GNA基因在小麦中的表达与抗蚜虫效果研究

利用经密码子优化的、人工合成雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin), gna基因及RbcS启动子构建了高效特异表达载体pBAC202，通过基因枪轰击小麦幼胚和幼穗， 将外源gna基因导入到3个高产小麦(Triticum aestivum L.)品种中，获得42个转基因后代株系。对转基因后代植株进行了DNA点杂交、PCR及PCR-Southern验证，确认外源gna基因已成功地整合到小麦基因组中。进一步的凝集素活性检测表明，小麦叶片中表达的凝集素可使红细胞凝集，并具有正常的生物学活性。转基因植株在人工饲养条件下进行抗蚜虫(Rhopalosiphum padi )试验，蚜口密度抑制率从19%～73%不等，部分株系抑虫效果较好。利用转基因的方式可将外源抗虫基因gna导入到小麦中，并可有效地增强小麦的抗蚜能力，为选育具抗虫特性的优质小麦提供新的途径。     

小麦转基因株系中外源脂氧合酶抑制基因(Loxi)拷贝数分析

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其遗传稳定性及自身表达水平的重要因素。本研究旨在对转外源种子脂氧合酶基因的RNAi序列(RNAi sequence of lipoxygenase gene,Loxi)的小麦(Triticum aestivum)转基因株系中外源基因拷贝数及其种子脂氧合酶活性进行测定分析,以期获得种子脂氧合酶活性显著降低而且外源Loxi能稳定遗传的转基因小麦新种质。采用TaqMan实时定量PCR技术,以小麦内源控制籽粒硬度的主效单拷贝基因Pinb(puroindoline b)为内参基因,对6个转基因小麦TF5代株系外源Loxi拷贝数进行检测;同时以亚油酸为底物对这6个转基因株系种子脂氧合酶活性进行测定。结果显示,内参基因和外源基因扩增的标准曲线相关系数都接近于1,而且都具有合适的扩增效率,其中内参基因Pinb的扩增效率为107.7%;外源Loxi基因的扩增效率为104.5%;6个不同转基因株系中外源Loxi拷贝数不同,最小的为1,最大的为8;亲本品种陕优225和西农889种子脂氧合酶活性分别为(860±28.20)和(1 132±59.80)U;与其亲本材料相比,不同转基因株系种子脂氧合酶活性降低程度也不同(约为其亲本的21%~95%),有5个转基因株系与其亲本相比,酶活显著降低;其中亲本为西农889的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为2、6和8,与其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为32.76%、26.39%和21.05%;亲本为陕优225的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为1、3和6,其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为95.47%、51.06%和37.73%;外源Loxi拷贝数与种子LOX活性呈负相关。说明转基因株系中脂氧合酶基因的RNAi可有效抑制其种子LOX活性。本研究成功获得种子低脂氧合酶活性的转基因小麦材料,并对其外源Loxi拷贝数进行了准确测定;鉴定得到的种子脂氧合酶LOX活性显著降低的转基因小麦株系可为小麦育种提供新的亲本或种质材料。     

Lox基因RNAi转基因小麦后代株系种子耐储藏性分析

小麦(Triticum aestivum)种子中脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)可催化不饱和脂肪酸的氧化作用,在种子储藏期间产生氢过氧化物,导致小麦种子在储藏过程中种子活力和营养品质降低.因此,选育种子LOX活性低的小麦品种是小麦遗传改良的任务之一.为了获得种子脂氧合酶活性显著降低、外源Lox RNAi构件(Lox geneRNAiconstruct,Loxi)能稳定遗传且种子耐储藏性增强的转基因小麦新种质,本研究以小麦西农889、闫麦8911和陕优225转Loxi稳定遗传的TF7代转基因株系为材料,对转基因种子中Lox基因家族进行了半定量RT-PCR分析,结果表明,外源Loxi可有效抑制小麦籽粒中小麦脂氧合酶1(Triticum aestivum lipoxygenase Ⅰ,TaLox1)基因的表达,但小麦脂氧合酶2(Triticum aestivum lipoxygenase 2,TaLox2)和小麦脂氧合酶3(Triticum aestivum lipoxygenase 3,TaLox3)基因的表达量不变;对3个亲本及16个TF7代转基因株系的种子脂氧合酶活性检测,结果显示,与其亲本相比,转基因株系种子脂氧合酶活性显著降低;对人工加速老化处理7和14 d的转基因和对照种子分析发现,随着老化天数的增加种子活力降低,但转基因株系种子活力均显著高于其亲本材料;人工加速老化后脂肪酸组分和含量测定分析表明,转基因株系脂肪酸比其亲本材料氧化损失少.以上结果说明,转基因株系中Lox基因的RNAi可有效抑制其种子LOX活性,使转基因小麦后代种子耐储藏性增强;筛选鉴定得到的种子LOX活性显著降低且耐储藏性增强的转基因小麦株系可为小麦育种提供新的材料.     

Ri质粒T-DNA对6年生转基因三倍体毛白杨生长和生理性状的影响

为探索外源基因在成年树木中的表达及稳定性,以转Ri质粒6年生三倍体毛白杨成年树木为材料,以同时种植的未转基因三倍体毛白杨为对照植株,对21个转基因株系和对照植株进行外源基因检测和生长、生理特性测定。PCR检测结果证明,Ri质粒T-DNA上的tms、rolC基因在各转基因株系基因组中稳定存在。转基因株系生长受到不同程度影响,各转基因株系的叶柄长、叶片长、叶片宽度和叶面积均小于对照植株,叶片长宽比大于对照植株;71%的转基因株系树高低于对照植株;81%的转基因株系胸径低于对照植株。转基因株系叶绿素a和叶绿素a+b含量、Fv/Fm值、PI值均低于对照植株。81%的转基因株系叶片内源GA3含量及所有株系叶片的内源IAA含量和IAA/ABA比值均高于对照植株,而86%转基因株系叶片的内源ABA含量低于对照植株。T-DNA能够在三倍体毛白杨成年树木中稳定表达,使植物体内内源IAA和GA3含量提高,生长受到抑制,但不同株系存在较大差异。本研究结果为进一步研究外源基因在植物体内的表达调控机制提供了参考依据。     

抗亚洲玉米螟、抗草甘膦转基因玉米的培育

5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,epsps)是一个高抗草甘膦的基因,苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白基因(Bt基因)cry1Ac M是一个能在单子叶植物中高效表达的抗亚洲玉米螟基因。为了获得具有抗虫、抗除草剂优良复合性状的转基因玉米,本研究构建出质粒p CAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1Ac M-Tnos,通过农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导的玉米(Zea mays)茎尖遗传转化法将目标基因转入玉米。通过分子检测、草甘膦抗性筛选和田间接种亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis(Guenée))试验筛选出转基因株系,在此基础上进行了转基因植株室内抗亚洲玉米螟试验和田间草甘膦抗性分析,并采用RT-PCR检测和Western blot方法确定了抗虫蛋白在转基因植株中稳定表达。从大量转基因株系中优选出6个遗传稳定且抗亚洲玉米螟、抗除草剂草甘膦的转基因玉米株系,这些株系的抗亚洲玉米螟、抗草甘膦特性完全满足大田应用的需求。综上所述,将改造后的Bt抗虫基因cry1Ac M和抗草甘膦基因epsps一同转入玉米,赋予两种玉米骨干自交系植株抗玉米螟、抗草甘膦特性,为我国抗亚洲玉米螟抗草甘膦转基因玉米的大面积推广培育出了优良自交系。     

Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．     

抗菌肽Shiva A基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传与表达分析

为进一步明确外源基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传稳定性及目标性状表现,本研究以转双价抗菌肽基因(ShivaA-cecropinB)纽荷尔脐橙(Citrus Sinensis Osbeck)无性繁殖后代植株为材料,通过PCR扩增,Southern杂交和实时定量PCR检测,以及温室抗病性评价分析等,对抗菌肽ShivaA基因在转基因柑橘后代株系中的遗传稳定性进行了研究.结果表明,外源抗菌肽Shiva A基因在转基因及其无性后代中能够稳定整合与表达.Southern杂交分析表明,ShivaA基因在无性繁殖后代基因组中为1个拷贝,而在T0代中为2个拷贝,由此推测T0代植株为混合嵌合体.定量PCR分析表明,ShivaA基因在To代中的表达水平低于其无性繁殖后代.本研究中外源基因的表达与拷贝数的多少成负相关.研究结果为开展转基因柑橘安全性评价提供了有用的实验材料,积累了有效的实验数据.     

转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析

将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。     

用两个抗虫基因分别转化水稻及抗虫株系的获得

用水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａＬ．）的幼胚、愈伤组织作受体,采用ＰＩＧ基因枪法,成功地将苏云金杆菌毒蛋白基因〖Ｂｔ毒蛋白基因,ｃｒｙＩＡ（ｂ）〗和马铃薯蛋白酶抑制剂基因（ｐｉｎⅡ基因）连同抗除草剂Ｂａｒ基因分别转入不同的水稻中,获得大量的转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交分析途中外源抗虫基因均分别整合到水稻的基因组中。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析显示它们在水稻叶片中表达的水平较高。外源基因在一代中遵循３     

兔角蛋白基因转化棉花及其纤维品质的改良

利用农杆菌介导转化法,将棉纤维特异表达启动子GAE6-3A驱动的兔角蛋白基因（MP）转入常规棉花“冀合713”中。PCR及Southern杂交分析表明,兔角蛋白基因已整合进棉花基因组。6个转基因株系中,4个为单拷贝插入,转基因后代的分离符合孟德尔3：1的1对基因的分离规律,外源基因在这些转基因后代中能稳定遗传。对这4个转基因株系T3代纤维检测结果表明,兔角蛋白基因对棉花纤维品质的影响主要是纤维强度的提高,其中3个株系纤维强度提高率达10％以上。     

Effect of potato plants expressing snowdrop lectin (GNA) on the performance and colonization behaviour of the peach-potato aphid Myzus persicae

Abstract

Transgenic potato plants expressing snowdrop lectin (GNA potatoes) are developed to increase resistance against sap-feeding insects. When expressing GNA at relatively high levels such potatoes may have a negative effect on the fecundity and development of the first generation of the important pest, the peach-potato aphid Myzus persicae (Sulzer) (Hemiptera: Aphididae). However, the effects on M. persicae over several generations, and how such plants affect the alate aphids’ colonization behaviour have not been reported. In this laboratory study, the performance of single M. persicae on potatoes with low GNA expression, measured as developmental time, fecundity, size and survival, was compared with the control, following two successive generations of single apterous aphids. Aphid population growth on the two plant lines was also studied. In addition, colonization behaviour was investigated in a choice experiment where the alate aphids could choose between the GNA and an isogenic control potato plant in a cage. The present study showed that the apterous aphid performance was not significantly different on the two potato lines, although the aphids tended to perform slightly poorer on the transgenic potato. However, the transgenic potato was less likely to be colonized by alate aphids. It is concluded that such transgenic potato plants expressing the lectin at a relatively low level, maximum 0.2% of the soluble protein, have no significant impact on the performance of apterous M. persicae once on the plant, but may have a potential in controlling the aphids by altering the colonization behaviour of alates.     

由根癌农杆菌介导将葡萄糖氧化酶基因转入水稻

摘要:将具有广谱抗病作用的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase , GO）基因插入具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301，新构建了水稻高效表达载体pCAG1301。将此质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）菌株LBA4404后,转化粳稻(Oryza. sativa L.ssp.japonica )品种日本晴(Nipponbare)的幼胚，并由筛选出的潮霉素抗性愈伤组织分化再生植株。对所得潮霉素抗性水稻植株的Southern杂交分析表明，GO基因已整合到受体基因组。淀粉-碘化钾显色反应检测到了转基因植株产生的过氧化氢，证实GO基因表达产生的葡萄糖氧化酶已经在水稻中发挥功能。抗病性鉴定表明，所得转基因水稻对稻瘟菌(Magnaporthe grisea )具有良好的抗性。     

Laboratory and field evaluation of mineral oil spray for the control of citrus red mite,Panonychus citri (McGregor)

Abstract

The aim of this study was to investigate the protection role of potato proteinase inhibitor-II gene against insect and fungal pathogens of cotton. The positive integration of pinII was confirmed by polymerase chain reaction and Southern analysis in transgenic tobacco plants. In insect bioassay, the transgenic lines were more resistant to cotton bollworm (Helicoverpa armigera) and caused insect mortality and severe growth inhibition. Expression against Rhizoctonia implicated a pivotal role of this gene in defence towards pathogens. Potato proteinase inhibitor-II had shown significant expression against insect as well as fungal pathogens and suggests the role of pinII in engineering insect/pathogen-resistant plants.     

大麦黄矮病毒单双价外壳蛋白基因植物表达载体构建及小麦遗传转化

从我国小麦上分离纯化的大麦黄矮病毒PAV分离物，通过RT－PCR、克隆和序列测定后，确认该分离物的外壳蛋白基因由600个核苷酸组成，编码199个氨基酸。该片段克隆到表达质粒pEmu-mcs-N上，构建了植物表达载体pPPI10，同时，在克隆了PAV和GPV外壳蛋白的基础上，构建了编码GPV＋PAV双价CP基因的植物表达载体pPPI14。用花粉管通道法分别净这两种质粒导入小麦品种北京837，经Kan^R筛选、点杂交、PCR、Southern杂交等一系列分析鉴定，转化率分别为2.5%和0.36%,温室和田间抗病毒接种。部分转基因植株对病毒的侵染表现出发病症状较轻，与未转化对照株相比，其发病时间明显延迟。由此推测，转基因植株获得了一定的抗性。     

转Bt基因玉米自交系及其杂交种的抗螟性鉴定

采用基因枪法将Bt基因(GFM CrylA)导入东北春玉米自交系铁7922的幼胚中,获得转基因植株。经过连续3年的田间接卵、室内饲喂玉米螟鉴定,获得稳定抗虫转基因系。以此为亲本与常规自交系配制了四密25Bt、通单24Bt、吉单209Bt3个杂交种。转基因自交系和杂交种的抗螟性鉴定结果表明：转基因系间抗虫性差异极显著,同一转基因系单株间和配制的3个杂交种间抗虫性也存在差异;与对照相比,转基因系配制的杂交种抗虫性明显提高,差异显著。农艺性状鉴定结果显示,转基因系配制的杂交种与对照在株高、穗长、穗行数、行粒数、百粒重上无显著差异。本研究认为,GFM CrylA(Bt)基因可用于玉米的抗螟性改良,也为转Bt基因玉米自交系能够直接用于育种提供了依据。     

转基因抗虫彩色棉对棉蚜抗性的初步鉴定

将已获得的抗棉铃虫、蚜虫转基因 (Bt GNA)彩色棉纯合品 (株 )系进行了棉蚜抗性评价 ,包括罩笼接蚜试验和田间自然感蚜。结果表明 ,在天彩科技园 ,罩笼内抗虫转基因彩色棉蚜害指数减退率分别比受体对照品种减少 2 1 7%～ 30 43%,蚜体变小 ,蚜重减轻 ;罩笼外有蚜株率和卷叶株率比对照略有下降 ,蚜害指数减退率在 - 1 4 2 9%～ 5 4 1 6%之间。在卡尔墩彩色棉试验基地 ,在罩笼内抗虫转基因彩色棉蚜害指数减退率为 - 33 33%～ 5 8 34%;罩笼外有蚜株率和卷叶株率比对照略有下降 ,蚜害指数减退率在 - 2 7 76%～ 40 0 0 %之间。不同品种间棉蚜抗性有差异。     

反向重复RNA介导转基因烟草对花生条纹病毒抗性

构建携带花生条纹病毒（Peanut stripe virus, PStV）外壳蛋白基因（cp）反向重复序列植物表达载体pKcp，转化农杆菌菌株GV3101，叶盘法转化本生烟，卡那霉素筛选得到的转化植株5~6叶期摩擦接种PStV。通过症状观察和ELISA检测，T0代转基因烟草植株87%表现免疫，T1代不同系植株的免疫比例为60~100%，T2代多数系植株免疫比例达到100%。利用PStVcp特异探针对转基因植株T1代进行特异siRNA的Northern blot检测，转基因植株都含有不同量的特异siRNA，而非转基因植株不含特异siRNA；接种前，免疫植株比感病植株体内siRNA含量高；不同转化系免疫植株在接种前、接种15天和50天后的叶片中都检测到特异siRNA，同一植株不同时期，siRNA含量相对稳定；不同转化系植株体内siRNA含量存在差异。本试验成功利用dsRNA获得对PStV具有较高比例抗性的转基因烟草植株。     

转透明颤菌血红蛋白基因杨树的再生及其生长量初步测定

采用农杆菌介导法,将透明颤菌血红蛋白Vitreoscilla hemoglobin(VHb)基因vgb导入银腺杨(Populus alba ×P.glandulosa).以经无菌培养的叶片为外植体,通过450个叶盘与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404共培养,将植物双元表达载体pPZV中vgb基因导入银腺杨基因组,经卡那霉素筛选后,共获得60株卡那霉素抗性植株.经PCR特异性扩增和Southern点杂交分析,证明其中52株再生植株基因组DNA中整合了vgb基因.RT-PCR分析结果表明,vgb基因在其中的44个株系中获得表达.在2年温室生长条件下,转基因无性系的外部形态与对照相比无显著差异.但在株高和地径上,有3株转基因无性系较对照植株有明显增加.     

Feeding damage effects of three aphid species on wheat root growth

Cereal aphid infestations have considerable impact upon productivity and profitability of United States agriculture. A comparison study of the influence of different aphid species (Russian wheat aphid, Duraphis noxia Mordvilko; greenbug, Schizaphis graminum Rondani; and bird cherry oat aphid, Rhopalosiphum padi L.) upon shoot characteristics and root growth of hard red spring wheat (Triticum aestivum L.) was conducted in an attempt to better understand the mechanisms of yield loss in aphid damaged plants. Plants infested with aphids showed similar reductions in shoot growth regardless of aphid species. Shoot chlorophyll concentrations were lowest in greenbug‐infested plants. Root length and dry weight were also equally reduced by feeding damage by the three aphid species. Upon removal of the aphids, shoot dry weights of plants damaged by each aphid species remained unchanged for 10 days. Shoot dry weights for aphid‐damaged plants were about half the magnitude seen in the control plants after 15 days. Chlorophyll concentrations seen in greenbug and Russian wheat aphid‐infested plants initially were lower than the concentrations seen in bird cherry oat aphid‐infested and control plants. Within 10 days after aphid removal, however, chlorophyll concentrations across all treatments were essentially equal. Root lengths in plants previously infested with greenbugs or Russian wheat aphids were lower than control plants four days after aphid removal. Within 10 days after aphid removal, root lengths in plants previously infested with greenbugs or Russian wheat aphids did not differ from control plants. Root lengths in plants previously damaged by bird cherry oat aphids did not reach the same magnitude as that of the other treatments until 27 days after aphid removal. These results indicate that aphid feeding damage to wheat plants can have significant effects on root growth, suggesting that crop management practices that promote root growth could play important roles in improving plant tolerance to aphid damage.