十字花科黑腐病菌编码RNA聚合酶ω亚基的基因（rpoZXcc）突变导致细胞生长减慢

ω（Omega）亚基是组成细菌RNA聚合酶（RNA polymerase,RNAP）核心酶的5个亚基（2α、β、β′andω）中最小的一个,也是5个亚基中唯一可以去除而不会导致细胞死亡的亚基。尽管ω亚基存在于所有细菌中并且序列非常保守,但迄今为止,人们对ω亚基的功能却知之甚少。基因组注释结果表明,十字花科黑腐病菌8004菌株（Xanthomonas campestris pv.campestris strain 8004,简称Xcc8004）基因组中存在一个编码ω亚基的基因rpoZXcc（ORF编号为XC0957）。为了研究Xcc RNA聚合酶ω亚基的功能,采用自杀质粒pK18mob整合突变方法,构建了rpoZXcc基因的非极性突变体NK0957。表型检测结果显示,NK0957在基本培养基MMX和丰富培养基NYG中的生长比野生型菌株Xcc8004的生长明显减慢,而且NK0957的生长缓慢表型能被rpoZXcc反式互补。这些结果说明,ω亚基在Xcc的生长过程中发挥重要作用。     

利用双向电泳构建十字花科黑腐病菌HrcV控制的分泌蛋白质图谱

以十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)8004菌株为研究材料,采用双向电泳-质谱技术鉴定Hrc V控制的分泌蛋白质组。结果表明,野生型和突变体菌株均获得分辨率高且具有可重复性的双向电泳银染图谱,经过图像软件分析找出差异点61个,以野生型菌株为对照,22个蛋白点上调,39个蛋白点下调。挖取下调蛋白质点39个做质谱分析,质谱成功鉴定出25蛋白质,主要包括各种酶类、转运蛋白、延伸因子、Dna K蛋白、分子伴侣及假定蛋白。推测这些蛋白质可能在Xcc 8004的致病性中起到重要作用,为进一步研究Xcc的致病机理奠定基础。     

柑橘溃疡病菌胞外蛋白水解酶对其致病力的作用

采用异源表达方法从柑橘黄单胞柑橘亚种(Xcc)中国菌株Xcc 29-1中鉴定出6个编码胞外蛋白水解酶的基因.运用同源重组方法将6个编码基因全部敲除,得到胞外蛋白水解酶缺失突变体,对其致病力、形成生物膜的能力和生长繁殖速度进行检测.结果显示,蛋白水解酶突变体在柑橘上的致病力减弱,并且附着到试管壁的细菌数量显著减少,形成生物膜的能力下降.在野生型菌株中过表达蛋白水解酶后,形成的溃疡病斑水渍状程度加大,在柑橘中的繁殖速度变快;在柑橘叶片中,6个胞外蛋白水解酶基因的转录水平都增强表达.这些结果表明Xcc的胞外蛋白水解酶是一个重要的致病因子.     

十字花科黑腐病菌hrpW基因导入油菜之研究初报

为了研究十字花科植物黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称Xcc)hrpW基因的功能及Xcc的致病机理,实验以甘蓝型油菜为试验材料,以5～6d无菌苗的带柄子叶为外植体,建立了高效稳定的带柄子叶再生体系,同时探索了影响根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜子叶柄的各种因素;并用农杆菌介导法将hrpW基因导入甘蓝型油菜中,经PCR检测法分析,证明hrpW基因已整合到油菜基因组中。hrpW基因编码HarpinXcc(十字花科植物黑腐病菌Harpin蛋白),该转基因植株的获得,为进一步研究十字花科植物黑腐病菌的致病机理提供了材料,也为选育高效抗病油菜种质奠定了基础。     

野油菜黄单胞菌的XopR基因功能

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种能够引起十字花科植物产生黑腐病的重要病原菌。笔者以野油菜黄单胞菌Xcc8004菌株XopR基因为研究对象,通过qRTPCR发现,XopR基因的表达受Ⅲ型调控基因hrpG和hrpX的调控,并且XopR蛋白的分泌依赖于Ⅲ型分泌系统结构基因hrcV,这表明XopR是Xcc8004的一个Ⅲ型分泌效应蛋白。利用同源重组的方法,笔者获得了XopR基因的缺失突变体ΔXopR。将野生型Xcc8004和ΔXopR突变体分别接种甘蓝品种中甘15、中甘21和大白菜品种中白83,发现ΔXopR突变体菌株致病性下降,表明XopR对于Xcc8004在甘蓝上的完整毒性是必须的。GFP融合蛋白分析发现XopR定位于拟南芥原生质体的细胞膜上,可以在拟南芥原生质体中抑制细菌鞭毛蛋白诱导的FRK1基因表达。     

儿茶素对野油菜黄单胞菌的抑菌作用

【目的】研究儿茶素对野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris,Xcc)的抑制作用,开发儿茶素在农业领域的应用价值,为十字花科黑腐病的防治提供天然杀菌剂模型与理论依据。【方法】通过K-B滤纸片法初步确定儿茶素对Xcc的抑制作用,利用液体稀释法测定儿茶素对Xcc的最低抑菌质量浓度(MIC)以及最低杀菌质量浓度(MBC);在儿茶素的亚抑菌质量浓度下,通过结晶紫染色法检测Xcc生物膜的形成,用生物化学方法在相应的固体培养基上分析Xcc胞外酶的分泌情况,在swarming培养基上检测Xcc的运动能力;通过生物活体试验检测儿茶素对萝卜黑腐病的防治效果。【结果】儿茶素对Xcc的MIC值为20μg/mL,MBC值为100μg/mL。在亚抑菌质量浓度为15μg/mL的条件下,儿茶素作用的Xcc所产生物被膜的量仅为阴性对照组的16%,说明此条件下儿茶素能够极显著抑制Xcc生物被膜的形成(P0.001);能极显著抑制Xcc胞外蛋白酶的分泌(P0.001),儿茶素作用时Xcc所分泌的蛋白酶产量仅为对照组的18%;对胞外淀粉酶及纤维素酶的分泌没有影响(P0.05);对Xcc的运动能力有极显著抑制作用(P0.001),儿茶素作用后导致Xcc运动性减弱,为对照组的73%。在使用儿茶素的情况下,白萝卜切片发生病害的程度较低。【结论】儿茶素对黑腐病菌的生长有抑制作用,影响该菌部分毒力因子,具有良好的活体防治效果,有望为人工合成新型的黑腐病防治药剂提供参考。     

抗柑桔细菌溃疡病的柑桔叶组织内一些酶活性的研究

本试验测定了对柑桔溃疡病草胞菌（Xanthomonas campestris pv.citri,Xcc)敏感性不同的柑桔品种叶组织内过氧化氢酶（CAT）、过氧化酶（PPO）葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PDH）、6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶96PGDH）、异柠酸脱氢酶（ICDH）的活性及总酚含量。结果表明，抗病品种CAT、POD、PPO、G5PDH、6PGDH活性及总酚含量均高于敏感品种；而ICDH活性则低于敏感品种。这显示了柑桔叶组织中氧化酶（CAT、POD、PPO），戊糖磷酸途径酶（G7PDH、7PGDH）、三羧酸循环酶（ICDH）的活性及总酚含量与柑桔抗Xcc感染能力密切相关。     

野油菜黄单胞菌的HpaA基因功能

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.Campestris,Xcc)是使十字花科植物产生黑腐病的重要病原细菌。Xcc通过Ⅲ型分泌系统分泌效应蛋白到植物体内帮助Xcc的侵染和繁殖。Hpa A蛋白是一个广泛存在于黄单胞菌中的效应蛋白,在辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria,Xcv)中,Hpa AXcv85-10已经被证明是一个Ⅲ型效应蛋白,并且参与其他效应蛋白的分泌过程,但是在Xcc中,对Hpa A的功能还不是了解得很清楚。本研究以Xcc8004菌株的Hpa A蛋白为研究对象,通过分泌蛋白检测和亚细胞定位分别研究Hpa AXcc8004是否也由Ⅲ型分泌系统分泌以及Hpa AXcc8004在植物细胞的作用部位。结果表明,Hpa AXcc8004的分泌依赖于Xcc8004的Ⅲ型结构基因hrc V,暗示着Hpa AXcc8004也是作为Ⅲ型分泌效应蛋白来发挥功能。在拟南芥原生质体细胞中,将Hpa AXcc8004与GFP蛋白融合表达,发现Hpa AXcc8004定位于植物细胞核中。进一步通过同源重组的方法获得了Xcc8004 Hpa A基因缺失突变体,在寄主甘蓝、萝卜、拟南芥上分别接种野生型Xcc8004和Hpa A基因缺失突变体,发现基因缺失突变体毒性显著降低,表明Hpa AXcc8004在上述寄主植物上对于Xcc8004的完整毒性是必须的。在Hpa A的拟南芥转基因植株上,Hpa AXcc8004还可以减弱假单胞菌DC3000和Xcc8004发黄的表型。     

十字花科黑腐病菌编码RNA聚合酶ω亚基的基因(rpoZ_(Xcc))突变导致细胞生长减慢

ω(Omega)亚基是组成细菌RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)核心酶的5个亚基(2α、β、β′andω)中最小的一个,也是5个亚基中唯一可以去除而不会导致细胞死亡的亚基。尽管ω亚基存在于所有细菌中并且序列非常保守,但迄今为止,人们对ω亚基的功能却知之甚少。基因组注释结果表明,十字花科黑腐病菌8004菌株(Xanthomonas campestris pv.campestris strain 8004,简称Xcc8004)基因组中存在一个编码ω亚基的基因rpoZXcc(ORF编号为XC0957)。为了研究Xcc RNA聚合酶ω亚基的功能,采用自杀质粒pK18mob整合突变方法,构建了rpoZXcc基因的非极性突变体NK0957。表型检测结果显示,NK0957在基本培养基MMX和丰富培养基NYG中的生长比野生型菌株Xcc8004的生长明显减慢,而且NK0957的生长缓慢表型能被rpoZXcc反式互补。这些结果说明,ω亚基在Xcc的生长过程中发挥重要作用。     

CrxV对水稻白叶枯病菌致病力的调控

为分析GGDEF和EAL结构域的蛋白CrxV对水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）致病性及相关致病因子的影响,通过同源重组法构建了crxV的突变体及其互补菌株;采用剪叶法比较了突变体、野生型和互补菌株对水稻叶片的侵染能力;分析了这3个菌株产生相关致病因子（运动性、胞外多糖、生物被膜和胞外酶）的能力。结果显示,crxV突变体的致病力比野生型和互补菌株的低。crxV突变导致病原菌生物被膜含量显著升高,但对运动性、胞外多糖和胞外酶均无明显影响。结果表明,CrxV可能通过负调控生物被膜影响Xoo的致病性。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.     

植物病原黄单胞菌DSF信号依赖的群体感应机制及调控网络

群体感应是微生物之间相互交流的一种重要联络方式,它协助细菌能感应群体密度从而调节基因表达。20世纪80年代以来,多种群体感应信号及其传导机制得以阐明。DSF（diffusible signal factor）是近年来在野油菜黄单胞菌中首先鉴定的1个新型群体感应信号,化学结构为顺式11?甲基?2?十二碳烯酸,其信号传导途径包括RpfC/RpfG双组分感应系统、二级信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）、全局性转录因子Clp等。在野油菜黄单胞菌中,DSF群体感应信号调控3类生物学功能：一是促进致病相关基因的表达;二是抑制生物膜形成;三是促进黄单胞菌作出代谢调整,适应高群体密度环境。RpfF是DSF信号生物合成过程中的关键酶,黄单胞菌在高群体密度条件下通过一种新型自我诱导机制大量合成DSF。DSF信号不仅存在于所有黄单胞菌属细菌中,也广泛存在于苛养木杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、伯克氏菌、铜绿假单胞菌和许多海洋细菌中,其传导途径和生物学功能还有待进一步阐明。     

干热处理对蔬菜种子质量的影响及其杀菌效果研究

有效控制蔬菜种传病害是蔬菜生产中一个广泛关注的问题.以瓜类作物种子(北京202黄瓜、抗病新先锋西瓜、蜜农六号甜瓜)和白菜种子(京春白、京春黄、新奶白、乌塌菜)为材料,研究了干热处理方法对去除十字花科蔬菜种子黑腐病菌的效果,以及对种子质量的影响.结果表明,适宜的干热处理方法能极大地减少白菜种子上黑腐病菌的带菌量,白菜京春...     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

MutL调控水稻黄单胞菌的致病力

为了了解水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)中 的MutL/MutS系统是否参与DNA修复以及是否调控病原菌的致病力,构建了mutL突变体,比较了野生型与mutL突变体的突变率差异,野生型、mutL突变体及其互补菌株侵染水稻的能力。结果显示,mutL突变导致Xoo在H₂O₂胁迫下的突变率显著升高,mutL突变导致Xoo致病力下降,表明DNA错配修复蛋白MutL参与Xoo的DNA修复并正调控Xoo致病力。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

水稻白叶枯病菌的胞外酶与毒力关系的初步研究

研究了水稻白叶枯病菌60个菌株所产生的胞外蛋白酶、纤维素酶(Cx)和果胶酶的活力及其产生胞外粘多糖的能力。从总体看,蛋白酶活力与菌株毒力成正相关,而纤维素酶活力与菌株毒力相关不显著。但来自华南地区的一些菌株的毒力与纤维素酶活力显著相关,而与蛋白酶没有显著的相关性。蛋白酶和纤维素酶的产生都受培养基中氮源成分的影响。尚未发现果胶酶活力及粘多糖产生能力与毒力有任何关系。     

硫苷介导的白菜抵御甜菜夜蛾幼虫取食胁迫的分子机制

【目的】探究甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫取食对白菜Brassica campestris ssp. chinensis硫代葡萄糖苷质量摩尔浓度及组分的影响,初步明确硫苷介导的白菜抵御甜菜夜蛾幼虫取食胁迫的分子机制。【方法】使用高效液相色谱法检测甜菜夜蛾幼虫取食对白菜硫苷质量摩尔浓度和组分的影响,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析硫苷代谢关键基因表达模式的变化,谷胱甘肽硫转移酶试剂盒检测取食白菜后甜菜夜蛾幼虫体内谷胱甘肽硫转移酶活性的变化。【结果】白菜中8种硫苷组分在甜菜夜蛾幼虫取食后显著增加(P<0.05),其中吲哚族的4-羟基吲哚-3-甲基硫苷(4OH)、1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷(NEO)、3-吲哚基甲基(GBC)和脂肪族的4-戊烯基硫苷(GBN)对甜菜夜蛾幼虫取食反应最为强烈;RT-qPCR结果显示：甜菜夜蛾幼虫取食后,白菜脂肪族硫苷合成相关基因BcBCAT4、BcMAM1的显著上调可能与脂肪族硫苷的增加有关(P<0.05),而BcSOT16的上调与4OH、NEO、GBC呈正相关;取食后,甜菜夜蛾幼虫体内谷胱甘肽硫转移酶活性显著增强...