杭白菊增强TRAIL基因诱导大肠癌细胞凋亡及机制的实验研究

目的：探讨杭白菊提取液对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因（TRAIL）抑制人大肠癌细胞株DLD-1作用的影响及其可能机制。 方法： 杭白菊提取液联合重组腺病毒载体（Ad）介导的TRAIL基因作用于人大肠癌细胞株DLD-1，通过倒置显微镜、MTT比色法和流式细胞仪，研究分析其对DLD-1细胞抑制作用的效果。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术检测杭白菊提取液作用前后DLD-1细胞TRAIL、TRAIL受体（TRAIL-Rs）mRNA以及细胞表面TRAIL蛋白表达的变化。 结果： Ad/hTERT-gTRAIL对DLD-1细胞的生长抑制率和凋亡率分别为31.4%和13.5%；联合杭白菊提取液后，生长抑制率和凋亡率均显著提高，达93.1%和45.4%（P<0.05）。杭白菊提取液作用后DLD-1细胞TRAIL mRNA的表达量从作用前的0.46上调至1.01, 细胞表面TRAIL蛋白表达的百分率从作用前的2.2%升高到5.0%（P<0.05）。TRAIL死亡受体（DR4、DR5）mRNA的表达量分别从0.70和0.22上调至1.10和0.83（P<0.05），而TRAIL诱骗受体（DcR1、DcR2）mRNA的表达量从0.60和1.15下调至0.19和0.78（P<0.05）。 结论： 杭白菊提取液联合重组腺病毒载体（Ad）介导的TRAIL基因(Ad/hTERT-gTRAIL)能有效诱导DLD-1细胞的凋亡。杭白菊提取液上调TRAIL死亡受体表达以及下调TRAIL诱骗受体的表达可能在增强TRAIL诱导的凋亡作用中起着重要作用。     

腺病毒介导的CD-TK融合基因联合GCV和/或5-Fc对人膀胱癌细胞的杀伤作用

目的：研究腺病毒介导的CD—TK融合基因联合前体药物对人膀胱癌细胞的杀伤作用。方法：利用含有CD—TK融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒转染人膀胱癌细胞株T-24细胞,GFP表达可作为转染是否成功的间接标志,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测转染后细胞CD及TK基因序列的表达情况。用丙氧鸟苷（GCV）和／或5氟胞嘧啶（5-FC）,作为前体药物,以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测其对转染后T-24细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果：腺病毒在体外能高效转染T-24细胞,72h转染效率可接近100％。GCV和／或5-FC均能有效杀伤转染后膀胱癌细胞,给予相同浓度前体药物时,联合用药组显示出较强的肿瘤杀伤作用。0．5mg／ml GCV、0．1mg／ml 5-Fc和GCV＋5-Fc作用于转染后T-24细胞72h细胞生存率分别为23．30％、20．63％、10．10％。旁观者效应杀伤实验表明5-Fc组较GCV旁观者效应明显,而联合用药组显示出更强的旁观者效应。利用Hoechst-PI双染色法检测经前体药物作用后转染细胞,各组均可见凋亡细胞,但联合用药组凋亡细胞较单一用药组多。结论：CD—TK融合基因联合应用GCV和／或5-Fc能有效杀伤膀胱肿瘤细胞,并存在较强的旁观者效应,其杀伤机制可能与凋亡相关,为适用于人膀胱癌的治疗提供一条新思路。     

TRAIL基因修饰的树突状细胞诱导黑色素瘤细胞凋亡的实验研究

为研究TRAIL基因修饰的树突状细胞诱导黑色素瘤细胞凋亡的作用,研究用携带TRAIL基因的重组腺病毒转染小鼠来源的树突状细胞(dendritic cell,DC),采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测DC TRAIL蛋白的表达水平;将DC-TRAIL与B16黑色素瘤细胞混合培养,显微镜观察细胞生长情况,FCM检测B16细胞的凋亡情况;构建小鼠黑色素瘤模型,分别将DC-TRAIL、DC和PBS皮下注射于肿瘤接种部位,观察小鼠的瘤体生长情况,测量瘤体的体积。结果显示:用Ad-TRAIL转染DC后DC可高表达TRAIL。DC-TRAIL组与DC组相比可明显诱导肿瘤细胞凋亡。用DC-TRAIL、DC和PBS处理黑色素瘤移植小鼠2周后,发现DC-TRAIL组小鼠平均肿瘤体积为(0.33±0.10)cm~3,DC组小鼠平均肿瘤体积为(1.32±0.29)cm~3,PBS组小鼠平均肿瘤体积为(3.01±0.52)cm~3。与DC组和PBS组相比,DC-TRAIL组可明显抑制肿瘤生长。     

表达GFP基因的溶瘤腺病毒对大肠癌细胞的体外杀伤作用

目的： 研究在端粒酶启动子驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）及 5型腺病毒早期基因（E1A）基因的腺病毒Ad/hTERT-GFP-E1对大肠癌细胞的杀伤作用及其可能的机制。方法:将不同滴度Ad/hTERT-GFP-E1感染大肠癌及正常细胞,以巨细胞病毒（CMV）启动子驱动下表达GFP基因的腺病毒Ad/CMV-GFP作为载体对照,通过半数组织培养感染量（TCID50）法测定病毒滴度及体外复制能力,然后用MTT法及细胞克隆形成试验评价该病毒在体外对肿瘤细胞及正常细胞的杀伤作用,并对病毒感染后的细胞进行原位凋亡检测。结果:Ad/hTERT-GFP-E1能够在DLD1细胞内持续复制,GFP的表达能够对病毒的感染和复制起到监测作用;MTT结果显示该病毒对于结直肠肿瘤细胞有显著杀伤作用,而对于正常细胞没有明显的杀伤作用;对病毒感染后的DLD1进行细胞凋亡检测发现Ad/hTERT-GFP-E1所引起的凋亡率显著高于对照组(P＜0.01)。结论:溶瘤腺病毒Ad/hTERT-GFP-E1能够选择性地在肿瘤细胞内复制并杀伤肿瘤细胞,其机制与细胞凋亡的途径有关。     

RNAi靶向沉默FLIP基因促进TRAIL诱导卵巢癌A2780细胞凋亡

目的 探讨RNAi靶向沉默FLIP基因对TRAIL诱导卵巢癌细胞凋亡的影响。方法 设计并体外化学合成FLIP序列特异性双链RNA,在脂质体（LipofectamineTM2000）介导下转染人卵巢癌细胞株A2780。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测FLIP-siRNAs转染前后A2780细胞FLIP mRNA和蛋白表达的变化,并筛选出抑制作用最强的FLIP-siRNA.四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测FLIP-siRNA转染前后TRAIL对A2780细胞生长抑制作用的变化。以Annexin-V-PI双染法流式细胞术（FCM）比较FLIP-siRNA转染前后TRAIL诱导的细胞凋亡的情况。结果 特异性FLIP-siRNA片段能有效降低A2780细胞中FLIP mRNA和蛋白水平（P<0.01）,并具有时间依赖性;转染FLIP-siRNA后,TRAIL对A2780细胞的生长抑制作用明显增强（P<0.05）,TRAIL诱导的细胞凋亡也显著增加（P<0.05）。结论 靶向FLIP基因的siRNAs可在转录和翻译水平抑制FLIP表达,并可增加细胞对TRAIL的敏感性。     

不同化疗药物对结肠癌细胞获得性TRAIL基因耐药的逆转作用

目的：探讨不同化疗药物对结肠癌DLD1细胞获得性TRAIL基因耐药的逆转作用及其可能的机制。 方法：将不同化疗药物联合重组腺病毒载体（Ad）介导的TRAIL基因处理对Ad/gTRAIL耐药的结肠癌DLD1-TRAIL/R细胞，通过MTT法检测治疗后肿瘤细胞的存活率，以评价化疗药物对TRAIL基因耐药的逆转作用；然后进一步在体内评价该逆转策略的有效性；接着通过Western免疫印迹等方法探讨逆转耐药的可能机制。结果：在体外检测了5-氟脲嘧啶、丝裂霉素、阿霉素、氟脲苷、依立替康以及顺铂6种化疗药物对DLD1-TRAIL/R细胞TRAIL基因耐药的逆转作用，结果发现只有5-氟脲嘧啶和丝裂霉素能够使DLD1-TRAIL/R细胞对Ad/gTRAIL重新敏感。进一步的结果表明联合5-氟脲嘧啶和Ad/gTRAIL能在体内有效地抑制DLD1-TRAIL/R细胞来源的肿瘤生长，且该抑制作用明显强于其它对照组。结论：联合使用Ad/gTRAIL和5-氟脲嘧啶或丝裂霉素能在体内外有效地逆转DLD1-TRAIL/R细胞对TRAIL基因的获得性耐药，其中丝裂霉素的逆转作用可能与其诱导的Bax过度表达有关。     

TRAIL诱导乙型肝炎病毒转染细胞株凋亡的实验研究

目的 探讨人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）对HBV稳定转染的肝癌细胞株HepG2．2．15的凋亡诱导效果。方法应用MTT法了解TRAIL对HepG2．2．15细胞的诱导效果，琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术和Caspase．3酶活性分析TRAIL诱导HepG2．2．15细胞凋亡过程。结果TRAIL（0．1μg／mL）作用于HepG2．2．15细胞株12、24、36h后，细胞抑制率分别为17．91％、41．26％、59．85％；PI单染亚二倍体含量12h后为21．8％，高于对照组的8．7％；24h后DNA电泳200bp处出现特异性条带；6h后Caspase-3酶活性为对照组的4．76倍。结论TRAIL诱导后，HBV稳定转染的肝癌细胞株HepG2．2．15发生凋亡     

Survivin反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞凋亡的诱导效应

目的：利用骨肉瘤OS-732细胞，探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对survivin基因表达的影响及其诱导肿瘤细胞凋亡的效应。 方法: 设计合成特异性靶向survivin的ASODN，以不同浓度和时间对OS-732细胞进行转染，并设空白、正义（SODN）对照组进行比较。采用RT-PCR、Western blotting、免疫细胞化学技术检测各组OS-732细胞中survivin mRNA、蛋白表达状态，吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色法、流式细胞仪检测细胞凋亡水平和形态变化，MTT法检测细胞生长抑制情况，激酶活性测定法检测细胞中caspase-3活性程度。 结果: 转染ASODN各组OS-732细胞survivin mRNA和蛋白表达均明显弱于空白对照组、SODN组；细胞凋亡率（AI）显著增加，细胞生长相应受抑，caspase-3活性显著提高；上述效应在ASODN各组存在一定的时间浓度依赖性；而SODN各组与空白对照组间各项指标均无明显差异。 结论: ASODN能够特异性下调OS-732细胞中survivin基因表达，激活凋亡效应蛋白酶caspase-3，在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖中发挥重要作用。     

血管内皮生长因子基因转染的心肌细胞移植对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的：探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165基因（AdVEGF165）转染乳鼠心肌细胞后血管内皮生长因子（VEGF）的表达及移植于大鼠急性心肌梗死（MI）模型后对心功能的影响。方法:体外培养新生大鼠心室肌细胞、标记BrdU、共培养法转染AdVEGF165基因；收集培养液上清，ELISA法检测转染细胞VEGF的表达。结扎同种大鼠前降支建立心肌梗死模型，4周后将心肌梗死大鼠随机分为4组，分别注射移植转染心肌细胞(组Ⅰ)、单纯心肌细胞（组Ⅱ）、AdVEGF165（组Ⅲ）和DMEM培养基（组Ⅳ）。超声心动图检测移植前及移植4周后的心功能。处死大鼠，留取心脏标本作HE病理染色及免疫组化检测，并计数血管密度。结果:AdVEGF165基因转染的心肌细胞表达VEGF高于对照组(P<0.01)；超声检测心功能提示转染细胞组(组Ⅰ)心功能障碍轻于其它3组（P<0.01）；免疫组化检测显示，移植细胞在移植区存活；HE染色血管计数显示转染组(组Ⅰ)有更多的新生血管形成（P<0.01） 。结论：AdVEGF165基因转染心肌细胞后表达分泌VEGF增加，可促进梗死区新生血管形成，改善心肌血供，有利于移植细胞的存活，能更好地减轻心功能障碍。     

TRAIL与顺铂协同诱导横纹肌肉瘤细胞凋亡时Fas和cFLIP表达的改变及其意义

目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其基因Ad／GT-TRAIL和顺铂(DDP)联合应用对人横纹肌肉瘤细胞生长抑制和诱导凋亡作用,并分析细胞表面Fas蛋白和细胞内cFLIPmRNA表达对凋亡的影响。方法:将TRAIL(100μg/L)、Ad／GT-TRAIL和顺铂作用于培养的人RD横纹肌肉瘤细胞,通过MTT比色法、流式细胞仪检测细胞凋亡和Fas蛋白表达、RT-PCR检测cFLIPmRNA表达,观察和分析TRAIL及其基因Ad／GT-TRAIL对横纹肌肉瘤细胞的作用及和顺铂协同作用的机制。结果:Ad／GT-TRAIL和100μg/LTRAIL对横纹肌肉瘤细胞的生长抑制率分别为52.5%和43.5%,凋亡诱导率为12.95%和10.26%,联合应用顺铂,生长抑制率和凋亡诱导率均显著高于单独应用(P<0.05),FCM分析显示联合应用提高了Fas蛋白的表达,RT-PCR显示cFLIPmRNA表达下降,与联合应用组细胞凋亡率增加相一致。结论:TRAIL和Ad／GT-TRAIL能有效诱导横纹肌肉瘤细胞的凋亡从而抑制横纹肌肉瘤细胞的生长,联合应用顺铂可显著提高疗效。     

单纯疱疹病毒胸苷激素酶基因在骨肉瘤细胞中的表达和作用

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－TK）及其底物丙氧乌苷（GCV）的基因治疗系统对骨肉瘤细胞株SAOS－2的杀伤作用。方法：用DOTAP将含有HSV－TK基因的真核表达质粒tgCMV-HyTK导骨肉瘤细胞株SAOS－2;提取阳性转染细胞（SAOS－2TK）的总RNA,用斑点杂交的方法检测HSV－TK基因的表达;用MTT比色法测定SAOS－2TK细胞对GCV的敏感性及“旁观者效应”。结果：SAOS－2TK细胞能产生稳定的TK基因的转录物;SAOS－2TK细胞在GCV的作用下呈现明显的生长抑制效应,且观察到强效的“旁观者效应”。结论：HSV－TK／GCV系统能够选择性杀死骨瘤细胞。     

Adenovirus-mediated TRAIL expression and downregulation of Bcl-2 expression suppresses non-small cell lung cancer growth in vitro and in vivo

Primary or acquired resistance to current treatment methods remains a major factor in clinical oncology and may be caused by failures in apoptosis programs. TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) can induce apoptosis in several human cancer cell types. However, not all cancer cells are susceptible to TRAIL and mechanisms of resistance and new strategies to enhance sensitivity are an area of intense investigation. Therefore, we investigated whether TRAIL resistance is due to Bcl-2 levels. In this study, we generated an adenoviral vector, Ad5.TRAIL/siBcl2, that permitted co-expression of shRNA against Bcl-2 and the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) therapeutic gene from a cytomegalovirus promoter. Infection with Ad5.TRAIL/siBcl2 resulted in significant cytotoxicity in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells in vitro. In contrast, it had no effect on a normal lung cell line, WI-38. Impressively, treatment of the established NSCLC tumor model with Ad5.TRAIL/siBcl2 resulted in significant tumor regression, compared with other adenoviruses. This potent antitumor activity induced by Ad5.TRAIL/siBcl2 was due to strong inhibition of Bcl-2 and high expression of TRAIL. Thus, this study may provide a framework for future clinical applications of Ad5.TRAIL/siBcl2 in lung tumor gene therapy.     

Interleukin-2 activated NK cells do not use the CD95L- and TRAIL-pathways in the rapid induction of apoptosis of rat colon carcinoma CC531s cells

Natural Killer (NK) cells can induce apoptosis in target cells in at least four ways: by secretion of granzyme B/perforin (GrB/P) and via the CD95L, TRAIL and TNF-α pathways. In this study we examined the pathways used by interleukin-2 activated rat NK (A-NK) cells to induce apoptosis in the rat colon carcinoma cell line CC531s. Co-incubation of A-NK cells with CC531s cells for three hours resulted in 70% apoptosis in the latter. Addition of the GrB/P pathway-inhibitor concanamycin A reduced the number of apoptotic cells to 54%. Blockade of the CD95L, TRAIL and TNF-α pathways by specific antibodies hardly had an additional effect. However, co-incubation with transfected MEC cells that expressed CD95L or 2PK3-cells that expressed TRAIL did induce apoptosis in CC531s cells. Furthermore the A-NK cells contained CD95L and TRAIL. However, comparison of non- and permeabilized cells revealed that the majority of TRAIL was present in the cytosol of A-NK cells and was not available for induction of apoptosis. The presence of elevated levels of bcl-2 in CC531 cells reduced the sensitivity towards induction of apoptosis both by A-NK cells as well as the CD95L and TRAIL expressing cell lines. Using the caspase-inhibitors ac-IEPD-CHO, ac-DEVD-CHO and zVAD-fmk, it was shown that inhibition of the effector caspase-3 prevented A-NK cell induced apoptosis in CC531-bcl-2 cells, but not in CC531s cells. In conclusion, A-NK cells kill by secretion of GrB/P and not by the CD95L, TRAIL or TNF pathways albeit both CD95L and TRAIL are produced by the A-NK cells.     

Osteosarcoma and chondrosarcoma as targets for virus vectors and herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir gene therapy

Osteosarcoma and chondrosarcoma, the most prevalent primary malignant tumors of the bone, have been demonstrated to be potential target diseases for herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV-TK)/ganciclovir (GCV) suicide gene therapy. However, the utility of this gene therapy form for bone tumor cells has not been studied systematically. In this report we show, with the aid of three osteosarcoma cell lines (Saos-2, U-2-OS and MG-63) and one chondrosarcoma cell line (SW1353) that: i) these tumor cells were permissive for adenovirus- or lentivirus-mediated gene delivery; ii) the cell lines appeared to be good or excellent targets for HSV-TK/GCV gene therapy; and iii) the extent of HSV-TK/GCV cytotoxic effect correlated with the presence of the 'bystander effect' in these cells. Our results also suggest that lentiviruses are potential vectors for bone cancer gene therapy. They transduced all four cell lines with high efficiency and provided HSV-TK expression level that was sufficient for cytotoxicity and bystander effect comparable to that obtained with adenovirus vectors.     

HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的研究

目的探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.结果载体HSV-TK导入了PA317细胞.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg/ml)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小约11.1%、30.6%和47.2%(均P＜0.001);RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达;实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变.结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因介导GCV治疗人膀胱癌的实验研究

探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virous thymidine kinase,HSV-TK)基因介导的丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)系统对人膀胱癌细胞(T24)生长的抑制作用。利用电穿孔技术将携有HSV-TK基因的重组逆转录病毒载体(pLXSN-TK)导入包装细胞PA317,获得转染后的逆转录病毒包装细胞PA317／TK。将BALB／c裸鼠24只随机分为4组(每组6只),建立人T24裸鼠荷瘤模型。治疗1,2组分别瘤内注射病毒悬液或PA317／TK细胞后再经GCV处理。对照1,2组则分别瘤内注射等量生理盐水或：PA317／TK细胞后再经等量GCV或生理盐水处理。观察各组肿瘤体积和瘤重的变化;采用原位杂交技术分析HSV-TK基因在肿瘤组织中的表达;采用流式细胞仪技术(Flow cytometry,FCM)和末端脱氧核苷酸介导的X-dUTP缺口末端标记技术(Termininal deoxynucleofidyl trasferase-mediated dUTP nick end labelling technigue,TUNEL)检测膀胱癌细胞凋亡。结果表明：(1)逆转录病毒介导的HSV-TK基因在体内能转染T24细胞,联合运用GCV后,肿瘤的生长速度明显减慢;(2)HSV-TK／GCV治疗后膀胱癌细胞凋亡现象明显增强。以上结果提示T24荷瘤裸鼠内HSV-TK／GCV系统对T24细胞的生长有明显的抑制作用,且可能与细胞凋亡引起的“旁观者效应”有关。HSV-TK／GCV系统在人类膀胱癌治疗方面具有明显的临床运用前景。     

Antitumor activity of TRAIL recombinant adenovirus in human malignant glioma cells

Tumor necrosis factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL) has been reported to specifically kill malignant cells but to be relatively nontoxic to normal cells. One of disadvantages to previous in vivo protocols was the need for large quantities of TRAIL recombinant protein to suppress tumor growth. To evaluate the antitumor activity and therapeutic value of the TRAIL gene, we constructed adenoviral vectors expressing the human TRAIL gene (Ad.hTRAIL) and transferred them into malignant glioma cells in vitro and tumors in vivo, as an alternative to recombinant soluble TRAIL protein. The results show that TRAIL-sensitive glioma cells infected Ad.hTRAIL undergo apoptosis through the production and expression of TRAIL protein. The in vitro transfer elicited apoptosis, as demonstrated by the quantification of viable or apoptotic cells and by the analysis of cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase. Furthermore, in vivo administration of Ad.hTRAIL at the site of tumor implantation suppressed the outgrowth of human glioma xenografts in SCID mice. These results further define Ad.hTRAIL as an anti-tumor therapeutic and demonstrate its potential use as an alternative approach to treatment for malignant glioma.