肿瘤细胞,从而实现对肿瘤组织的特异性杀伤,肿瘤特异性启动子的应用已成为靶向基因病毒治疗中的一个重要策略.利用肿瘤靶向人源Survivin 启动子构建的重组腺病毒Ad.SP-E1A展开对多种肿瘤细胞和正常细胞杀伤实验研究,结果发现:Ad.SP-E1A具有较高的肿瘤靶向杀伤能力以及对正常细胞无毒副作用,为基因病毒治疗平台中选择高效安全的腺病毒载体提供参考.     

双基因溶瘤腺病毒O~(Ad)-mK5-shPKM2抗肝癌活性的初步探究

研究携带mK5和shPKM2的双基因溶瘤腺病毒(OAd-mK5-shPKM2)对肝癌细胞的体内和体外杀伤作用,通过PCR技术证明OAd-mK5-shPKM2中无野毒污染,Western blot检测腺病毒早期基因E1A和抗癌基因的表达,CCK8细胞增殖实验和动物实验检测溶瘤腺病毒对肝癌细胞的体外和体内杀伤作用。结果表明:OAd-mK5-shPKM2在细胞实验和动物实验中均可有效地抑制肝癌细胞的增殖,并且OAd-mK5-shPKM2对肝癌细胞增殖的抑制效果要强于单基因溶瘤腺病毒OAd-mK5或OAd-shPKM2。双基因溶瘤腺病毒OAd-mK5-shPKM2携带的两个基因可以共同促进溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用,为进一步研究恶性肿瘤的生物治疗提供理论依据。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合ZD55-TRAIL溶瘤腺病毒对肝癌细胞杀伤作用的研究

研究组蛋白去乙酰化抑制剂SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)联合ZD55-TRAIL对人肝癌细胞株的体外杀伤效果,实验采用MTT法检测SAHA、ZD55-TRAIL以及二者联合对肝癌细胞株Huh-7、Bel-7404、Hep3B以及人正常肝细胞株QSG-7701增殖的抑制作用;利用Hoechst33342染色对联合处理的细胞进行凋亡形态学观察;通过结晶紫实验进一步检测联合用药对肿瘤细胞的杀伤情况;通过Western blot实验在蛋白水平上检测一些凋亡相关蛋白表达情况的变化.实验结果表明:SAHA联合ZD55-TRAIL处理3d后对肝癌细胞株Huh-7的增殖抑制率达到50％,对Hep3B、Bel-7404也达到近40％的杀伤效率,并且联合治疗后对人正常细胞株QSG-7701未见明显的毒副作用.同时结晶紫实验也证明联合治疗对肿瘤细胞的杀伤力强于用SAHA或ZD55-TRAIL单独使用.Western blot实验证明了药物和病毒的联合作用使促凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xL的表达量明显减少,caspase-8和caspase-9蛋白也有相应剪切现象的发生.流式细胞仪同样检测出SAHA和ZD55-TRAIL联合作用对肝癌细胞有很好的杀伤作用.     

苦参碱对肝癌细胞的作用

用浓度分别为0.25,0.5,0.75,1.0,2.0 mg/mL的苦参碱提取液分别体外培养SMMC-7721细胞24,48,72,96 h后,再用MTT法观察其对SMMC-7721细胞的生长抑制作用.结果表明：不同浓度的苦参碱具有抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡的作用,呈明显的时间、剂量依赖性 各浓度和时间之间具有显著差异性.     

免疫细胞联合腺病毒Ad205-IL-15对肝癌细胞的杀伤研究

在已有腺病毒Ad205-IL-15的基础上尝试与过继免疫细胞CIK、NK92等联合开展对肝癌细胞的杀伤性研究。首次通过荧光化学发光的原理构连出携带表达萤光素酶报告基因的肝癌细胞系Huh7-Luc、MHCC97H—Luc来检测细胞的存活率。结果表明：免疫细胞联合Ad205-IL-15对Huh7-Luc、MHCC97H—Luc两株肝癌细胞表现出了较高协同杀伤作用。证明将免疫细胞与腺病毒联合可以相互弥补各自治疗的不足之处,提高了抗肿瘤效果。同时,由于操作方便,荧光素酶报告基因测定法也为检测细胞存活率提供了新的技术手段。     

Inhibition of the growth of human hepatoma cell line both in vitro and in vivo by transducing CKI gene p21WAF-1 with GE7 targeting gene delivery system

The EGF receptor-mediated targeting gene delivery system GE7 was used to transduce exogenous gene pCEP-p21WAF-1 into human hepatocellular carcinoma cell both in vitro and in vivo. After in vitro transduction of the exogenous gene, the growth of the cell lines SMMC-7721 and BEL-7402 was significantly inhibited compared with the control. On day 8 the inhibition rates of the above cell lines reached 56.0% and 66.7%, respectively. The in vivo experiment showed that the growth of human hepatoma transplanted in nude mice injected with GE7 gene delivery system subcutaneously once a week for 3 weeks was remarkably inhibited compared with that of untransfected control. The average tumor weight of the experiment group was (0.083 ± 0.043) g, while that of the control group was (0.281± 0.173) g. The difference is significant (P<0.05). It was indicated that GE7 gene delivery system could efficiently transduce exogenous gene pCEP-p21WAF-1 into hepatoma cell with high EGF receptor expression, and inhibit the cell growth with high efficacy both in vivo and in vitro.     

TGF-β1对肝癌细胞系Hep3B中干性相关基因表达的影响

有研究表明TGF-β1可以诱导诸多上皮来源的癌细胞和正常细胞发生EMT并使其功能发生改变。实验就TGF-β1对肝癌细胞系Hep3B的作用展开研究:通过CCK8检测TGF-β1对Hep3B细胞增殖的影响,RT-PCR实验检测TGF-β1处理后细胞中EMT及干性相关基因的表达变化。结果表明:TGF-β1对Hep3B细胞的增殖无抑制作用;TGF-β1处理Hep3B细胞6d后EMT相关基因的mRNA表达水平并无显著改变,但TGF-β1可上调Hep3B细胞干性基因Oct-4,Klf-4,Nanog,C-myc的表达,并下调分化基因albumin的表达。结果提示TGF-β1一定程度上影响肝癌细胞系的干性基因表达,但并不一定是以发生EMT为前提的。     

TGF—β1对肝癌细胞系Hep3B中干性相关基因表达的影响

有研究表明TGF-β1可以诱导诸多上皮来源的癌细胞和正常细胞发生EMT并使其功能发生改变。实验就TGF-β1对肝癌细胞系Hep3B的作用展开研究：通过CCK8检测TGF-β1对Hep3B细胞增殖的影响,RT-PCR实验检测TGF-β1处理后细胞中EMT及干性相关基因的表达变化。结果表明：TGF-β1对Hep3B细胞的增殖无抑制作用;TGF-β1处理Hep3B细胞6d后EMT相关基因的mRNA表达水平并无显著改变,但TGF-β1可上调Hep3B细胞干性基因Oct-4,Klf-4,Nanog,C-myc的表达,并下调分化基因albumin的表达。结果提示TGF-β1一定程度上影响肝癌细胞系的干性基因表达,但并不一定是以发生EMT为前提的。     

抗黄瓜灰霉病的枯草芽孢杆菌筛选及其抑菌活性的初步研究

结合涂布平板法和温室盆栽植株法,测定了41株枯草芽孢杆菌发酵液对灰霉病病原菌及黄瓜灰霉病的抑制效果,以此筛选出针对灰霉病的生防菌株．结果表明,抑菌效果最好的枯草芽孢杆菌为BS01和BS03．采用涂布平板法研究了菌株BS01和BS03抑菌活性,结果表明,抑菌效果均为50％时,BS03比BS01的菌体浓度低,得到抑菌效果最好的菌株BS03．采用温室盆栽植株法测试了菌株BS03的抑菌活性,结果表明,菌悬液比发酵滤液的抑菌效果好,并且在菌悬液处理黄瓜苗后的第3天抑菌活性最高．     

携带socs3基因的溶瘤腺病毒的构建及体外抗肿瘤活性的研究

SOCS3（suppressor of cytokine signaling 3）是JAK/STAT信号通路的负调控因子,SOCS3间接调控的STAT3磷酸化与肿瘤的发生密切相关。本试验构建携带socs3的溶瘤腺病毒AdCN305-SOCS3,在细胞水平研究socs3对肿瘤的抑制作用,并评估AdCN305-SOCS3的抗肿瘤效果。该病毒感染多种肿瘤细胞,均能特异性扩增,同时表达功能正常的SOCS3蛋白,从而抑制STAT3磷酸化,引起肿瘤细胞的明显凋亡。对AdCN305-SOCS3的研究,证实SOCS3蛋白和AdCN305-SOCS3病毒都具有抗肿瘤的功能,在肿瘤的靶向基因治疗研究中具有广阔的应用前景。     

溶瘤腺病毒ZD55-Mn-SOD联合TPL对骨髓瘤细胞的生长抑制效应

研究利用携带Mn-SOD的溶瘤腺病毒Ad-E1A-△E1B55Kd-Mn-SOD(ZD55-Mn-SOD)联合小分子化合物雷公藤内酯醇(Tnptolide,TPL)对骨髓瘤细胞株RPMI8226、U266生长的体外抑制效应,希望找到解决化疗药物在临床使用中所出现的疗效低及毒副作用大的方法.采用CCK-8比色分析方法表明100 MOI ZD55-Mn-SOD与TPL(2 ng/mL、4 ng/mL)联合处理后,RPMI 8226及U266的细胞存活率均显著低于单用ZD55-Mn-SOD或TPL(P＜0.05);用结晶紫染色法定性分析了ZD55-Mn-SOD联合TPL对两种骨髓瘤细胞的杀伤作用;最后Hoechst33342染色法观察细胞凋亡也显示联合应用ZD65-Mn-SOD与TPL处理组的细胞凋亡现象比二者单独使用均要显著.本研究初步证实ZD55-Mn-SOD与TPL联合具有协同作用,能有效地在体外抑制骨髓瘤细胞RPMI 8226和U 266的生长.