碱性成纤维细胞生长因子对庆大霉素致肾小管上皮损伤的拮抗效应

背景:体内实验证实成纤维细胞生长因子能有效保护庆大霉素致肾小管上皮细胞的损伤,但对体外培养细胞的作用如何不多见.目的:在建立庆大霉素肾毒性体外细胞模型的基础上,观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子对庆大霉素肾毒性的保护作用.方法:采用酶加网筛方法分离纯化昆明小鼠肾小管上皮细胞,调整细胞浓度为1×10~8L~(-1),将细胞悬液移入96孔细胞培养板,分组培养:空白对照组:正常培养:庆大霉素组:10,30,50 μL/孔(即400,1 200,2 000 U/孔)记为G1、G2、G3:碱性成纤维细胞生长因子组:20,50,80μL/孔(HP 90,225,360 ng/孔)记为B1、B2、B3:庆大霉素加碱性成纤维细胞生长因子干预组:先加碱性成纤维细胞生长因子12 h后,再加庆大霉素12 h培养,分9个剂量组,即G1B1、G1B2、G1B3、G2B1、G2B2、G2B3、G3B1、G3B2、G3B3,每组4复孔.观察细胞形态及数量变化.结果与结论:庆大霉素对肾小管上皮细胞的损伤呈剂量依赖性,中、高浓度组的上皮细胞皱缩,变圆,肿胀,贴壁差,内部胞质破坏严重,结构紊乱,低浓度组细胞数量改变不明显,并且开始有成纤维细胞出现;碱性成纤维细胞生长因子各组细胞饱满、折光性强,数量明显增多,50 μL/孔浓度以上效果显著,与80 μL/孔差异无显著性意义;庆大霉素加碱性成纤维细胞生长因子干预组中低浓度庆大霉素组细胞未见明显损害,细胞数量反而增多,中浓度庆大霉素组损害的细胞崩解减少、细胞皱缩和贴壁差的程度有所减轻,高浓度碱性成纤维细胞生长因子干预后细胞形态良好,但高浓度庆大霉素所致细胞肿胀、坏死损伤任何浓度的碱性成纤维细胞生长因子干预都无法改善.50 μL/孔碱性成纤维细胞生长因子对中、低浓度庆大霉素所致肾毒性有拮抗作用,对高浓度庆大霉素所致肾毒性无保护作用.     

硒化壳聚糖对体外培养成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的:观察硒化壳聚糖在成纤维细胞生长过程中的作用。方法:实验于2004-01/12在郧阳医学院附属太和医院完成。选取体外培养的第6代成纤维细胞,分为对照组和药物组。药物组浓度为25,50,100,200和400mg/L,分别加入由培养基稀释成的同等体积不同浓度的硒化壳聚糖,对照组加入等体积培养基。5×108L-1接种于24孔板,培养24h后,加入不同浓度硒化壳聚糖继续培养48h,收集细胞用于电镜观察;5×106L-1接种于96孔板,培养48h后,加入不同浓度的硒化壳聚糖,继续培养24h,分别加入3H-脱氧胸腺嘧啶核苷酸或3H-脯氨酸再作用24h,液闪计数仪测定每分钟计数值来反映细胞增殖及胶原合成的情况。结果:①对细胞增殖的影响:药物组与对照组比较,细胞核均有不同程度的增大,核浆增大,核仁变大,变多,扩张的内质网增多,细胞表面突起增加,线粒体更为丰富,更易见到聚集成团的糖原。②对DNA影响:400mg/L组3H-脱氧胸腺嘧啶核苷酸掺入量高于对照组犤(18658±356.42,10564±356.47)min-1,P<0.01犦;③对细胞胶原合成的影响:100mg/L组3H-脯氨酸掺入量高于对照组犤(2867±224.09,1762±186.22)min-1,P<0.01犦。结论:创面愈合过程中,硒化壳聚糖可促进皮肤成纤维细胞分裂增殖及胶原合成,促进创面愈合。具有量效关系。     

胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖和分化的影响

背景:研究表明,胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对细胞的增殖分化有重要作用,但对人类牙乳头间充质细胞生物学特性有何影响尚不清楚.目的:观察胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人类牙乳头间充质细胞增殖和分化能力的影响.方法:在建立人类牙乳头间充质细胞培养模型的基础上,①分别用含体积分数为1%或10%胎牛血清的DMEM/F12培养基将两种生长因子配制成不同的实验终浓度,取第4代生长良好的人类牙乳头间充质细胞,分别加入含0,0.1,1,10,100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和0,25,50,75,100 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ的培养基(0 μg/L作对照),培养96 h后四甲基偶氮唑盐法测增殖活性.②设10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组、100 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ组、碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子Ⅰ组和对照组.同上述方法每孔分别加含相应质量浓度生长因子的培养液,分别在培养1,3,5,7 d后,四甲基偶氮唑盐法测细胞增殖活性,改良酶动力学法测定细胞碱性磷酸酶活性.结果与结论:在0～100 μg/L质量浓度范围时,两种生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖具有促进作用,碱性成纤维细胞生长因子的促增殖作用比胰岛素样生长因子Ⅰ大,联合作用时有协同促增殖作用.碱性成纤维细胞生长因子的最大有效质量浓度为10 μg/L,胰岛素样生长因子Ⅰ的最大作用质量浓度为100 μg/L.在0～7 d时,碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞的碱性磷酸酶活性影响不明显,随时间的增加,胰岛素样生长因子Ⅰ对细胞碱性磷酸酶活性影响增加,与碱性成纤维细胞生长因子联用时,对增加碱性磷酸酶的活性有协同作用.     

钙通道阻滞剂对体外培养神经瘢痕成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响

目的:钙通道阻滞剂可抑制瘢痕成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的分泌,减少瘢痕的增生.实验拟进一步观察钙通道阻滞剂对体外培养神经瘢痕成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响.方法:实验于2006-03/06在吉林大学中日联谊医院中心实验室完成.①实验材料:Wistar大鼠10只;盐酸维拉帕米注射液为上海禾丰制药有限公司产品.②实验过程及分组:制作大鼠双侧坐骨神经损伤模型,术后2周取损伤处神经瘢痕,按组织块法培养神经瘢痕成纤维细胞,实验所用细胞为4～8代,分4组,其中3组培养基中维拉帕米药物浓度分别为10,50及100 μmol/L,1组为空白对照组.③实验评估:分别用四甲基偶氮唑盐法观察细胞增殖能力、羟脯氨酸比色法测定细胞上清液中的胶原含量和胞浆中的胶原含量.结果:①四甲基偶氮唑盐法观察细胞增殖结果:钙通道阻滞剂对神经瘢痕成纤维细胞的生长增殖具有明显抑制作用,且呈现剂量依赖性(P ＜ 0.05).②羟脯氨酸比色法测定胶原含量:钙通道阻滞剂可使分泌到细胞培养上清中的胶原含量明显减少,以100 μmol/L浓度组作用最为显著(P ＜ 0.05);胞浆中的胶原含量增加,具有明显剂量依赖性,以100μmol/L浓度组作用最为显著(P ＜ 0.05).结论:钙通道阻滞剂可以抑制神经瘢痕成纤维细胞的增殖及胶原分泌.     

联合应用地塞米松和维甲酸诱导兔骨髓基质细胞向成骨方向的转化

目的:观察维甲酸和地塞米松对兔骨髓基质细胞的成骨诱导影响,探讨二者联合诱导兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的可能性和适当条件,使兔骨髓基质细胞向成骨诱导得以优化,从而为临床治疗骨缺损提供实验基础。方法:实验于2005-12/2006-3在锦州医学院附属第一医院骨科实验室完成。①体外培养兔骨髓基质干细胞。②用不同的诱导剂将其向类成骨细胞诱导。实验分非诱导组(用DMEM培养基培养),地塞米松诱导组(培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C),维甲酸诱导组(培养基中加入维甲酸),地塞米松与维甲酸联合诱导组(培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C和维甲酸)。③通过倒置相差显微镜对细胞的形态进行观察;于第4,6,8,10,12天定量检测其分泌的碱性磷酸酶;应用原位杂交技术检测Ⅰ型胶原的表达情况。结果:①原代和传代培养时不同组别兔骨髓基质细胞的生长情况:地塞米松诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,维甲酸诱导组细胞与神经干细胞类似,地塞米松与维甲酸联合诱导组细胞与地塞米松诱导组细胞形态变化大体一致,但细胞更饱满,多角形细胞比例更高,部分区域细胞呈现漩涡状分布。②各组碱性磷酸酶活性检测结果:非诱导组碱性磷酸酶表达量低,随时间略有增加;地塞米松诱导组碱性磷酸酶表达呈曲线升高[6,8,10,12d依次为(265.9±47.3),(445.4±69.4),(650.3±52.0),(703.6±62.5)nkat/L];维甲酸诱导组基本无碱性磷酸酶表达;地塞米松与维甲酸联合诱导组碱性磷酸酶表达趋势与地塞米松诱导组相似,但绝对值有所增高[6,8,10,12d依次为(355.4±62.2),(631.3±84.4),(925.0±69.0),(1039.5±85.2)nkat/L]。③各组原位杂交技术检测Ⅰ型胶原结果:地塞米松诱导组和地塞米松、维甲酸联合诱导组检测Ⅰ型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒,非诱导组与维甲酸诱导组为阴性。结论:适当浓度地塞米松可成功的将兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导,维甲酸与地塞米松联合诱导可使成骨能力进一步加强,表现为碱性磷酸酶表达明显增高,并表达Ⅰ型胶原,具体浓度条件有待进一步研究。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

碱性成纤维细胞生长因子/双层胶原基复合材料制备及其生物安全性

背景:胶原特殊的分子结构和生物活性有利于多种细胞黏附、增殖和分化,并可降解为新生组织提供足够空间。目的:制备一种复合负载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子双层胶原基复合材料,并评价其生物安全性。方法:制备交联风干胶原膜和交联冻干胶原膜。将壳聚糖-肝素纳米粒滴于交联冻干胶原膜上,再将湿态交联风干胶原膜置于复合纳米粒子的交联冻干胶原膜上风干,即碱性成纤维细胞生长因子/双层胶原基复合材料。采用急性全身毒性试验、溶血试验、热原试验和细胞毒性试验评价其生物安全性。结果与结论:碱性成纤维细胞生长因子/双层胶原基复合材料为双层结构,一侧表面致密,另一侧疏松多孔。在其中间负载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子呈不规则球形分布于胶原膜内侧面;急性全身毒性试验、热原试验、溶血试验均为阴性,细胞毒性为0级。说明碱性成纤维细胞生长因子/双层胶原基复合材料具有良好的生物安全性,对机体无毒,符合ISO10993-1评价标准。     

碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞内核心蛋白多糖基因表达的影响(英文)

目的:研究己证实,碱性成纤维细胞生长因子刺激牙周膜细胞后可促进人牙周膜细胞的增殖,以利于重建丧失的牙周组织.利用不同质量浓度碱性成纤维细胞生长因子刺激体外培养的人正常牙周膜细胞,观察牙周膜细胞内核心蛋白多糖基因表达.方法:采用胰酶消化法分离培养牙周膜细胞.取第3代对数生长期的细胞,加入含有10%二甲基亚砜和含体积分数20%胎牛血清冻存液的DMEM中进行冻存,第2天移入液氮中保存.免疫组织化学方法行抗波形丝蛋白、角蛋白染色鉴定.取第6代人牙周膜细胞,分为实验组和空白组.实验组分别用含质量浓度为0.1,1,10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养液标准条件下培养24 h;空白组用DMEM培养液标准条件下培养24 h.RT-PCR法检测细胞内核心蛋白多糖基因表达变化.结果:镜下观察空白组细胞未见明显变化,实验组可见细胞增殖,刺激前瓶底细胞较稀疏的区域变得密集了.加入碱性成纤维细胞生长冈了的牙周膜细胞内核心蛋白多糖的mRNA表达水平明显下降了,而且随着碱性成纤维细胞生长因子质量浓度的增加,抑制作用逐渐减弱,在0.1 μg/L时抑制作用最强,在10 μg/L时抑制作用最弱.结论:碱性成纤维细胞生长凶子刺激可促进牙周膜细胞增殖,呈剂量依赖性抑制核心蛋白多糖的合成,0.1 μg/L时抑制作用最强.     

大蒜素对牙龈成纤维细胞胶原代谢的影响

目的:体外评价大蒜素对人牙龈成纤维细胞(HGF)胶原代谢的影响。方法:将不同浓度大蒜素加入体外培养的HGF48h后,细胞免疫荧光化学方法检测细胞内Ⅰ型胶原含量;化学比色法测定细胞培养上清液中羟脯氨酸含量。结果:大蒜素在一定浓度范围导致HGF胞浆内Ⅰ型胶原合成显著减少、细胞上清液中胶原蛋白含量显著降低(P<0.05)。结论:大蒜素对体外培养的HGFⅠ型胶原合成及胶原分泌有抑制作用,提示大蒜素有防止牙龈纤维化的作用。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转移对成骨细胞生长特性的影响

目的:碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)对骨组织的损伤有修复作用,许多体内外实验均表明外源性植入碱性成纤维细胞生长因子能明显促进骨形成过程。观察碱性成纤维细胞生长因子基因转移对成骨细胞生长特性的影响。方法:实验于2003-01/07在解放军广州军区总医院医学实验科完成。成年雄性新西兰白兔,体质量1.5～2.5kg,采用聚乙烯亚胺(jetPEITM)介导真核分泌表达载体pcDNA3.1-bFGF及非分泌表达载体pEGFP-C3-bFGF转染原代培养的成骨细胞,消化收集转染成骨细胞以及未经转染的成骨细胞,利用血细胞计数器进行细胞计数,绘制细胞生长曲线,同时测定DNA浓度、碱性磷酸酶及骨钙素含量的变化。结果:①未转染的细胞在第8天进入稳定期,而经转染的细胞在第10天才进入稳定期。未转染细胞最终达到的细胞数量为(1.70±0.02)×109L-1,而经转染的细胞数量为(2.10±0.03)×109L-1,差异显著(P<0.05)。②经pcDNA3.1-bFGF转染的成骨细胞的DNA量最高,约为(255±20)mg/L,而经pEGFP-C3-bFGF转染的成骨细胞的总DNA量约为(225±20)mg/L,未经转染的成骨细胞的总DNA量为(100±10)mg/L。③pcDNA3.1-bFGF转染的成骨细胞培养至第9天后,碱性磷酸酶分泌量为(8.0±0.22)IU/mL;而未转染的成骨细胞碱性磷酸酶分泌量为(13.12±0.18)IU/mL。经pEGFP-C3-bFGF转染的成骨细胞所分泌的碱性磷酸酶与未经转染的细胞的分泌量相当,约为(12.56±0.24)IU/mL。④随着培养时间的延长,骨钙素分泌量的变化趋势与碱性磷酸酶相同,但重组质粒转染成骨细胞与未转染细胞最终分泌的骨钙素量差异无显著性(P>0.05)。结论:①经pcDNA3.1-bFGF及pEGFP-C3-bFGF重组质粒转染后,成骨细胞的生长特性有一定的变化,与添加外源碱性成纤维细胞生长因子的影响基本相同。②pcDNA3.1-bFGF转染的细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子能够促进细胞分裂增殖,降低碱性磷酸酶的表达,而pEGFP-C3-bFGF转染的细胞不能分泌表达蛋白,难以发挥其生物学功能。     

辛伐他汀对大鼠肺成纤维细胞功能及其抑制通路的影响

背景他汀类药物可以通过阻断甲羟戊酸的合成,抑制某些膜联结蛋白的翻译后修饰,从而阻断某些细胞内信号传导通路,抑制多种细胞的增殖.目的探讨辛伐他汀对肺成纤维细胞的增殖、胶原合成及基质金属蛋白酶2分泌的影响.设计完全随机设计,对照实验.单位中国协和医科大学阜外心血管病医院器官移植研究室.材料实验于2004-06/2004-10在中国协和医科大学北京协和医院心内科实验室完成.培养的新生SD大鼠的肺盛纤维细胞,根据培养液中加入的干预药物浓度不同而分为辛伐他汀0,1,5,10,50μmol/L及辛伐他汀50 μmol/L+甲羟戊酸200 μmol/L组.方法用消化法培养新生SD大鼠的肺成纤维细胞,给予不同浓度的辛伐他汀干预.四氮唑蓝比色法检测细胞增殖,细胞免疫组化法测定细胞胶原的合成,酶联免疫吸附法测定细胞培养上清液基质金属蛋白酶2的含量.主要观察指标不同浓度辛伐他汀及辛伐他汀加甲羟戊酸干预后肺成纤维细胞增殖和胶原合成能力,以及基质金属蛋白酶2分泌量.结果①辛伐他汀5,10,50 μmol/L组四氮唑蓝比色A490值,肺成纤维细胞表达Ⅰ,Ⅲ型胶原的平均吸光度值(A值)及培养上清液中的基质金属蛋白酶2含量明显低于辛伐他汀0 μmol/L组(0.520±0.010,0.334±0.011,0.260±0.012,0.111±0.011;0.508±0.011,0.324±0.014,0.232±0.015,0.083±0.015;0.445±0.017,0.305±0.015,0.216±0.015,0.068±0.012;0.561±0.013,0.361±0.012,0.289±0.012,0.140±0.013,t=3.359～8.111,P＜0.05～0.01).②辛伐他汀50 μmol/L+甲羟戊酸200 μmol/L组四氮唑蓝比色A490值,肺成纤维细胞表达Ⅰ,Ⅲ型胶原的平均吸光度值(A值)及培养上清液中的基质金属蛋白酶2含量明显高于辛伐他汀50 μmol/L组(0.567±0.015,0.354±0.014,0.283±0.012,0.138±0.011,t=4.715～10.950,P＜0.01).结论辛伐他汀能抑制肺成纤维细胞增殖和胶原合成,并可减少基质金属蛋白酶2的分泌,抑制肺成纤维细胞黏附迁移功能,并可通过影响甲羟戊酸通路而具有抗细胞增殖作用.     

异丙酚对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用及机制

目的探讨不同剂量异丙酚对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用和机制。方法 100只出生1~3 d的Wistar大鼠进行心肌成纤维细胞的分离与培养后,将细胞分为对照组(细胞培养基中加入1 mL含体积分数1%小牛血清的DMEM培养基)、AngⅡ组(细胞培养基中加入1 mL 1.0×10-7 mol/L AngⅡ),AngⅡ+异丙酚0.5 mmol/L组(细胞培养基中加入1 mL 1.0×10-7 mol/L AngⅡ+0.5 mmol/L异丙酚)、AngⅡ+异丙酚1.0 mmol/L组(细胞培养基中加入1 mL 1.0×10-7 mol/L AngⅡ+1.0 mmol/L异丙酚)、AngⅡ+异丙酚1.5 mmol/L组(细胞培养基中加入1 mL 1.0×10-7 mol/L AngⅡ+1.5 mmol/L异丙酚)。采用MTT法检测各组细胞生长抑制率,采用PCR法检测各组细胞α-SMA mRNA相对表达量,采用Western blot法检测各组细胞总蛋白含量。结果培养48 h,AngⅡ组细胞生长抑制率[(14.23±1.17)%]低于对照组[(23.32±2.15)%]、AngⅡ+异丙酚0.5 mmol/L组[(24.19±1.36)%]、AngⅡ+异丙酚1.0 mmol/L组[(29.25±2.30)%]及AngⅡ+异丙酚1.5 mmol/L组[(31.37±2.19)%](P<0.05),AngⅡ+异丙酚1.5 mmol/L组、AngⅡ+异丙酚1.0 mmol/L组、AngⅡ+异丙酚0.5 mmol/L组细胞生长抑制率依次降低(P<0.05);AngⅡ组心肌成纤维细胞α-SMA mRNA相对表达量(2.05±0.23)、总蛋白含量(225.06±18.66)均高于对照组(0.98±0.12、150.65±11.23)、AngⅡ+异丙酚0.5 mmol/L组(1.78±0.25、197.54±11.56)、AngⅡ+异丙酚1.0 mmol/L组(1.50±0.11、182.51±10.14)和AngⅡ+异丙酚1.5 mmol/L组(1.12±0.05、168.26±11.05)(P<0.05),AngⅡ+异丙酚0.5 mmol/L组、AngⅡ+异丙酚1.0 mmol/L组、AngⅡ+异丙酚1.5 mmol/L组及对照组心肌成纤维细胞α-SMA mRNA相对表达量及总蛋白含量依次降低(P<0.05)。结论异丙酚具有抑制AngⅡ诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖的作用,且随剂量增加,抗心肌成纤维的作用逐渐增强。     

多孔聚乳酸／骨基质明胶生物活性复合材料骨诱导活性实验

背景: 目前复合材料已成为骨移植材料研究的热点, 多孔聚乳酸 /骨基质明胶复合活性材料的应用有待研究。目的: 采用超临界二氧化碳合成法制备多孔聚乳酸 / 骨基质明胶复合活性材料, 体外评价其骨形成能力。设计: 观察对比实验。单位: 南方医科大学组织工程研究中心, 中国辐射防护研究院生物材料制药技术研究所。材料: 小鼠 MC3T3-E1 成骨前体细胞从日本 RIKEN 细胞库获得, 聚乳酸由暨南大学提供。碱性磷酸酶检测试剂为南京建成生物工程研究所产品。小鼠 MC3T3-E1 成骨前体细胞在含 100 g/L 胎牛血清 ( 四季青) 、100 mg/L 青霉素和 100 U/L 链霉素的 DMEM 培养基(Gibco, 美国) 培养, 用 0.25%胰酶(Gibco, 美国) 传代。方法: 实验于 2005- 10/2006- 07 在南方医科大学组织工程研究中心广东省重点实验室完成。采用超临界二氧化碳法制备多孔聚乳酸 / 骨基质明胶复合材料, 并通过大体及扫描电镜观察复合情况。在体外将聚乳酸、聚乳酸 / 骨基质明胶与 MC3T3-E1 小鼠成骨前体细胞共培养, 分别为聚乳酸组及聚乳酸 / 骨基质明胶组, 正常培养基作为对照组, 数码相机拍摄每组培养孔图像, 图像处理与分析软件测定被染色面积占培养孔面积百分比, 即为钙化结节面积百分比。采用细胞超声裂解法检测各组细胞内钙含量及碱性磷酸酶活性。主要观察指标: ①聚乳酸 / 骨基质明胶大体及扫描电镜观察结果; ②钙化面积的定量测定。③钙含量及碱性磷酸酶活性测定。结果: ①聚乳酸 / 骨基质明胶大体及扫描电镜观察结果: 复合材料骨基质明胶与聚乳酸混合均匀, 材料孔隙分布均匀, 孔隙大小在 50～150 μm之间, 孔洞联通性好。在这些大孔隙的壁上, 仍有大量 5～10 μm 的孔隙。②钙化结节面积测定结果: 聚乳酸 / 骨基质明胶复合材料组、聚乳酸组、空白对照组钙化结节形成面积百分比分别为 (42.98±4.44)%,(9.55±1.94)%, (0.86±0.41)%, 组间比较差异均有统计学意义 (P <0.01) 。③钙含量及碱性磷酸酶测定结果: 聚乳酸 / 骨基质明胶复合材料组、聚乳酸组和空白对照组的碱性磷酸酶活性分别为 (5 427.58±1 173.57), (1 060.54±500.27), (40.01±24.50) nkat/g, 组间比较均有统计学意义(P < 0.05～0.01) ; 聚乳酸 / 骨基质明胶复合材料组钙含量为(3.51±1.64)mmol/g, 高于聚乳酸组和空白对照组[(1.04±0.21) , (0.70±0.24)mmol/g, P < 0.01]。结论: 采用超临界二氧化碳合成法制备的聚乳酸 /骨基质明胶多孔复合支架材料具有良好的骨诱导活性, 有可能作为一种有前景的骨植入材料及骨组织工程支架材料。     

兔主动脉内皮细胞培养及鉴定:内皮细胞分离方式及培养条件的改良

背景:获取内皮细胞的方法有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种.一直以来,内皮细胞的培养方法也在不断的更新.目的:探讨兔主动脉内皮细胞的培养和鉴定方法.方法:取1周龄新西兰大耳白兔主动脉,剥去外膜,内膜面向下铺入2 g/L Ⅰ型胶原酶、2 g/L Ⅲ型胶原酶,2 g/L Ⅳ型胶原酶和2 g/L Ⅴ型胶原酶混合消化液中(按1:1:1:1:1混合)消化20min,按1:1加入培养基以终止消化.轻轻刮下内膜层细胞,将细胞悬液离心,用DMEM培养液(含胎生血清20%、VEGF 1 μg/L、bFGF 2 μg/L,庆大霉素6 U/L)混匀沉淀细胞,吹打分散至单个细胞培养,48 h后用首次换液.再按1:2分瓶传代培养.采用倒置相差显微镜观察细胞培养结果.免疫组织化学及免疫荧光鉴定Ⅷ因子相关抗原.电镜观察Weibel-Paladed小体.结果与结论:体外获得并培养5代内皮细胞.Ⅷ因子相关抗原及电镜观察W-P小体均证实实验成功的培养了原代及传代内皮细胞.提示兔主动脉内皮细胞可从主动脉获得并通过培养成为细胞系,Ⅷ因子相关抗原及电镜观察W-P小体联合鉴定是确定内皮细胞的良好方法.     

肺成纤维细胞三维立体培养条件对肺纤维化组织重塑的影响

背景：组织细胞三维立体培养是肺纤维化破坏与组织收缩研究的理想模型,特别是在纤维化的进展过程中,几种细胞因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素、前列腺素、胰岛素以及渗出的血浆成分可能在纤维化的损伤修复和组织重塑中起重要的作用。目的：观察三维立体培养条件下肺成纤维细胞在血清和血清蛋白、胰岛素和细胞因子前列腺素E2、转移生长因子β、肿瘤坏死因子α的细胞外胶原基质收缩和细胞凋亡,探讨肺纤维化过程中细胞因子、胰岛素、血清及血清蛋白对肺组织重塑和纤维化形成的影响。设计：随机对照实验。单位：解放军兰州军区兰州总医院呼吸内科。材料：实验于2005-08/2006-01在解放军兰州军区兰州总医院呼吸内科实验室完成。人胚肺成纤维细胞（AmericanTypeCultureCollection）,DMEM培养液和胎牛血清（GIBCO）,胰岛素、转移生长因子（R＆D）,前列腺素E2（Sigma）,Ⅰ型胶原提取自大鼠尾部肌腱。方法：为观察初始浓度对成纤维细胞收缩力的影响及细胞数量对胶原收缩的影响,提取大鼠尾部的胶原,与双蒸水、4×DMEM及成纤维细胞混合成胶原含量为0.75-1.5g/L的立体组织胶原,细胞浓度为0.2×10^7-4×10^7L^-1,置入含体积分数0.05的CO2培养箱37℃培养。每天测定胶原的面积,最后计算终面积与初始面积的比值。将0.01%-0.5%血清、0.1%的血清白蛋白和0.1%球蛋白分别加入到培养液中,观察胶原的收缩。加入10mg/L转移生长因子、10mg/L白细胞介素1、1mmol/L胰岛素和0.1μmol/L前列腺素E2,观察细胞因子对成纤维细胞介导胶原收缩的影响,对胶原中DNA含量进行测定及细胞存活率检测。主要观察指标：不同细胞因子或血清成分对肺成纤维细胞介导胶原收缩的影响,胶原内成纤维细胞数量对胶原收缩的影响,以及不同浓度胶原对胶原收缩和对细胞增殖和凋亡的影响。结果：①胶原的收缩有细胞依赖性,细胞浓度越高则胶原收缩越强烈。②血清和白蛋白的加入引起了剧烈的胶原收缩。③转化生长因子和胰岛素增强胶原的收缩,前列腺素E和白细胞介素1抑制胶原的收缩。④胶原的初始浓度越低,胶原收缩的速度越快越强烈,胶原终面积就越小,其中的成纤维细胞凋亡就越多。结论：肺成纤维细胞介导的胶原收缩可被白细胞介素1和前列腺素E抑制,胰岛素和转化生长因子则促进了胶原收缩。血清及血清成分在受损肺组织的渗出可以导致肺组织胶原的稀释与强烈收缩,而导致成纤维细胞增殖的抑制和凋亡的增加,肺纤维化进一步发展,成为无细胞胶原成分。     

表皮生长因子促进真皮成纤维细胞生长的机制

目的探讨表皮生长因子(EGF)对真皮成纤维细胞中cyclinD1和CDK-4表达的影响,从细胞周期的角度认识EGF促进真皮成纤维细胞生长的机制。方法研究对象为大鼠真皮成纤维细胞,用含100ml/L胎牛血清的DMEM,加入50mg/L的EGF培养SD大鼠的真皮成纤维细胞,通过MTT检测、流式细胞仪分析观察细胞的生长状态,免疫组化检测cyclinD1和CDK-4的表达结合流式细胞仪分析来观察细胞的周期变化。结果MTT检测(加药前0.37±0.011,加药后0.55±0.008)、流式细胞仪结果(加药前9.1,加药后14.7)都显示50mg/L的EGF能显著促进真皮成纤维细胞的生长增殖,免疫组化结果显示,两者一致,加药后阳性明显增强。结论50mg/L的EGF对真皮成纤维细胞的生长有极大地促进作用,促进了细胞周期蛋白cyclinD1和CDK-4的表达增强,细胞G1期变短,增殖能力增强。     

缬沙坦对高糖环境中小鼠肾小球系膜细胞炎症介质的影响

目的 观察缬沙坦对高糖环境中小鼠肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)及细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响,探讨缬沙坦对糖尿病肾病的防治作用.方法 高糖环境中培养小鼠肾小球系膜细胞,于培养12、24、48小时,应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞增殖程度,分别应用免疫细胞化学和蛋白质印迹法检测系膜细胞MCP-1、ICAM-1蛋白表达水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清Ⅳ型胶原浓度.结果 高糖环境中小鼠肾小球系膜细胞MCP-1及ICAM-1表达增强,细胞增殖明显(0.815±0.007)A,细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度升高(17.29±1.95)μg/L,缬沙坦干预后MCP-1及ICAM-1表达减弱,细胞增殖受抑制(0.652±0.004)A,Ⅳ型胶原浓度降低(13.19±0.89)μg/L.结论 缬沙坦可下调MCP-1及ICAM-1表达,抑制系膜细胞增殖及系膜外基质积聚,发挥其独立于降压之外的肾脏保护作用.     

转化生长因子β1对肌腱腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞增殖和胶原产生的影响

背景:转化生长因子β是一种在组织损伤的修复和更新中具有多种生物学效应的细胞因子;腱鞘成纤维细胞和Ⅰ型胶原在肌腱愈合和粘连形成过程中起着重要的作用。目的:观察兔屈趾肌腱腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞增殖、胶原产生和转化生长因子β1对细胞的增殖和胶原产生的影响。设计:对比观察实验。单位:青岛大学医学院附属医院创伤外科。材料:实验于2004-07/2005-09在青岛大学医学院附属医院动物实验室完成,选用6只成年新西兰大白兔,雌雄不拘,体质量3.5～4.5kg,由青岛市实验动物中心提供。胶原酶(sigma),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原抗体(Sigma),转化生长因子β1(武汉博士德生物公司)。方法:按文献方法进行将实验兔屈趾肌腱分离腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞并培养,将3种细胞采用含血清培养液培养后,转移到不含血清的培养液中,分为实验组及对照组,实验组每孔加入5μg/L转化生长因子β1,对照组不予添加。主要观察指标:①用细胞计数法观察培养1,2,3,4d各组细胞增殖情况。②采用免疫细胞化学染色检测细胞培养4d后Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原的产生;通过酶联免疫吸附试验法定量检测2组细胞的各型胶原含量。③采用RT-PCR定量检测2组细胞Ⅰ型胶原基因的表达。④酶联免疫吸附试验法测定不同剂量的转化生长因子β1(0,5,10,15和20μg/L)作用于3种细胞的Ⅰ型胶原含量。结果:①每种细胞培养1d后增长率相近,培养2～4d,腱鞘细胞增殖率显著增高,与其他两种细胞增殖率比较,差异有显著性意义(P<0.05)。②免疫细胞化学染色显示3种细胞均可以产生Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原;酶联免疫吸附试验法定量测定胶原结果显示:各组腱鞘细胞产生的3种胶原量最多,且实验组各种细胞Ⅰ型胶原含量高于对照组(P<0.05～0.01)。③实验组腱鞘细胞Ⅰ型胶原基因表达比对照组增加1.3倍,差异有统计学意义(P<0.01),腱外膜细胞和腱内膜细胞表达也高于对照组(P<0.05)。④胶原产生量在5～10μg/L转化生长因子β1作用时明显增加,而转化生长因子β1增加到10～20μg/L时胶原产生量无明显改变。结论:转化生长因子β1可增加腱鞘成纤维细胞、腱外膜细胞和腱内膜细胞胶原的产生和Ⅰ型胶原的基因表达,在肌腱损伤后调节转化生长因子β1的水平可能对肌腱粘连的防止具有重要的作用。     

当归多糖对体外造血微环境中肌卫星细胞增殖的影响

背景: 肌卫星细胞是造血功能重建最有希望的种子细胞来源.当归多糖对造血干细胞和造血祖细胞的增殖分化存在显著的促进作用,也可以有效改变肌卫星细胞的生长特性.目的: 观察当归多糖对不同培养条件下乳鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响.方法: 分离小鼠肌卫星细胞,培养5 d后采用a一肌动蛋白免疫细胞化学鉴定.将细胞接种于96孔板培养24 h,使细胞同步化;将细胞分为空白对照组,骨髓基质细胞培养上清组,加入含50,100,200,300,400 mg/L当归多糖的DMEM/F12培养基实验组及经50,100,200,300,400 mg/L当归多糖干预后骨髓基质细胞条件培养基组.经实验处理后采用MTT法检测各组细胞的增殖活性.结果与结论: 分离培养的骨骼肌卫星细胞呈α-肌动蛋白染色阳性,通过MTT法检测发现,经不同浓度当归多糖干预后的骨髓基质细胞条件培养基培养的各组肌卫星细胞增殖显著.且经当归多糖干预的骨髓基质细胞条件培养基可以有效改变肌卫星细胞的生长特性,并呈剂量依赖性.