大肠癌相关免疫球蛋白新基因SNC73结构与表达研究

目的 研究由减式杂交方法获得的人大肠癌相关基因SNC734 结构和功能。方法 对SNC73的cDNA进行了核苷酸序列测定,分析得到全长序列,并对其编码的蛋白进行了分析及预测;采用In situ-Max荧光原位杂交方法结合荧光R带技术对SNC73在人染色体上的定位作了研究;利用Northern杂交、逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法检测了SNC73在多种肿瘤细胞系中的表达,及在大肠癌组织与这粘中膜中的表达情况;应用原位杂交／原位PCR技术检测SNC73 mRNA在肠上皮中的表达情况。结果 对SNC73序列及开放阅读框9ORF）进行分析,发现其与免疫球蛋白IgA高度同源,为一免疫球蛋白样基因。该基因定位于人染色体14q3 2。SNC73在大肠癌组织也 肠粘膜的表达有差异（P＜0.05）。SNC73在肠上皮表达阳性。结论 SNC73在大肠癌中低表达,可能为一新的肿瘤标记物,并提示上皮细胞、非淋巴细胞存在IgA类的蛋白。     

SEZ6基因在人肿瘤细胞的表达

目的 通过检测SEZ6基因在15种不同组织来源的人肿瘤细胞中的表达情况,以探讨SEZ6基因与肿瘤的发生、发展之间的关系,为进一步研究SEZ6基因的生物学功能提供理论依据.方法 体外培养15种不同组织来源的人肿瘤细胞,抽提总RNA,运用RT-PCR检测SEZ6基因的表达情况.结果 (1)SEZ6在肿瘤细胞K562、A2780、SHP-77、H1299、SGC 996、A549、H2122、SPCA、MHCC-97H、SW480、MDA-MB-435中表达,其中,在A2780、H1299、A549、MHCC-97H、SW480及MDA-MB-435细胞系中高表达,与阳性对照组无差异.另外,在6种肺癌细胞系中,5种(SHP-77、H1299、A549、H2122、SPCA)有SEZ6基因表达;(2)在高转移性肿瘤细胞MHCC-97H、SW480、MDA-MB-435、H1299和SHP-77中SEZ6高表达,与低转移性肿瘤细胞有显著性差异,P<0.05.结论 SEZ6基因在部分肿瘤细胞中表达,并在高转移性肿瘤细胞中高表达,提示SEZ6基因可能参与了肿瘤的发展过程,并与肿瘤的转移有关.     

人钠/碘转运体基因转染结肠癌SW480细胞及相关蛋白表达的检测

目的以重组人钠/碘转运体（hNIS）基因转染结肠癌SW480细胞并检测hNIS mRNA及蛋白的表达,为放射性碘治疗非甲状腺肿瘤提供新思路。方法将构建好的重组质粒（pcDNA3.1+-hNIS）进行酶切、测序鉴定并扩增、提取。SW480细胞分为重组质粒（pcDNA3.1+-hNIS）转染组、空白质粒（pcDNA3.1+）转染组、空白对照组,转染后以RT-PCR和Western blot检测各组细胞hNIS mRNA和蛋白的表达。结果酶切和测序结果显示插入的hNIS基因大小和方向均正确。RT-PCR和Western blot显示重组质粒转染组SW480细胞可见hNIS mRNA和蛋白的表达,而空白对照组和空白质粒转染组均未检测到hNIS mRNA和蛋白的表达。结论脂质体法可有效地将hNIS基因转染至SW480细胞并成功表达hNIS蛋白。     

骨桥蛋白抑制FHIT表达促进结肠癌细胞增殖存活

目的构建骨桥蛋白(OPN)基因真核表达载体,转染人结肠癌细胞SW480,研究其对SW480细胞增殖及生存能力的作用机制。方法构建重组表达载体pEGFP-N1/OPN,转染人结肠癌SW480细胞。采用RT-PCR及免疫印迹法(Westernblotting)分别检测SW480细胞OPN基因及蛋白表达量;Cell Counting Kit-8(CCK-8)测定细胞增殖;软琼脂克隆形成实验观察细胞的锚定非依赖性生长能力。Western blotting检测脆性组氨酸三联体基因(FHIT)和蛋白激酶B(PKB/Akt)蛋白在SW480细胞中的表达。结果重组质粒pEGFP-N1/OPN转染SW480后,OPN基因获得很好转录,OPN蛋白表达增高,细胞增殖率(光吸收值)显著高于转染阴性组(P<0.05),细胞软琼脂克隆形成速度增快,数量明显多于对照组和空载体组(P<0.05);FHIT蛋白在实验组表达降低,Akt蛋白在各组中的表达无显著性差异。结论 OPN基因通过抑制FHIT基因表达,促进SW480细胞增殖、独立存活能力。     

DLC-1基因重组慢病毒表达载体的构建及其在结直肠癌SW480细胞中的表达

目的：构建携带肝癌缺失基因-1（deleted in liver cancer-1,DLC-1）的重组慢病毒表达载体并实现DLC-1基因在结直肠癌（colorectal cancer,CRC）SW480细胞中的过表达。方法：将DLC-1基因的靶序列与载体质粒pcDNA3.1（+）-GFP连接成重组质粒。重组质粒经双酶切法及基因测序验证构建正确后包装成慢病毒颗粒并计算病毒滴度。重组慢病毒感染SW480细胞,同时设置阴性对照组和空白对照组流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测感染率;real-time PCR及Western blot检测SW480细胞中DLC-1基因表达水平。结果：重组质粒构建正确。重组慢病毒滴度为1×109 TU/ml;对SW480细胞的感染率为90%;DLC-1 mRNA在重组慢病毒组细胞中过表达;重组慢病毒组DLC-1 蛋白的表达水平显著高于阴性对照组（P=0.000）;阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.902）。结论：成功构建了高滴度的DLC-1基因重组慢病毒,其携带的DLC-1基因能够在CRC SW480细胞中过表达,为后续研究DLC-1基因的表达在CRC的发生、发展中的作用奠定了实验基础。     

pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒对结肠癌细胞增殖、细胞周期及侵袭性的影响

目的探讨在体外转化生长因子β1(TGF-β1)的真核表达载体对结肠癌细胞增殖?细胞周期及侵袭性的影响。方法将构建的重组质粒pEGFP-N1-TGF-β1转染入结肠癌细胞系SW480中,应用荧光显微镜、RT-PCR和Western blot检测TGF-β1基因的表达情况;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪分析SW480细胞周期变化;Transwell侵袭实验验证TGF-β1对细胞侵袭能力的影响。结果转染重组质粒pEGFP-N1-TGF-β1后,通过荧光显微镜观察到绿色荧光的表达,RT-PCR和Westernblot检测到TGF-β1基因的转录及蛋白表达增强(P0.05);细胞周期分析显示TGF-β1使细胞停留在G1期,S期细胞明显减少(P0.05),且SW480细胞的增殖受到明显抑制;Transwell侵袭实验显示:SW480细胞的侵袭能力明显增强(P0.01)。结论TGF-β1能抑制SW480细胞的增殖,使细胞停留在G1期,但同时能增强其侵袭能力。其作用可能与免疫抑制/逃逸、增加血管生成以及增加肿瘤细胞与细胞外基质的相互作用有关。     

siRNA靶向HDGF抑制大肠癌细胞SW480的生长

目的 肝癌衍生生长因子(HDGF)是近年来逐渐引起重视的一种细胞生长因子,在许多肿瘤细胞中高表达.本研究拟构建PNAi干扰慢病毒载体,沉默HDGF基因在大肠癌SW480细胞中的表达,观察细胞的增殖状态.方法 RT-PCR方法 检测HDGF基因在大肠癌中的表达.利用Invitrogen公司在线网站设计HDGF干扰序列,片段合成后构建慢病毒RNAi表达载体,随后利用293FT细胞将其包装成成熟慢病毒颗粒去感染SW480细胞,经Biasticidin抗性选择培养后,建立了稳定表达HDGF siRNA的SW480细胞株.实时荧光定量PCR和Western Blot检测HDGF基因在mRNA和蛋白水平表达变化;生长曲线和MTT法观察细胞增值情况的改变.结果 HDGF基因在大肠癌SW480细胞中表达较高.成功的构建了HDGF慢病毒KNAi表达载体,并建立了稳定表达靶向干扰HDGF基因表达的siRNA SW480细胞株.沉默HDGF基因在表达后,能明显体外抑制细胞的增殖.结论 针对HDGF基因的慢病毒RNAi载体能明显下调HDGF基因的表达,并在体外显著抑制大肠癌细胞增殖能力.     

靶向CCR7基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计并构建靶向CCR7基因shRNA真核表达质粒,并检测其干扰效果。方法以CCR7为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pGC-silencer-CRM30载体,构建的3条重组短发夹shRNA表达载体分别命名为pGC-silencer-CRM30-CCR7A、-CCR7B和-CCR7C。采用测序法鉴定寡核苷酸序列。将构建好的真核表达载体转染人结肠癌SW480细胞,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR法检测CCR7干扰效率。结果重组质粒测序结果与Genebank中的CCR7 cDNA序列相符,转染SW480细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白,RT-PCR结果表明,pGC-silencer-CRM30-CCR7C干扰效果最强。结论靶向CCR7基因shRNA表达载体构建无误,为进一步探讨趋化因子受体CCR7在胃肠道恶性肿瘤生物学行为中的作用奠定了基础。     

Smad4真核表达质粒的构建及转染结肠癌细胞系SW480

目的 构建Smad4真核表达质粒并筛选稳定表达野生型Smad4基因的SW480结肠癌细胞系。方法 提取正常人体胎盘组织总RNA,PCR扩增人野生型 Smad4基因,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1(+)真核表达载体上,构建pcDNA3.1(+)-Smad4重组质粒,通过PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定,脂质体介导方法转染结肠癌细胞系SW480,G418筛选稳定表达株,RT-PCR方法检测其mRNA表达水平。结果 Smad4基因的PCR电泳结果显示在1 700bp左右有一明显亮带,连接载体后经鉴定证实为人Smad4-cDNA;稳定转染Smad4基因的SW480细胞RT-PCR结果提示Smad4的mRNA表达水平比对照细胞组明显升高。结论 成功扩增野生型Smad4基因,构建Smad4真核表达质粒,并筛选出Smad4基因稳定表达的SW480结肠癌细胞系。     

HIF-1α基因表达下调对人结肠癌SW480细胞增殖和VEGF表达的影响

目的:研究转录因子-缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在缺氧条件下对人结肠癌SW480细胞增殖的作用,以及HIF-1α对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,研究HIF-1α调节SW480细胞增殖的机制.方法: 构建针对HIF-1α的pSuper-EGFP siRNA表达载体,转染SW480细胞,抑制HIF-1α的表达,RT-PCR和Western Blot检测抑制结果;MTT法检测HIF-1α被抑制后,SW480在缺氧培养条件下的增殖情况;RT-PCR和Western Blot检测VEGF 的表达.结果: 缺氧培养条件下,HIF-1α和VEGF表达明显上升;转染pSuper-EGFP siRNA表达载体后,SW480细胞HIF-1α mRNA和蛋白质的表达大幅下降;SW480细胞增殖下降(P《0.05);而在缺氧培养条件下有较高表达的VEGF,其mRNA和蛋白质的表达也大幅下降.结论: HIF-1α在缺氧条件下,对SW480细胞在增殖有影响,其机制可能是通过在缺氧时上调节VEGF等细胞生长因子的表达,进而调节肿瘤细胞生长.     

LEF-1截短型基因真核荧光表达载体的构建及其在SW480细胞系中的功能研究

目的 构建LEF-1截短型基因的真核表达荧光质粒,在真核细胞中表达,并检测其对人结肠癌细胞系SW480增殖和凋亡的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆LEF-1截短型的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1中,同时插入红色荧光示踪片段mRFP.用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-LEF-1-mRFP瞬时转染Hela细胞,通过Western blot和流式细胞仪检测LEF-1截短型的表达,同法瞬时转染SW480细胞,观察细胞形态变化,MTT检测对细胞生长的影响,CSFE染色检测细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,PI染色检测细胞周期.结果 克隆LEF-1截短型的编码基因,经测序比对证实与GenBank中给出的序列一致,以含有LEF-1截短型的编码基因的真核表达荧光载体瞬时转染Hela细胞.LEF-1截短型基因的表达产物通过Westemblot和流式细胞仪方法得到证实,转染SW480细胞.光镜下观察发现部分细胞中出现颗粒,失去正常形态,细胞数目明显减少;MTT检测显示细胞活性下降,流式检测显示细胞增殖受到抑制,凋亡水平增加,细胞在G_(0/1)期发生阻滞.结论 成功构建LEF-1截短型的编码基因的真核荧光表达载体,证实其在真核细胞HeM中可以表达.同时可以抑制SW480细胞的活性和增殖,促进其凋亡,细胞被阻滞在G_(0/1)期,

Abstract：

Objective To construct a eukaryotic fluorescent expression vector of truncated lymphoid enhancer-binding factor 1 (LEF-1) gene and investigate its effect on the proliferation and apoptosis of human colonic carcinoma cell line SW480. Methods Truncated LEF-1 gene was obtained by PCR and DNA recombination from human lymphoid node cDNA library. The PCR product of LEF-1 gene was inserted into the plasmid pMD-18T and sequenced. The truncated LEF-1 gene was inserted into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 and fused with mRFP for tracing. Using Lipofectamine~(TM) 2000, the plasmid pcDNA3.1 -LEF-1 -mRFP was transfected into Hela cells and detected by Western blotting and fluorescence activated cell sorting (FACS). The changes in the growth, proliferation and apoptosis of the SW480 cells were observed after transfection with the plasmids. Results The truncated LEF-1 gene was successfully cloned. After transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, the Hela cells expressed the product of LEF-1 as detected by Western blotting and FACS. The growth and proliferation of SW480 cells was inhibited and the cell apoptosis increased after transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, which also caused cell cycle arrest in G_(0/1) phase. Conclusion The eukaryotic expression fluorescent vector pcDNA3.1-LEF-1-mRFP has been constructed and expressed in eukaryotic cell line successfully. The truncated LEF-1 protein expressed in the transfected SW480 cells results in inhibition of the cell growth and proliferation with increased cell apoptosis and cell cycle arrest in G_(0/1) phase.     

A novel serine protease SNC19 associated with human colorectal cancer

Objective To study the structure and function of a novel serine protease gene associated w ith human colorectal cancer SNC19.Methods The cDNA sequence was determined by both manual and automatic sequencing techniq ues. The full length cDNA sequence was obtained by the 5’-Rapid Amplification of cDNA Ends technique and web-based analysis. Open reading frame analysis and protein function prediction were also performed. Northern blot was used to det ect the expression of SNC19 in various human normal tissues and tumor cell lines . Fluorescent in situ hybridization combined with fluorescent R-banding techni que was employed to map the SNC19 gene on human chromosome.Results Full length SNC19 cDNA, size 3152 bp, encodes a protein highly homologous to a m ouse serine protease epithin. In normal human tissues, high SNC19 expression le vels were observed in the kidney, pancreas, prostate, small intestine and colon; moderate SNC19 expression levels were observed in the placenta, lung, liver, sp leen thymus, testis and peripheral blood lymphocytes; and extremely low expressi on levels were observed in the heart, brain, skeletal muscle and ovary. In tumo r cell lines, colorectal cancer cells SW480, SW620, SW1116 and Colo205, breast c ancer cell Bcap37 and gastric cancer cells MKN28 and SGC7901 showed high levels of SNC19 expression; cervical cancer cell HeLa-S3, lung cancer PAA, oral epithe lial cancer cell KB and lymphoma cell Raji showed moderate levels of SNC19 expre ssion; and tongue squamous cancer cell Tca8113, leukemia cells HL-60, K562, MOL T-4, lung cancer cell A549 and melanoma cell G361 showed very low levels of SNC 19 expression. SNC19 was mapped to human chromosome 11q24-25. Conclusion SNC19 encodes a novel human serine protease with 855 amino acid residues. As a novel serine protease associated with human colorectal cancer, the expression of SNC19 in various tissues and cell lines may have very important impact on their phenotypes and biological behaviors.     

miR-26a靶向HMGA1基因对结肠癌细胞生长、侵袭和迁移的影响

目的：探讨miR-26a靶向高迁移率族蛋白1（HMGA1）基因对结肠癌细胞生长、侵袭和迁移的影响,阐明HMGA1基因是否为miR-26a的靶基因。方法：将miR-NC （对照）、miR-26a mimics （模拟物）和miR-26a inhibitor （抑制物）转染人结肠癌SW480细胞作为miR-NC组、miR-26a mimics组和miR-26a inhibitor组。RT-PCR和Western blotting法分别检测各组SW480细胞中HMGA1 mRNA和蛋白表达水平。采用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组SW480细胞中双荧光素酶活性,以此确定HMGA1是否为miR-26a的靶基因。采用CCK8实验检测各组细胞增殖活力,Transwell小室法检测各组细胞侵袭数和迁移数。结果：HMGA1基因是miR-26a的靶基因。与miR-NC组比较,转染24、48和72 h时miR-26a mimics组SW480细胞增殖活力明显降低（P<0.01）,而miR-26a inhibitor组细胞增殖活力明显升高（P<0.01）。与miR-NC组比较,各时间点miR-26a mimics组和miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖活力、细胞侵袭数和细胞迁移数均降低（P<0.01）,而miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖活力、细胞侵袭数和细胞迁移数均升高（P<0.01）;与miR-26a mimics组比较,各时间点miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖活力、细胞侵袭数和细胞迁移数均升高（P<0.01）;与miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组比较,各时间点miR-26a+pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖活力、细胞侵袭数和细胞迁移数均降低（P<0.01）。结论：HMGA1是miR-26a的靶基因。上调miR-26a表达可抑制人结肠癌SW480细胞增殖,下调miR-26a表达可促进人结肠癌SW480细胞增殖。     

苦参碱抑制人大肠癌 SW480细胞环氧化酶-2表达的研究

目的:探讨苦参碱（MT）对人大肠癌 SW480细胞环氧化酶(COX-2)表达的影响。方法:采用MTT法检测MT对SW620细胞的增殖抑制作用,采用实时荧光定量RT-PCR和Western blotting等方法检测不同浓度(0. 25～2.0 mg/mL)苦参碱对细胞 COX-2表达的影响。结果: MT抑制SW480细胞增殖呈剂量和时间依赖性, 其48hIC50=0.516mg/mL。倒置显微镜下以及细胞爬片HE染色可见实验组细胞出现典型的细胞凋亡形态改变: 细胞皱缩, 体积减小,胞浆凝聚,空泡化明显,形成 "印戒"细胞。苦参碱可抑制 SW480细胞的COX-2 mRNA、蛋白表达水平。结论: MT在体外能抑制 SW480细胞的增殖, 其抑制作用具有明显的量效和时效关系。苦参碱具有抑制 SW480细胞的 COX-2 基因转录、蛋白表达和功能活性等作用,在时间范围(8～72 h)内,表现出时效关系。     

可视化观察Tiam-1基因沉默对人大肠癌细胞株SW480转移的影响

目的 应用整体可视化成像技术观察Tiam-1基因沉默对人大肠癌细胞株SW480转移特性的影响.方法 将绿色增强荧光蛋白(EGFP)标记的人大肠癌细胞株SW480/EGFP 与SW480/EGFP /Tiam-1-经裸鼠尾静脉注射和结肠原位接种,分别建立可视化转移动物模型,比较两种细胞株成瘤与转移特性的差别.结果 SW480/EGFP 与SW480/EGFP /Tiam-1-细胞均稳定表达EGFP;SW480/EGFP /Tiam-1-的Tiaml基因干扰率达70%;SW480/EGFP /Tiam-1和SW480/EGFP 比较体外增殖能力无显著差异(P＞0.05),但体内增殖能力差异显著(P＜0.05);SW480/EGFP /Tiam-1转移率明显降低.结论 Tiaml基因可能在人大肠癌侵袭转移中发挥重要作用.     

苦参碱对K-ras基因突变型结肠癌细胞株增殖的抑制作用及机制研究

【目的】观察苦参碱对K-ras基因突变型结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用及机制。【方法】以不同浓度苦参碱干预K-ras基因突变型人结肠癌SW480细胞,采用新型四唑氮盐(MTS)做比色分析测定细胞增殖,流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡,细胞划痕法观察细胞侵袭转移能力的变化,Western blotting方法检测细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路下游关键激酶MEK1/2蛋白的表达。【结果】与空白对照组比较,0.125~1 mg/m L浓度的苦参碱能显著抑制SW480细胞增殖,促进细胞凋亡,有效抑制结肠癌细胞的移行,降低MEK1/2蛋白的表达(P0.05),其作用强度随药物浓度增加有升高的趋势。【结论】苦参碱可能通过下调MAPK信号通路下游MEK1/2蛋白的表达,有效抑制SW480细胞的增殖和移行,并促进其凋亡。     

靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK构建的初步研究

目的 构建由癌胚抗原启动子(CEA promoter,Cp)驱动的靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK,并观察其在CEA阳性大肠癌细胞中专一性表达和对增殖的影响.方法 采用PCR分别扩增出Cp、CD、TK三种目的 基因并采用双酶切、连接依次将Cp、CD、TK基因插入pcDNA3.1(-)质粒;将靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK分别转染CEA阳性的人大肠癌SW480细胞和CEA阴性的Hela细胞,采用RT-PCR检测CD-TK基因的表达.用MTT法检测转染pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK后的SW480细胞对化疗前药5-氟胞嘧啶(5-Fc)和丙氧鸟苷(GCV)的敏感性.结果 Cp基因片段、CD基因片段和TK基因均克隆正确.靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK经凝胶电泳和DNA测序证实构建正确.转染了靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480细胞经过RT-PCR鉴定证实有CD-TK基因的表达,CEA阴性Hela细胞则没有CD-TK基因的表达.细胞培养试验中,转染了靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480细胞对前药5-Fc和GCV敏感.结论 正确构建了靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK,靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK能够使CD-TK基因在CEA阳性细胞中专一性表达,达到靶向杀伤大肠癌细胞目的 .     

靶向抑制存活素基因对大肠癌细胞SW80侵袭和转移的实验研究

目的 构建靶向存活素(survivin)基因的短发夹干扰RNA(shRNA)表达载体,导入人大肠癌细胞SW480中,研究靶向抑制survivin基因对SW480细胞侵袭和转移的影响.方法 根据siRNA设计原则,在survivin序列中选取设计含19个核苷酸(19 nt)的靶序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制survivin基因的sihNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo-survivin;采用Lipofectamine 2000TM转染试剂将干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-survivin导入到大肠癌细胞SW480中;用Western blotting从蛋白水平检测干扰效果;分别采用肿瘤侵袭粘附实验和明胶酶谱分析法检测pRNAT-U6.1/Neo-survivin对SW480细胞的侵袭和转移潜能的影响.结果 Survivin基因的蛋白表达均得到显著抑制;沉默SW480的survivin基因可以显著抑制SW480细胞的侵袭和转移潜能,而且survivin基因表达被抑制后,SW480细胞分泌基质金属蛋白酶明显减少.结论 Survivin基因可能在SW480的侵袭和转移潜能中起重要作用,沉默SW480的survivin基因可以显著抑制其侵袭、转移和基质金属蛋白酶分泌,因而survivin影响SW480的侵袭和转移可能与调控基质金属蛋白酶分泌密切相关.     

手术切除的结直肠癌组织中的肿瘤干细胞的培养及鉴定

目的获得结直肠癌患者手术切除癌组织的肿瘤干细胞（CSC）,培养并鉴定其干细胞特性。方法通过原代培养手术切除 结直肠癌组织获得结直肠癌细胞,再通过有限稀释法和无血清培养法筛选结直肠癌CSC,软琼脂集落实验检测CSC和对照组人 结直肠癌细胞株SW480 的增殖能力;用低数量级细胞裸鼠皮下成瘤实验,检测结直肠癌CSC和SW480 的成瘤能力;并运用 Western blot及免疫荧光方法,检测CSC和SW480的免疫表型。结果临床结直肠癌标本原代培养的CSC,加入血清培养可使 CSC分化。软琼脂集落形成实验结果显示,原代培养的CSC克隆形成率为56.64%和54.45%,对照组人结直肠癌细胞株SW480 的克隆形成率为4.41%,CSC与SW480集落形成率的差异具有统计学意义（P<0.01）。裸鼠皮下成瘤实验中,原代培养的CSC 皮下注射500 个细胞可形成皮下瘤,而SW480 皮下注射500 个细胞不形成皮下瘤。CSC 表达CD133、CD44,不表达CK7; SW480细胞不表达CD133、CD44,表达CK7。结论原代培养的手术切除结直肠癌组织标本获得的肿瘤细胞,再行无血清培养 可形成CSC,鉴定具有CSC的自我更新及分化能力。