副溶血弧菌噬菌体qdvp001重组内溶素诱导表达以及理化性质初步研究

对重组内溶素Lysqdvp001诱导表达条件进行探讨,发现适当降低诱导温度,可以避免包涵体的形成。最终确定诱导表达条件为25℃、IPTG浓度为1 mmol/L、诱导4 h,此时不仅蛋白表达量大并且不形成包涵体。为研究Lyqdvp001抑菌以及理化性能,采用浊度法对p H、温度、离子强度对裂解活性的影响进行探讨。结果表明,Lysqdvp001具有宽p H适应性,p H3¹0均能很好发挥作用;耐高温,在75℃处理30 min仍能维持70%活性;低浓度（0.1 mmol/L）的Zn²⁺、Fe²⁺以及各浓度（10、1、0.1 mmol/L）的Ca²⁺可以明显提高重组内溶素Lysqdvp001活性。结果显示重组内溶素有作为抑菌剂的潜力。      

沙门氏菌噬菌体STP4-a重组内溶素抑菌特性分析

为研究内溶素重组蛋白LysSTP4对沙门氏菌的抑菌性能,采用扩散法和浊度法探讨不同pH值、温度、离子强度等条件对其裂解稳定性的影响。结果表明,LysSTP4在pH 5～10和温度30～50 ℃的条件下均能保持较高的活性,在－80 ℃条件下保存6 个月仍有85%的残留酶活力,与膜通透剂乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA）协同作用能够有效抑制高浓度沙门氏菌的生长。     

LAMP技术快速检测海产品副溶血弧菌的条件优化

本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素tlh为目标基因设计特异性引物,优化反应条件,并对特异性、灵敏度进行了验证。LAMP最佳反应条件为,外内引物浓度比为1∶8,Mg2+反应浓度为4 mmol/L,d NTPs浓度为3.5 mmol/L,温度为65℃,反应时长为1 h,只对副溶血弧菌产生扩增反应,与其余细菌不产生扩增反应,细菌基因组DNA和纯培养物的灵敏度约为5.45×101 fg/μL和140 cfu/m L,对人工污染食品样品进行检测,检出限为2.8×102 cfu/m L。该方法反应时间短、特异性强、灵敏度高。      

金黄色葡萄球菌噬菌体qdsa001内溶素的特性预测及克隆表达

为获得噬菌体qdsa001的内溶素,本实验首先利用多种在线软件对内溶素lys56（GenBank：ARQ95812.1）的理化性质、信号肽、跨膜域和结构域等特性进行分析,然后选择克隆表达法制备目的蛋白。将合成的目的基因插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET-30a-lys56,转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中,获得表达稳定的基因工程菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,利用镍琼脂糖亲和层析纯化表达产物。经在线软件预测结果显示,该蛋白分子质量为35.1 kDa,无信号肽和跨膜域,仅含有一个Ami_2结构域。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示重组蛋白表达成功,且以可溶性蛋白的形式存在于细胞破碎上清液,分子质量约35?kDa,与预期蛋白大小一致。重组蛋白最佳表达条件为：IPTG浓度0.5?mmol/L,20?℃过夜诱导。     

副溶血弧菌生物膜的形成及壳聚糖的抑制作用

考察了不同来源的副溶血弧菌生物膜的形成能力,分析了不同培养条件对副溶血弧菌生物膜形成的影响,并进一步研究了壳聚糖对生物膜形成的抑制作用。采用结晶紫法测定生物膜形成量,XTT法检测生物膜的代谢活性,苯酚-硫酸法测定生物膜的胞外多糖,分析不同浓度壳聚糖对副溶血弧菌生物膜的抑制效果。结果表明,不同菌株生物膜形成条件不同,成膜能力不同,在蟹壳上更易形成生物膜。壳聚糖表现出了较好的抑制副溶血弧菌生物膜形成的能力,最低抑菌浓度下对生物膜形成的抑制率可达70.98%,胞外多糖的减少率为78.04%,代谢活性抑制率为46.83%。     

副溶血弧菌的磁珠捕获及检测

建立结合免疫磁珠和PCR快速检测副溶血性弧菌的新方法。本研究选用副溶血弧菌作为抗原免疫日本大耳兔制备了多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价。利用辛酸硫酸铵沉淀结合逆向吸附对多抗血清进行纯化,经SDS-PAGE和斑点杂交检测验证纯化后抗体的特异性。将纯化后的抗体偶联于羧基化修饰的纳米磁珠表面,用来进行菌体的捕获。结果表明,抗体的效价达到106,纯化获得只与副溶血弧菌发生反应的高纯度抗体。制备的免疫磁珠捕获率在55%～70%之间,且稳定性较好,盐离子浓度（3.5%NaCl、4.5%NaCl）对捕获率的影响不大,在pH5～9之间,磁珠捕获差异也较小。在对纯培养物的检测实验中,本方法最低检测限为102cfu/mL;而在鱼肉糜样本中的检测限为103cfu/mL,且样品中高浓度杂菌的存在不影响检测灵敏度。免疫磁珠结合PCR用于副溶血性弧菌的检测具有很高的灵敏度和特异性,具有广阔的前景。      

副溶血弧菌TDH的原核表达及单克隆抗体的制备

为实现副溶血性弧菌tdh基因的原核表达,采用TCBS选择培养基从贝类中筛选副溶血性弧菌疑似菌株;根据Gen Bank上已有的tdh基因序列,设计并人工合成引物,通过PCR技术鉴定副溶血性弧菌并扩增tdh基因;酶切后定向插入到p ET-28a表达载体中,构建重组表达质粒p ET-28a-tdh,转入E.coli Rosetta中,在IPTG诱导下进行TDH蛋白表达。为制备耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体,用纯化的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,成功用原核载体表达的TDH蛋白为免疫原,制得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为T9N10。获取腹水并经Ni-NTA Resin亲和柱纯化,其稳定分泌的单克隆抗体经鉴定为Ig G1,相对分子质量约为146 000,并表现出较强的特异性。本研究为开发副溶血弧菌免疫学快速检测和深入的研究奠定良好的物质基础。     

多价噬菌体内溶素的阳离子肽修饰及抗菌效果

多价噬菌体vB＿SEqdws-315因具备对沙门氏菌和大肠杆菌的跨谱裂解能力而具有良好的应用潜力,为进一步研究其内溶素Lysin315的抗菌效果,该研究尝试构建其大肠杆菌重组表达载体并进行诱导表达。结果表明,诱导表达得到的重组内溶素Lysin315分子质量接近25 kDa,可以在膜通透剂EDTA的参与下裂解沙门氏菌和大肠杆菌,但无法单独发挥抗菌效果。该实验尝试通过将含5～15个氨基酸的阳离子短肽克隆至内溶素末端以使其摆脱膜通透剂依赖性,实现对目标菌株的直接裂解作用。构建修饰内溶素的大肠杆菌重组表达载体,经诱导表达和亲和层析纯化,获得了高纯度的3种阳离子肽修饰内溶素(Lysin315-5aa、Lysin315-10aa、Lysin315-15aa)。3种修饰内溶素均可以在体外独立发挥抗菌作用。同时,修饰内溶素Lysin315-10aa在4℃和25℃条件下对牛奶中的沙门氏菌(10⁶ CFU/mL)也具有良好的抗菌效果。该研究初步为革兰氏阴性菌噬菌体内溶素的独立应用提供了解决策略。     

副溶血弧菌多克隆抗体的制备及其特性分析

确定了副溶血弧菌多克隆抗体的制备方法:用体积分数0.05%甲醛于30℃灭活副溶血弧菌4 h制备抗原,并将此抗原分多次,以不同剂量免疫新西兰大白兔获得特异性多克隆抗体,以山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,通过间接ELISA法测定其多克隆抗体的效价、敏感性和特异性。结果表明:在免疫的第5周产生大量高效价抗体,效价最高可达1.6×105;此多克隆抗体对副溶血弧菌检测灵敏度为1×105CFU/mL;交叉反应和阻断试验结果显示,此多克隆抗体具有很强的特异性。     

副溶血弧菌毒力因子及致病机理的研究进展

副溶血弧菌为一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌,是引发人食源性疾病的主要致病菌之一,主要分布在海洋环境中。副溶血弧菌的毒力因子主要包括黏附因子、侵袭因子、溶血性毒素、尿素酶、脂多糖、外膜蛋白、蛋白酶、Ⅲ型分泌系统和摄铁系统等。本文就副溶血弧菌的主要毒力因子及其致病机理的研究进展进行综述,可为进一步研究该菌的分子致病机理、制定快速精确的检测方法等提供参考。     

沙门氏菌及副溶血性弧菌的共增菌培养基的研制

为研制一种可同时富集沙门氏菌和副溶血性弧菌的增菌培养基,参照GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013规定的增菌培养基成分,并根据目标菌不同的营养需求,筛选适宜抑制剂和促进剂,进行单因素实验,确定共增菌培养基的配方,并验证该培养基的增菌效果。结果表明:研制出用于沙门氏菌和副溶血性弧菌的共增菌培养基成分为:蛋白胨10.0 g,磷酸二氢钾1.5 g,氯化钠7.5 g,硫代硫酸钠5.0 g,牛胆盐0.1 g,柠檬酸钠2.5 g,甘露醇2.5 g,葡萄糖2.5 g,蒸馏水1000 mL。目标菌初始接种量为10² CFU/mL,在37 ℃下培养16 h后,两种目标菌的菌浓度可达到10⁷~10⁸ CFU/mL。结果表明,共增菌培养基可用于沙门氏菌和副溶血性弧菌的富集培养,培养基配制简易,节约成本,具有良好的市场前景。     

双层平板直接定性定量法检测海产品中副溶血性弧菌

目的:建立一种直接定量定性检测海产品中副溶血性弧菌的方法。方法:参照国标菌落计数方法,筛选具备计数和显示副溶血性弧菌典型菌落颜色功能的培养基,将人工染菌样品分别置于50、4和-18℃温度下并分别进行测试。结果:在NaCl NA双层平板上副溶血性弧菌菌落呈淡紫色,在人工染菌样品实验中与NaCl NA平板计数无显著差异;NaCl NA双层平板直接定量检测4℃冷藏处理和-18℃冷冻的样品中副溶血性弧菌浓度分别是对照组的68.9%和21.7%。结论:NaCl NA双层平板法具备操作简便、检验周期短、结果稳定、灵敏度高等特点,适合应用于-18~50℃温度环境下放置的海产品中副溶血性弧菌直接定性定量检测,能如实反映样品受污染的情况。     

Effect of X-ray treatments on inoculated Escherichia coli O157: H7, Salmonella enterica, Shigella flexneri and Vibrio parahaemolyticus in ready-to-eat shrimp

This study was conducted to evaluate the inactivation effect of X-ray treatments on Escherichia coli O157: H7, Salmonella enteric (S. enterica), Shigella flexneri (S. flexneri) and Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) artificially inoculated in ready-to-eat (RTE) shrimp. A mixed culture of three strains of each tested pathogen was used to inoculate RTE shrimp. The shrimp samples were inoculated individually with selected pathogenic bacteria then aseptically placed in sterile plastic cups and air-dried at 22 °C for 30 min (to allow bacterial attachment) in the biosafety cabinet prior to X-ray treatments. The inoculated shrimp samples were then placed in sterilized bags and treated with 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 kGy X-ray at ambient temperature (22 °C and 60% relative humidity). Surviving bacterial populations were evaluated using a non-selective medium (TSA) with the appropriate selective medium overlay for each bacterium; CT-SMAC agar for E. coli O157: H7, XLD for S. enterica and S. flexneri and TCBS for V. parahaemolyticus. More than a 6 log CFU reduction of E. coli O157: H7, S. enterica, S. flexneri and V. parahaemolyticus was achieved with 2.0, 4.0, 3.0 and 3.0 kGy X-ray, respectively. Furthermore, treatment with 0.75 kGy X-ray significantly reduced the initial microflora on RTE shrimp samples from 3.8 ± 0.2 log CFU g⁻¹ to less than detectable limit (<1.0 log CFU g⁻¹).     

多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了使新普鲁兰酶基因在大肠杆菌中表达并实现高密度发酵生产,采用PCR方法从多粘类芽孢杆菌基因组DNA中扩增出新普鲁兰酶基因Npu,测序结果表明Npu基因全长2106 bp,编码515个氨基酸,与其他多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因序相似性高达99%。将Npu基因连接到质粒PMD18T上,构建了PMD18T-Npu vecter重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌BL21中,该酶基因在大肠杆菌细胞中获得活性表达,并能将酶蛋白分泌到胞外。重组菌株BL21 PGEX 4T-1-Npu具有较好的遗传稳定性,连续传代培养10代,菌株所产酶总酶活性仍保持在715 U;纯化后的酶液于25 ℃保存6个月酶活性仍保持在5427 U,于4 ℃保存12个月酶活性仍保持在5390.5 U。这是首次对来源于类芽孢杆菌属(paenibacillus)的普鲁兰酶进行报道,由于Npu具有较好的水解淀粉支链的能力,因此其在淀粉加工业以及洗涤业上应用前景良好。     

Expression and purification of the recombinant mustard trypsin inhibitor 2 (MTI2) in Escherichia coli

The mustard trypsin inhibitor 2, MTI2, was expressed in Escherichia coli. A specific procedure for its production and purification is described. The recombinant protein was recovered by protein extraction from the insoluble fraction, then renatured and purified by ion exchange and gel filtration chromatography. Finally, the inhibitory activity against trypsin was also determined.     

Expression of recombinant Thermomonospora fusca xylanase A in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it

The mature peptide of Thermomonospora fusca xylanase A (TfxA) was successfully expressed in Pichia pastoris under the control of AOX1 promoter. The activity of recombinant T. fusca xylanase A (reTfxA) in culture supernatant was 117.3 ± 2.4 U/mg, which is 3 times higher than that of the native TfxA. The optimal temperature and pH for reTfxA were 60 °C and 6.0, respectively. When treated at 70 °C and pH 6.0 for 2 min, the residual activity of the reTfxA was 70%. The reTfxA was very stable over a wide pH range (5.0–9.0). After incubation over pH 5.0–9.0 at 25 °C for 1 h, all the residual activity of reTfxA was over 80%. The K_m and k_cat values for reTfxA were 2.45 mg/ml and 139 s⁻¹, respectively. HPLC analysis revealed that xylobiose (X2) was the main hydrolysis product released from birchwood xylan and wheat bran insoluble xylan by reTfxA. Hydrolysis results of xylooligosaccharides showed that reTfxA was an endo-acting xylanase and xylobiose, xylotriose (X3), xylotetraose (X4), xylopentaose (X5), and xylohexaose (X6) could be hydrolysed. This is the first report on the expression of reTfxA in yeast and on the determining and quantifying of the hydrolysis products released from xylans and xylooligosaccharides by reTfxA.