地衣芽孢杆菌16S rRNA基因的TD-PCR扩增及系统发育分析

运用16SrRNA基因序列分析了中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保存的30株地衣芽孢杆菌的系统发育关系,结果显示:24株菌株位于地衣芽孢杆菌系统发育分支;3株菌株位于蜡状芽孢杆菌-苏云金芽孢杆菌系统发育分支;1株菌株位于枯草芽孢杆菌系统发育分支;2株菌株与其它地衣芽孢杆菌菌株间序列同源性为96.4%~97.4%,明显低于其它地衣芽孢杆菌菌株间同源性,分类地位不明确,有待进一步讨论。通过比较分析16SrRNA基因5′端500bp、3′端500bp以及其全基因的系统发育树,表明16SrRNA基因5′端500bp可以很好的代表全基因序列进行系统发育研究,可用于区分地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及蜡状芽孢杆菌分支。     

芽孢杆菌TS02特异RAPD标记的SCAR标记转化和验证

利用自主分离的蜡状芽孢杆菌菌株TS02,采用RAPD 方法对TS02及其同源性相近的5株芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)进行了RAPD条带特异性分析,从TS02基因组中筛选获得了一个533 bp的特异RAPD标记TSR1.TSR1克隆、测序后,根据其序列设计出一对特异引物P1/P2进行扩增,结果只在TS02中扩增得到目的片段,而其余对照菌株扩增为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异SCAR标记.     

蜡状芽胞杆菌群菌株中部分病原相关因子的检测

对26株蜡状芽胞杆菌群菌株进行了肠毒素基因及其它病原相关因子的检测。PCR结果表明,17株蜡状芽胞杆菌群菌株中含有病原调控因子plcR的同源序列。采用3组溶血肠毒素hbl基因和3组非溶血肠毒素nhe基因特异性引物,分别可从73%的菌株中至少扩增出一个与预期DNA片段大小一致的片段,其中,苏云金芽胞杆菌菌株中溶血素hbl基因和非溶血素nhe基因的阳性检出率为83%。蜡状芽胞杆菌DBt248完全没有溶血活性,而且在溶血素hbl和非溶血素nhe基因的3个亚基以及病原调控因子plcR的PCR检测中均为阴性,有望作为宿主菌用于苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的表达和应用。     

芽孢杆菌TS02特异RAPD标记的SCAR标记转化和验证

利用自主分离的蜡状芽孢杆菌菌株TS02, 采用RAPD方法对TS02及其同源性相近的5株芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌) 进行了RAPD条带特异性分析, 从TS02基因组中筛选获得了一个533 bp的特异RAPD标记TSR1。TSR1克隆、测序后, 根据其序列设计出一对特异引物P1/P2进行扩增, 结果只在TS02中扩增得到目的片段, 而其余对照菌株扩增为阴性, 从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异SCAR标记。     

一株来自蚯蚓的产纤溶酶蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus的筛选及鉴定

对来自4个不同省份的5条蚯蚓的肠道及体表细菌进行分离,共获得122株细菌。通过脱脂奶粉平板法初筛,纤维蛋白平板法复筛,以透明圈为筛选标记,共筛选出产纤溶酶菌株12株,其中菌株SC-3-W-3的纤溶酶活力较高,达到了538.64 U/mL(相当于尿激酶的活力单位)。通过对其形态、培养、生理生化特征进行研究,发现其与蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus Frankland的特征很相符。进一步对SC-3-W-3的16S rDNA序列及系统发育分析表明,该菌株与蜡状芽孢杆菌的同源性高达100%。综合生理生化及16S rDNA序列比对结果,将SC-3-W-3菌株鉴定为蜡状芽孢杆菌。     

副地衣芽孢杆菌FA6全基因组测序及比较基因组学分析

副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)FA6是一株从草鱼肠道内分离出来的细菌, 其具有淀粉酶和纤维素酶等多种碳水化合物酶活性。为深入研究副地衣芽孢杆菌FA6可能的益生机制, 研究通过三代测序技术测定了副地衣芽孢杆菌FA6的全基因组序列, 运用生物信息学方法进行基因组组装、基因预测和功能注释。同时通过比较基因组学方法, 比较分析了副地衣芽孢杆菌FA6与4株基因组序列已经发表的芽孢杆菌基因组结构和功能的差异。结果发现副地衣芽孢杆菌FA6全基因组由1条环状染色体组成, 大小为4450579 bp, GC含量为45.9%。副地衣芽孢杆菌FA6基因组中含有128个蛋白酶基因, 32个脂肪酶基因和72个糖苷水解酶基因, 这些基因与食物降解相关; 此外, 细菌基因组中还含有7个编码羊毛硫抗生素相关的基因。比较基因组结果显示, 副地衣芽孢杆菌FA6与其他4株芽孢杆菌的基因组共线性关系较好, 但是与地衣芽孢杆菌菌株相比, 菌株FA6基因组特征更接近于副地衣芽孢杆菌菌株。副地衣芽孢杆菌FA6基因组中编码纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶的基因数量分别为5、7和5个, 多于其他菌株, 能够更好地降解植物多糖。研究结果表明副地衣芽孢杆菌FA6高度适应植物性成分, 反映了该菌株在草鱼肠道中的适应性进化, 该菌株可能可以作为益生菌用于水产养殖。     

降解烟碱的YC-68菌株16SrDNA序列分析及鉴定

从烟叶调制过程中温度达68℃阶段的叶片上分离得到一株能降解烟碱的菌株,编号为YC-68,该菌经常规的形态、生理生化分析,确定为芽孢杆菌。根据该菌16 S rDNA恒定区的保守性设计了一对通用引物,扩增其16 S rDNA序列,将扩增的产物进行回收后进行测序,把测序后的结果提交到GenBank利用BLAST进行序列同源性分析。经过分析鉴定YC-68菌株为芽孢杆菌属的蜡状芽孢杆菌。     

海水养殖系统中37株枯草芽孢杆菌生理代谢、遗传特性及抑菌效果差异分析

【背景】由水产致病菌导致的病害不断暴发,寻找安全有效的抗生素替代品是目前生产的迫切需求。人们通常过于关注益生菌效应,而对其安全性评价重视度不够。【目的】分析我国海水养殖系统中不同来源枯草芽孢杆菌菌株的表型及遗传特征,并寻找绿色安全且具有多重抑菌作用的菌株。【方法】以2009-2021年从我国海水养殖系统中分离的37株枯草芽孢杆菌为对象,利用纸片扩散法(K-B法)检测其对不同抗生素的抗性;利用培养基平板法测定淀粉酶、蛋白酶和溶血能力;通过PCR方法检测枯草芽孢杆菌溶血相关基因携带风险;采用牛津杯法测定其对副溶血弧菌、溶藻弧菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、美人鱼发光杆菌和假交替单胞菌等6种病原菌的抑菌作用;并对候选益生性枯草芽孢杆菌的安全性进行评估。【结果】药敏检测结果显示,37株枯草芽孢杆菌对甲氧苄啶、吡哌酸、链霉素表现出强耐药性,对磺胺嘧啶表现出中等耐药,对头孢噻肟、环丙沙星、舒巴坦的耐药率低,对克拉霉素、诺氟沙星、氟苯尼考、氟甲喹、复方新诺明、四环素表现为完全敏感。蛋白酶、淀粉酶活性测试结果显示,37株枯草芽孢杆菌能不同程度地水解酪蛋白和淀粉。溶血性测试结果显示,37株枯草芽孢杆菌中有4株出现溶血现象,而8个溶血相关基因在37株枯草芽孢杆菌中均有检出,溶血表型与检测基因关联分析表明,产生溶血现象的菌株与其溶血基因携带间无直接相关性。抑菌试验分析表明,37株枯草芽孢杆菌均对2种及以上病原菌有抑制作用,对6种病原菌均具有良好抑菌作用的有2株(菌株Bs4和Bs7)。对凡纳滨对虾的安全试验表明,菌株Bs4对凡纳滨对虾具有高安全性,7 d对虾存活率为100%。【结论】通过对37株枯草芽孢杆菌生理代谢表型、遗传特性及病原拮抗特性进行比较分析,揭示了我国海水养殖系统中枯草芽孢杆菌具有多元化的表型及遗传特征,并筛选出一株生态安全且具有多重抑菌活性的益生性枯草芽孢杆菌,为水产养殖病害防控、开发抑菌类微生态制剂及水产养殖行业健康绿色发展提供了理论基础和技术支撑。     

两株对虾育苗用益生芽孢杆菌的筛选和鉴定

从土壤和虾池中分离到22株具有不同特征的芽孢杆菌,分别将各菌株对数期约5×10^8个细胞添加到500mL预先加有凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）无节Ⅲ期幼体的水体中,各菌株在初始水体中含量均约为106个细胞/mL,根据各菌株对无节Ⅲ期到蚤状Ⅱ期幼体变态成活率的影响,从中初步筛选出10株对幼体变态成活有极显著（p〈0.01）效果的芽孢杆菌。进一步又从初筛到的10个菌株中复筛到2株对幼体变态成活最为明显的芽孢杆菌,菌株zou4和zou8。两菌株与复筛的其他8株芽孢杆菌相比,均显著（p〈0.05）促进幼体变态存活率。根据形态和生理生化特征,菌株zou4和zou8分别初步鉴定为坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）和蜡状芽孢杆菌（B.cereus）。为进一步确定zou4和zou8的分类地位,测定了两菌株的16S rRNA基因序列,分析了相关细菌16S rDNA序列的同源性,构建了系统发育树。结果表明菌株zou4和zou8分别与坚强芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的同源性最高,相似值均为99%以上。系统发育树上zou4和zou8也分别与坚强芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌聚为一类。综合上述结果,芽孢杆菌zou4和zou8菌株分别被鉴定为坚强芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌。     

一株芽孢杆菌的分离和鉴定

从中国农业科学院北京畜牧兽医研究所鸡舍附近土壤中分离到一株芽孢杆菌P-25,并进行了分子鉴定。通过形态鉴定、革兰氏染色、生理生化测定、16SrRNA序列分析和系统发育树构建,确定该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),其16SrRNAGenBank登录号为GU271135。     

曾候乙墓穴木椁微生物的分离与鉴定

从曾侯乙墓中椁室、东椁室、西椁室和北椁室分别取样,经平板划线培养,分离,纯化共获得典型的菌株16株。将16株分别涂片镜检,生理生化分析鉴定,结果证明芽孢杆菌属11株,其中苏云金变种1株,地衣芽孢杆菌1株,巨大芽孢杆菌1株,球形芽孢杆菌5株,蜡状芽孢杆菌2株,多粘芽孢杆菌1株。其余菌株微杆菌属4株,黄色杆菌属黄杆菌1株。     

肌苷生产菌枯草芽孢杆菌ATCC 13952的全基因组测序及序列分析

摘要:【目的】枯草芽孢杆菌ATCC 13952是一株肌苷工业生产菌株。为深入研究ATCC 13952菌株积累肌苷的分子机制以及为进一步分子育种研究提供序列背景信息,有必要解析ATCC 13952菌株的基因组序列信息。【方法】本研究采用高通量测序和Sanger测序相结合对ATCC 13952菌株进行全基因组测序,然后使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、GO/COG 聚类分析、共线性分析等。【结果】枯草芽孢杆菌ATCC 13952整个基因组大小为3876276 bp,GC含量为45.8%,序列已提交至GenBank 数据库,登录号为CP009748。比较基因组及嘌呤代谢相关基因分析结果显示:枯草芽孢杆菌ATCC 13952与其他几株芽孢杆菌具有较好的基因组共线性关系,嘌呤代谢相关基因编码的蛋白与标准菌株比较发生了一些缺失和突变。【结论】本研究首次报道了一株肌苷生产菌枯草芽孢杆菌ATCC 13952的全基因组序列,分析了基因组基本特征,初步探讨了该菌株积累肌苷的分子机制,为后续的进一步分子育种提供了理论基础。     

四株高产磷脂酶C新菌株的鉴定和分类

在前面研究高产磷脂酶C(PLC)菌株筛选及其抗血小板功能的基础上,对新筛选的四株高产PLC的754-1、779、970和1107菌株进行了鉴定和分类。通过形态特征、培养特征、生理生化特征以及16S rRNA序列测定及其同源性分析,证实754-1菌株与Bacillus cereus基本一致,因此将754-1菌株分类属于蜡状芽孢杆菌,命名为蜡状芽孢杆菌深圳株754-1,B．cereus shenzhen 754-1 strain。而779、970和1107三株菌则与Bacillus mycoides基本一致,因而将这三株菌分类属于蕈状芽孢杆菌,分别命名为蕈状芽孢杆菌深圳株779,B．mycoides shenzhen 779 strain,草状芽孢杆菌深圳株970,B．mycoides shenzhen 970 strain,和蕈状芽孢杆菌深圳株1107,B．mycoides shenzhen 1107 strain。这将为进一步利用这些菌株及其PLC打下坚实的基础。     

一株微囊藻毒素降解菌的筛选及鉴定

从蓝藻爆发期间的巢湖底泥中筛选微囊藻毒素降解菌,为水体中藻毒素-LR(MC-LR)污染的生物治理提供有效的菌源。以MC-LR为唯一碳氮源,利用富集驯化培养技术分离筛选MC-LR降解菌,并对其进行形态观察、生理生化实验及16S rRNA序列分析鉴定。从巢湖底泥中分离得到一株藻毒素-LR降解菌株M6,生理生化实验及分子鉴定结果均表明,该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。分离出的MC-LR降解菌为蜡状芽孢杆菌,该菌株对MC-LR有较高的降解能力。     

动物用芽孢杆菌微生态制剂中蜡样芽孢杆菌的分离及安全性

【背景】芽孢杆菌是仅次于乳酸菌常用于微生态制剂中的菌种,然而部分芽孢杆菌微生态制剂规范不严,应用存在安全隐患。【目的】调查我国在售动物用芽孢杆菌微生态制剂中蜡样芽孢杆菌携带情况,揭示蜡样芽孢杆菌应用的潜在风险。【方法】对微生态制剂预处理,选择性筛选分离蜡样芽孢杆菌,通过全基因组测序测绘细菌毒素基因谱与耐药基因谱,细胞计数试剂盒-8法测定菌株对细胞的毒性,利用微量肉汤稀释法确定菌株耐药值。【结果】从50份微生态制剂产品中筛选分离得到23株蜡样芽孢杆菌群细菌,它们对氨苄西林、林可霉素和泰妙菌素3种抗生素均耐药,主要毒力基因nhe、hbl、cytK、ces的检出率分别为100%、30%、39%和4%,分离株均有溶血性且39%菌株产生热稳定毒素,不同菌株对非洲绿猴肾细胞呈现出不同程度的毒性。【结论】微生态制剂来源的蜡样芽孢杆菌毒性与耐药性严重,携带毒素基因与耐药基因广泛,多株菌株呈高细胞毒性且产生热稳定毒素。芽孢杆菌微生态制剂存在安全性问题,应加强对蜡样芽孢杆菌的质量安全监管力度,规范微生态制剂的市场秩序,杜绝安全隐患。     

蜡状芽孢杆菌群中规律成簇间隔短回文重复序列的生物信息学分析

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是最近发现针对噬菌体等外源遗传物质的获得性和可遗传性的新型原核生物防御系统。通过BLAST、多序列比对、RNA二级结构预测等生物信息学方法对已经完成全基因组测序的蜡状芽孢杆菌群24个菌株进行CRISPR的系统分析,结果表明:42%的菌株含有该结构;8个CRISPR座位的正向重复序列可以形成RNA二级结构,提示正向重复序列可能介导外源DNA或RNA与CAS编码蛋白的相互作用;31%的间区序列与噬菌体、质粒、蜡状芽孢杆菌群基因组序列具有同源性,进一步验证间区序列很可能来源于外源可移动遗传因子。由于大部分蜡状芽孢杆菌群菌株含有多个前噬菌体和质粒,通过对蜡状芽孢杆菌群CRISPR的分析,为揭示其对宿主菌与噬菌体,以及宿主菌与质粒间的关系奠定基础。     

林麝源蜡样芽孢杆菌SCBCM001株的分离鉴定及全基因组序列分析

【背景】细菌性疾病是林麝规模化养殖的重要制约因素,蜡样芽孢杆菌曾在林麝化脓灶中检出,但是目前对林麝源蜡样芽孢杆菌的研究报道很少。【目的】对分离自病死林麝肝脏中的一株疑似蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定和全基因组序列分析,为林麝相关疾病的防治奠定基础。【方法】将病原菌纯化培养后,对病原菌进行生化试验、药敏试验和小鼠致病性试验;并通过第3代单分子测序技术进行全基因组测序,根据测序结果进一步评估物种间的亲缘关系,并进行基因功能注释和遗传进化分析。【结果】该病原菌经平均核苷酸相似度分类和系统发育树分析属于蜡样芽孢杆菌群,生化结果符合蜡样芽孢杆菌的一般特征,将分离菌株命名为SCBCM001。该菌株对小鼠的半数致死量为8.3×107 CFU,对大多数β-内酰胺类、四环素和磺胺异噁唑耐药,对氨基糖苷类、头孢氨苄、头孢哌酮和亚胺培南等药物敏感;全基因组测序结果表明该菌株的染色体大小为5292570bp,GC含量为35.37%,多位点序列分型显示该菌株属于ST427序列类型。在菌株SCBCM001基因组内发现hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、clo和cytK等多种毒力因子,同时菌株携带对β-内酰...     

苏云金芽胞杆菌肠毒素基因的PCR检测

采用多重引物PCR进行了 45株苏云金芽胞杆菌、2株蜡状芽胞杆菌和 2株球形芽胞杆菌溶血素BL ,肠毒素T和entS基因的检测 ,结果表明 95 6%苏云金芽胞杆菌含溶血素hblA基因 ,91 1 %含bceT基因 ,93 3%含entS基因。用两种商业化肠毒素检测试剂盒TECRA和RPLA进行所有菌株肠毒素的体外免疫测定 ,大部分苏云金芽胞杆菌和阳性蜡状芽胞杆菌都能产生不同水平的肠毒素活性 ,同hblA基因PCR检测结果基本相符。尽管DBT0 0 7和T2 4 0 0 1含有hblA基因 ,但用TECRA却检测不到肠毒素 ;Dmu39菌株不含肠毒素基因 ,但用TECRA却检测出高的肠毒素活性。苏云金芽胞杆菌BDT2 4 8和球性芽孢杆菌不含肠毒素基因和肠毒素。结果表明昆虫病原菌苏云金芽胞杆菌的安全性有待进一步研究     

小龙虾肠道产木聚糖酶细菌的分离与鉴定

【背景】小龙虾肠道微生物是小龙虾降解纤维素和半纤维素的主要驱动力。【目的】研究肠道内细菌的相对丰度,为揭示肠道微生物在小龙虾纤维素降解过程中的作用提供理论支撑。【方法】采用纯培养法从小龙虾肠道筛选产木聚糖酶细菌,并且对小龙虾肠道细菌进行16S高通量测序。【结果】形态学和16SrRNA基因分子鉴定表明,筛选到的4株产木聚糖酶细菌均属于芽孢杆菌科芽孢杆菌属;结合进一步的生理生化特征鉴定,结果为:菌株Z-3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),菌株Z-4为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),菌株Z-29为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),菌株Z-30为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis);16S rRNA基因高通量测序结果表明:在属水平上,小龙虾肠道细菌主要是Candidatus Bacilloplasma、拟杆菌属、弧菌属、不动杆菌属、Dysgonomonas、Tyzzerella3、气单胞菌属和希瓦氏菌属细菌。【结论】小龙虾肠道内细菌资源丰富,且芽孢杆菌属细菌在木质纤维素降解过程中发挥一定功能。     

一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定、生物学特性及其对水质净化的作用

【背景】随着水产养殖业的发展和养殖集约化程度的提高,养殖水环境日趋恶化,养殖动物病害频发,而水产益生菌因其环境友好、安全而被广泛应用于水产养殖中。【目的】从南美白对虾养殖池底泥分离枯草芽孢杆菌,探究其体外生物学特性及对水质的净化作用,以期扩充微生态制剂的种质资源。【方法】采用稀释涂布平板法分离菌株,通过形态学观察、生理生化特征、微生物鉴定系统表型测定以及16SrRNA基因序列分析对分离菌株鉴定分类;采用单因素控制法研究体外生物学特性;采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定养殖水体中亚硝酸盐(NO₂^--N)含量,纳氏试剂分光光度法测定氨氮(NH₃-N)含量,碱性高锰酸钾法测定化学需氧量(Chemical Oxygen Demand,COD)。【结果】通过表型鉴定和16S rRNA基因序列分析,从南美白对虾养殖池底泥中筛选了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WH1。体外生物特性研究表明,菌株WH1比模式菌具有更强的耐高温、耐人工胃液、耐胆盐、抑制金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌能力,而且对欧洲食品安全局规定的用作饲料添加剂的芽孢杆菌必检的8种抗生素敏感,符合水产益生菌用作饲料添加剂的体外评价标准。此外,水质净化研究表明菌株WH1能显著降低水体中的NO₂^--N、NH₃-N含量及COD值(P<0.05)。【结论】筛选的枯草芽孢杆菌WH1可用作水质调控剂,同时具有用作饲料添加剂的体外生物学特性优势,有效扩充了微生态制剂的种质资源。