短发夹RNA抑制三氧化二砷耐药的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的实验研究

 目的　研究短发夹RNA（shRNA）对耐三氧化二砷（As2O3）的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的抑制作用。方法　设计并合成3条针对MRP1基因的shRNA序列,在脂质体的介导下转染K562／AS2细胞;用荧光实时定量PCR分析MRP1 mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRP1蛋白表达和细胞内柔红霉素蓄积量。结果　经MRP1 shRNA作用24 h后,K562／AS2细胞株中MRP1 mRNA和蛋白表达水平明显下降,最大下调幅度分别为（79.1±0.07）% 和（62.48±0.86）%（P＜0.05）,同时细胞内柔红霉素蓄积量显著增加（P＜0.05）。结论　MRP1 shRNA可抑制As2O3耐药的白血病细胞株K562／AS2细胞MRP1基因的表达。     

小干扰RNA逆转三氧化二砷耐药的白血病K562/AS2细胞Topo Ⅱ基因表达的实验研究

 目的　研究小干扰RNA片段（shRNA）对三氧化二砷（ATO）耐药的白血病细胞株K562／AS2细胞的TopoⅡα、TopoⅡβ基因表达及其功能的影响。方法　设计并合成针对TopoⅡα和TopoⅡβ基因序列的shRNA各3对,在脂质体的介导下转染K562／AS2细胞;用荧光实时定量聚合酶链反应（PCR）分析TopoⅡα、TopoⅡβ mRNA的表达水平;流式细胞术检测TopoⅡα、TopoⅡβ蛋白表达。结果　针对TopoⅡα- shRNA、TopoⅡβ的shRNA作用于K562／AS2细胞24 h后,TopoⅡα mRNA水平和蛋白水平最大下调为（78.22±0.01）%、（31.17±1.27）%（P＜0.05）,TopoⅡβmRNA水平和蛋白水平最大下调为（57.36±0.01）%、（23.98±1.22）%（P＜0.05）。结论　转染24 h后针对TopoⅡ的shRNA可抑制对ATO耐药的白血病细胞株K562／AS2 细胞TopoⅡ基因的表达。     

敲除CIAPIN1基因提高白血病K562细胞对伊马替尼的敏感性

目的： 探讨靶向干扰细胞因子诱导凋亡抑制因子1 （cytokine induced apoptosis inhibitor 1,CIAPIN1）基因表达后慢性 粒细胞性白血病K562细胞对伊马替尼的敏感性。 方法 ：构建靶向CIAPIN1基因的shRNA干扰载体;使用实时定量PCR、West- ern blotting以及免疫荧光评价CIAPIN1-shRNA组（CIAPIN1-shRNA转染）和scramble-shRNA组（scramble-shRNA转染K562细 胞）干扰效率;伊马替尼（imatinib）处理两组K562细胞后,MTT法检测其增殖能力,集落形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细 胞术和Western blotting检测细胞周期、凋亡及凋亡相关蛋白的变化。 结果： shRNA干扰可有效抑制CIAPIN1表达,CIAPIN1- shRNA组的CIAPIN1 mRNA表达量为scramble-shRNA组的(29.74±4.03)%、CIAPIN1蛋白表达量前者为后者的(21.57±2.18)%。 CIAPIN1表达下调能显著抑制伊马替尼对K562细胞的增殖和克隆形成,CIAPIN1-shRNA+imatinib组的细胞克隆形成数为 （15.60±1.03）个/视野,克隆半径为（2.63±0.55）μm,均小于scramble-shRNA+imatinib组（P<0.05或P<0.01）。CIAPIN1-shRNA+ imatinib组的细胞G1期细胞比例比scramble-shRNA+imatinib组明显增多,S期细胞比例较scramble-shRNA+imatinib组明显减少 （均P<0.01）。CIAPIN1-shRNA+imatinib组K562细胞凋亡率明显增加（P<0.01）。敲除CIAPIN1能抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Bcl-xl、Bcl-2、Mcl-1表达,诱导细胞内细胞凋亡相关蛋白p21、Bid、Bim表达,且与伊马替尼具有协同作用。 结论： CIAPIN1表 达下调可明显提高K562细胞对伊马替尼的敏感性,该作用主要通过阻滞K562细胞周期及诱导凋亡相关蛋白表达实现。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂提高腺病毒对K562细胞转染及杀伤效率的研究

 目的　研究通过观察组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）对人类白血病细胞系K562 CAR表达水平的影响,并探讨HDAC抑制剂在以腺病毒为载体的基因治疗中的应用价值。方法　在mRNA和蛋白水平检测TSA处理K562细胞前后CAR的表达情况,采用流式细胞术测定病毒的转染效率,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测腺病毒及其携带的基因的体外抗瘤效应。结果　TSA处理后,K562细胞CAR 的mRNA 和蛋白表达明显增高;流式细胞仪分析ADV-GFP转染K562 后GFP的表达发现：未处理组的转染率为（8.74±0.34）％,1、10 和100 nmol／L TSA处理细胞48 h后的转染率分别为（12.26±0.55）％、（20.83±1.22）％和（28.66±0.43）％。未处理组与处理组间及各处理组间转染效率的差异有统计学意义（P＜0.05）。MTT结果表明腺病毒M1介导的体外杀伤效应TSA处理组比未处理组增强（P＜0.05）,TSA各处理组间的体外杀伤效应随TSA浓度的提高而增强（P＜0.05）。结论　低浓度的TSA可以增强腺病毒对K562细胞的感染及杀伤效率,可以提高以腺病毒为载体的血液肿瘤基因治疗的疗效。     

沉默Etheràgo-go1基因调控VEGF／PI3K／AKT抑制骨肉瘤增殖和血管生成的研究

目的：检测沉默 Ether àgo-go 1（Eag1）基因对骨肉瘤增殖和血管生成的影响及其可能的调控机制。方法：构建抑制 Eag1表达的短发卡 RNA （short hair RNA,shRNA）重组腺病毒载体 Ad5-Eag1-shRNA 并感染骨肉瘤细胞株。采用实时定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR）和蛋白印迹技术（Western blot analysis,WB）检测 Ad5-Eag1-shRNA 的感染效能。采用 CCK-8法和裸鼠成瘤实验检测感染前后骨肉瘤细胞增殖和裸鼠骨肉瘤体积的变化。采用免疫组化技术和 WB 技术分别检测感染前后裸鼠肿瘤组织中微血管密度（microvessel density,MVD）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的变化。采用 WB 技术检测感染前后骨肉瘤细胞中 VEGF、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）和蛋白激酶 B （protein kinase B,AKT）的表达变化。结果：构建的重组腺病毒载体 Ad5-Eag1-shRNA 具有良好的感染效能。感染Ad5-Eag1-shRNA 可沉默骨肉瘤中 Eag1的表达并能有效地抑制骨肉瘤细胞增殖和裸鼠骨肉瘤生长（均 P ＜0.001）,同时下调裸鼠骨肉瘤组织中 MVD 密度和 VEGF 的表达（均 P ＜0．001）。感染 Ad5-Eag1-shRNA 可下调骨肉瘤细胞中 VEGF 的表达（P ＜0.05）并抑制 PI3K 和 AKT 的磷酸化（均 P ＜0．001）。结论：沉默 Eag1可能通过调控 VEGF ／PI3K／AKT 信号通路抑制骨肉瘤增殖和血管生成。     

多药耐药基因、谷胱甘肽S-转移酶特异性siRNA逆转K562／A02细胞多药耐药.

 目的　研究多药耐药基因（mdr1）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTπ）特异性siRNA逆转K562／A02细胞多药耐药性。方法　以mdr1 mRNA第79～99和GSTπmRNA第308～327核苷酸为作用靶点，合成针对靶区域序列的siRNA，克隆入pSilence2.1-U6 neo，克隆产物为pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ，脂质体介导下转染K562／A02细胞。用实时荧光定量PCR检测K562／A02细胞 mdr1和GSTπ mRNA的表达；流式细胞仪检测细胞凋亡；MTT法检测多柔比星的半数抑制浓度（IC50）。结果　经酶切、测序分析表明，成功构建siRNA真核表达载体。经pSilence-mdr1转染后的K562／A02细胞株mdr1 mRNA表达量下降了71.5 %，从（2.8±1.65）×108拷贝／μg RNA下降至（3.9±2.37）×107拷贝／μg RNA（P＜0.01）；同时pSilence-GSTπ 作用后，K562／A02细胞 GSTπmRNA表达量较显示空载体pSilence2.1-U6 转染组下降了39.8 %，从（2.3±1.14）×105拷贝／μg RNA下降至（5.4±2.45）×104拷贝／μg RNA（P＜0.01）；流式细胞仪显示空载体pSilence2.1-U6 转染组细胞凋亡率为（11.65±4.06）%，pSilence-mdr1和 pSilence-GSTπ共转染组细胞凋亡率为（44.98±11.27）%（P＜0.01）；空载体转染组耐药指数为23，pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ共转染组耐药指数降低为7，IC50值从转染前的（1.16±0.38）mmol／ml下降为（0.33±0.04）mmol／ml（P＜0.01）。结论　siRNA 真核表达载体pSilence-mdr1、pSilence-GSTπ对K562／A02细胞株多药耐药性具有明显的下调作用。     

增加细胞内三氧化二砷浓度恢复耐三氧化二砷的K562细胞对其敏感性的研究

目的 探讨耐受三氧化二砷（ATO）的白血病ATO耐药K562细胞（K562/AS2细胞）内砷浓度与耐药性的关系.方法 亲代敏感K562细胞（K562/S细胞）按照逐步增加ATO浓度诱导,建立K562/AS2细胞.采用原子荧光光谱法检测细胞内砷浓度.采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度ATO对细胞的毒性作用.结果 1μg/ml ATO培养24、48、72h后,K562/S细胞内的砷浓度比K562/AS2细胞增高[（15.63±0.42） μg/L比0μg/L、（22.27±0.15） μg/L比（3.51±0.12） μg/L、（24.31±0.21） μg/L比（3.61±0.11） μg/L;均P＜0.05].随着ATO浓度的增加及培养时间的延长,K562/AS2细胞内砷浓度逐渐增加（P＜0.05）,在1μg/ml和2μg/ml间砷浓度增加较快.K562/AS2细胞生长抑制率也逐渐增加（P＜0.05）,在1μg/ml和2μg/ml间增加较快.直线相关分析显示,当K562/AS2细胞与ATO接触分别为24、48和72 h时,其细胞生长抑制率均与细胞内ATO浓度呈正相关.结论 增加ATO浓度或延长ATO作用时间均可增加耐药细胞内ATO浓度,细胞内ATO浓度与ATO对细胞的毒性呈正相关,增加细胞内ATO浓度能够增强耐ATO K562细胞对ATO的敏感性.     

K562多药耐药细胞系中肿瘤干细胞样细胞对伊马替尼耐药机制的初步研究

 目的 进一步阐明一些高表达P-糖蛋白（P-gp）的慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼耐药的机制。方法 经过对K562细胞系长期的足叶乙苷（VP16）诱导和克隆筛选,建立一株耐药细胞系K562／VP16;利用干细胞高效能将Hoechst 33342 荧光染料泵出细胞的特性,采用流式细胞术,从K562／VP16细胞系中分选出一小群细胞,即边缘细胞（SP）,称为K562／VP16 SP细胞,并初步探讨其抗伊马替尼的机制。结果 bcr／abl和abl 蛋白在K562细胞、K562／VP16 SP细胞及非K562／VP16 SP细胞（non-SP K562／VP16）中的表达水平差异无统计学意义;P-gp在K562细胞中不表达,在K562／VP16 SP及non-SP K562／VP16细胞中均高表达且表达水平一致;与non-SP K562／VP16细胞比较,K562／VP16 SP细胞对伊马替尼的耐药性更强,并且这种抗性几乎不能被多种多药耐药逆转剂逆转;另外,体内外实验显示,K562／VP16细胞的致瘤性几乎全部来源于K562／VP16 SP细胞。结论 bcr／abl基因的扩增、过度表达和多药耐药基因及其蛋白表达产物P-gp的高表达,可能不是白血病细胞产生对伊马替尼临床耐药的重要机制;白血病细胞对伊马替尼具有一定的抗性,可能与数量极少的白血病干细胞有直接的关系。因此,这类数量极少的干细胞样的肿瘤细胞应当成为有效治疗肿瘤的靶细胞。     

泛素连接酶β-TrCP降解BCR-ABL 融合蛋白对白血病K562 细胞增殖的抑制*

目的:t（9;22）（q34;q11）突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML ）发病中发挥重要作用。本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N 端寡聚化区域（Oligomerization domain,OD）特异性结合的嵌合泛素连接酶E3 β-TrCP 的β-TrCP-OD-HA 的重组腺病毒载体,经泛素- 蛋白酶体途径降解BCR-ABL融合蛋白对白血病K562 细胞增殖的影响。方法:HEK293 细胞扩增野生型Ad5β-TrCP-OD-HA、突变型Ad5 Δ F-TrCP-OD-HA 及空载Ad5GFP 重组腺病毒载体,感染K562 细胞。以未感染K562细胞作空白对照,流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测外源性重组蛋白和BCR-ABL融合蛋白的表达,通过细胞增殖曲线、甲基纤维素集落形成试验、细胞周期检测β-TrCP-OD-HA 对K562 细胞增殖的影响。结果:成功建立携β-TrCP-OD-HA 重组腺病毒载体的K562 细胞株,重组腺病毒载体感染效率达66.4% 以上,β-TrCP-OD-HA、Δ F-TrCP-OD-HA 可在K562 细胞中表达。三组重组腺病毒载体感染K562 细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA 组Western blot检测BCR-ABL融合蛋白含量下降;K562 细胞生长和集落形成能力均受抑制;细胞周期显示S 期细胞数下降至10.88%±2.42% 、G0/G1 期升高至85.6%±5.61% ,与Ad5 β-TrCP-OD-HA 组、Ad5GFP 组及对照组相比,差异具有统计学意义（P 均<0.05）。 结论:重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA、Δ F-TrCP-OD-HA 能够在白血病K562 细胞中表达;β-TrCP-OD-HA 可以抑制K562 细胞的生长增殖,其机制可能与其降解BCR-ABL融合蛋白、阻滞细胞周期而实现。      

重组人类核心蛋白聚糖对白血病K562细胞增殖的影响

 【摘要】　目的　观察重组人类核心蛋白聚糖（rhDCN）对白血病 K562细胞生长抑制、凋亡的影响,并探讨可能的作用机制。方法　通过Lipofectamine 2000脂质体介导转染对数生长期的白血病K562细胞,实验分组为0.9 % NaCl溶液组、pcDNA3.1（+）／K562组、pcDNA3.1（+）-DCN／K562组和脂质体组。经瑞特染色观察转染后细胞形态的改变,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术（FCM）分析细胞凋亡,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白bcl-xl、Mcl-1及Bax的表达。结果　pcDNA3.1（+）-DCN／K562组瑞特染色呈现典型的凋亡形态学改变。MTT结果显示,pcDNA3.1（+）-DCN／K562组转染24 h细胞增殖抑制率为（16.14±1.08）%,转染48 h为（14.07±1.01）%,转染72 h为（20.29±1.19）%,明显高于对应时间点其他组增殖抑制率,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。FCM检测结果显示,pcDNA3.1（+）-DCN／K562组凋亡率为（20.15±1.31）%、细胞的G0／G1期细胞百分率为（51.15±0.57）%,与其他各组比较增加明显,差异有统计学意义（均P＜0.05）。Western blot结果显示,pcDNA3.1（+）-DCN／K562组与其他各组比较bcl-xl、Mcl-1蛋白表达减低,Bax蛋白表达升高。结论　rhDCN重组质粒可有效抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡,rhDCN对细胞周期及凋亡相关蛋白bcl-xl、Mcl-1、Bax的影响可能是其发挥作用的机制。     

短发夹RNA抑制三氧化二砷耐药的白血病K562/AS2细胞MRPI基因表达的实验研究

目的 研究短发夹RNA(shRNA)对耐三氧化二砷(As2O3)的白血病K562/AS2细胞MRPI基因表达的抑制作用.方法 设计并合成3条针对MRPI基因的shRNA序列,在脂质体的介导下转染K562/AS2细胞;用荧光实时定量PCR分析MRPI mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRPI蛋白表达和细胞内柔红霉素蓄积量.结果 经MRPI shRNA作用24 h后,K562/AS2细胞株中MRPImRNA和蛋白表达水平明显下降,最大下调幅度分别为(79.1±0.07)%和(62.48±0.86)%(P<0.05),同时细胞内柔红霉素蓄积量显著增加(P<0.05).结论 MRPI shRNA可抑制As2O3耐药的白血病细胞株K562/AS2细胞MRPl基因的表达.     

Adenovirus-mediated human topoisomerase IIalpha gene transfer increases the sensitivity of etoposide-resistant human and mouse breast cancer cells

Cellular resistance to chemotherapeutic agents is attributable to several mechanisms, including alteration of topoisomerase IIa gene expression. Our previous studies have shown that transient transfection with a vector containing either Drosophila or human topoisomerase IIalpha gene into drug-resistant tumor cells enhanced their drug sensitivity. Furthermore, we constructed a recombinant adenovirus, Ad-hTopoIIalpha, containing the human topoisomerase IIa gene that was able to selectively increase etoposide sensitivity in drug-resistant tumor cells. We also examined Ad-hTopoIIalpha for therapeutic efficacy in vitro using additional etoposide-resistant cell lines, including a mouse breast cancer cell line and a human leukemia cell line. The etoposide-resistant mouse breast cancer cell line FvP, which is derived from FM3A, and etoposide-resistant human breast cancer cell line, MDA-VP, which derived from MDA-P cells showed increased sensitivity to etoposide as well as increased expression of human Topoisomerase IIa mRNA, but this was not seen in FM3A and MDA-P cells. On the other hand, the etoposide-resistant human leukemia cell line K562/MX2 and the parental cell line K562/P did not show enhanced sensitivity against etoposide or an increase in human Topoisomerase IIa mRNA. Using a recombinant adenovirus containing beta-galactosidase gene (Ad-beta-gal), K562 cells were not transducted by the recombinant adenovirus, while both etoposide-sensitive FM3A cells and etoposide resistant FvP cells were transducted by recombinant adenovirus. Ad-hTOP2alpha and etopside treatment showed reduced inoculated tumor weight in the mice. We concluded that a recombinant adenovirus containing the human Topoisomerase IIalpha gene might be a powerful tool for overcoming drug resistance in breast cancer cells, but not in leukemia cells.     

靶向激活蛋白激酶PKR对白血病K562细胞增殖的影响及机制

背景与目的:由t(9;22)(q34;q11)导致的bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中起着重要的作用.本研究运用CML特异的bcr/abl融合基因的mRNA与外源重组反义RNA形成双链RNA (double strand RNA,dsRNA)能激活双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)的策略,研究其对白血病K562细胞增殖的影响及可能的机制.方法:将dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞啶酸(Polyriboinosinic Polyribocytidylic Acid,polyIC)、含ber/abl融合基因序列40bp的逆转录病毒载体RV-40AS、RV-40AS 2-氨基嘌呤(2-aminopurine,2AP)和含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的逆转录病毒载体RV-GFP作用于K562细胞,并以ECV304细胞作对照细胞株.通过细胞计数、MTT法和半固体集落形成实验检测其对细胞生长增殖的影响,用流式细胞仪检测处理前后细胞周期的变化,用Western blot法检测细胞内PKR、磷酸化PKR(phosphated PKR,p-PKR)、真核翻译启始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)、磷酸化eIF2α(phosphated eIF2α,p-eIF2α)蛋白表达的变化,用3H-亮氨酸掺入实验检测细胞总蛋白合成水平的变化.结果:polyIC对K562细胞和ECV304细胞生长和增殖均具有非特异性抑制作用.而RV-40AS仅对K562细胞具有特异性的抑制效应.PKR抑制剂能阻断RV-40AS对K562 细胞的抑制效应.polyIC和RV-40AS作用K562细胞24 h 后,S期细胞减少[polyIC组(37.26±2.35)%,未处理组(58.53±5.42)%,P＜0.05;RV-40AS组(31.48±3.65)%,未处理组(58.53±5.42)%,P＜0.05],G0/G1期细胞增多[pdylC组(50.97±2.18)%,未处理组(36.44±4.20)%,P＜0.05;RV-40AS组(57.47±3.61)%, 未处理组(36.44±4.20)%,P＜0.05].polyIC处理K562细胞组、ECV304细胞组以及RV-40AS处理K562细胞组的p-PKR和p-eIF2α蛋白表达显著上调,且总蛋白合成水平下降[RV-40AS处理的K562细胞组(3.5±1.9)cpm/ng,未处理组(26.8±2.6)cpm/ng,P＜0.05].结论:外源重组反义RNA与bcr/abl融合基因的mRNA形成的dsRNA可通过激活PKR而抑制K562细胞的生长增殖,其机制是通过活化的PKR使蛋白合成启始因子eIF2a磷酸化,从而阻断细胞内蛋白合成的启动,及阻止细胞周期进程来实现.     

FLAG方案和IA方案对P-gp阳性和阴性急性髓细胞白血病细胞的作用

 目的　探讨FLAG和IA方案对P-gp阳性和阴性急性髓细胞白血病（AML）细胞增生抑制作用的优劣及其机制。方法　流式细胞仪检测K562和K562／A02细胞的P-gp 表达,MTT法检测FLAG和IA方案对K562和K562／A02细胞的增生抑制作用,高效液相色谱法检测细胞内Ara-CTP、Ara-C水平,实时定量PCR检测细胞hENT1基因表达。结果　K562 和K562／A02细胞的P-gp阳性率分别为（1.32±0.24）%和（97.66±3.77）%,两种化疗方案对细胞的P-gp表达无影响。FLAG方案对K562细胞的增生抑制作用较IA方案差[（73.17±13.20）%对（84.41±9.33）%,P <0.05],而对K562／A02细胞的增生抑制作用优于IA方案[（70.55±11.32）%对（48.46±12.81）%,P <0.01]。FLAG方案作用时AML细胞内Ara-CTP、Ara-C水平及人平衡核苷载体（hENT1）基因表达均较IA方案作用时升高（P <0.05）。结论　P-gp阳性AML细胞对FLAG方案较IA方案更敏感。氟达拉滨对Ara-C的生化调节可能是其主要机制。     

bcr／abl基因修饰树突细胞疫苗诱导CTLs杀伤K562细胞体外实验研究

背景与目的：T细胞介导的特异性免疫效应在慢性粒细胞白血病的治疗中发挥着重要作用,而以树突细胞（dendriticcell,DC）为中心的免疫治疗是目前肿瘤生物免疫学治疗的热点之一。本研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体,介导慢性粒细胞白血病bcr／abl基因片段转导DC制备疫苗,观察bcr／abl基因修饰DC疫苗诱导产生的特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs）在体外对白血病K562细胞的杀伤效应。方法：应用RT—PCR法扩增慢性粒细胞白血病bcr／abl基因片段．构建复制缺陷型重组腺病毒质粒。并包装产生重组腺病毒。体外诱导培养外周血单个核细胞来源DC,观察DC分别经重组腺病毒转染及多肽负载后,诱导产生特异性的CTLs在体外对白血病K562细胞的杀伤效应。结果：成功构建了携带bcr／abl基因片段的复制缺陷型重组腺病毒表达载体,包装产生的重组腺病毒滴度高达2．0×10^10pfu／mL。体外转染DC效率达到50％～60％,成功制备了bcr／abl特异性DC疫苗。体外实验中,在40：1和20：1效靶比下,bcr／abl基因修饰DC疫苗对K562细胞的杀伤效应分别为（47．6±4．7）％和（47．5±1．6）％,多肽负载DC为（25．8±4．4）％和（24．6±6．3）％,空白DC为（5．7±1．3）％和（4．5±1．6）％,基因修饰DC疫苗诱导的杀伤效应明显高于多肽负载及空白组（P〈0．05）。结论：以重组腺病毒为载体介导bcr／abl基因片段转导DC制备的基因修饰DC疫苗,具有显著的诱导CTLs杀伤白血病K562细胞的作用。     

重组可溶性MICA蛋白负调控NK细胞对白血病细胞的杀伤活性

目的:体外研究重组可溶性MHCⅠ类分子相关A(soluble MHC classⅠchain-related gene A,sMICA)蛋白对自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)表面活化性受体NKG2D(natural killer group 2 member D)的表达、杀伤白血病细胞的活性和分泌IFN-γ的影响。方法:免疫磁珠分选健康人外周血NK细胞,分为空白对照组、重组sMICA组(200、500、800μg/L三亚组),相互作用24 h后,流式细胞术检测NK细胞NKG2D表达水平,LDH释放法检测NK细胞对白血病细胞K562的杀伤活性,ELISA法检测培养上清中IFN-γ的水平。结果:200、500、800μg/L sMICA作用组与对照组相比,NK细胞表面NKG2D的表达均下调[(68.79±6.87)%,(55.75±9.31)%、(45.14±5.70)%vs(92.75±6.91)%,P<0.05或P<0.01],均抑制NK细胞杀伤白血病细胞K562的活性[(18.67±2.35)%、(15.01±2.25)%、(7.33±2.52)%vs(36.33±2.51)%,P<0.05或P<0.01],均抑制IFN-γ的分泌[(164.48±22.48)、(112.71±10.89)、(70.23±9.64)vs(313.72±16.06)pg/ml,P<0.05,P<0.01]。结论:急性白血病细胞表面脱落的sMICA可下调NK细胞NKG2D的表达和IFN-γ的分泌,抑制了NK细胞对白血病细胞的杀伤活性。