利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸

本文探究以甘油为唯一碳源发酵合成L-丙氨酸的可行性。以删除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径的Escherichia coli B0016-050为出发菌株,用λpL启动子及其调控下的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的丙氨酸脱氢酶基因(ala D)替换B0016-050菌株染色体上丙氨酸消旋酶基因(dad X),获得温度控制型L-丙氨酸合成菌株B0016-060BC。菌株B0016-060BC以甘油为唯一碳源进行两阶段发酵(包括菌体生长阶段和L-丙氨酸合成阶段),表明在菌体生长至对数后期起始L-丙氨酸合成或者提高L-丙氨酸发酵阶段的通气量可提高L-丙氨酸合成水平。进一步经5 L发酵罐发酵,可合成63.64 g/L L-丙氨酸,整个发酵阶段体积生产强度达到1.91 g/(L·h)、转化率达到62.89 g/100 g甘油,仅合成少量的乙酸(1.73 g/L)等副产物。实现了以甘油为唯一碳源高效合成L-丙氨酸,为工业应用提供了重要参考。     

利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸

本文探究以甘油为唯一碳源发酵合成L-丙氨酸的可行性。以删除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径的Escherichia coli B0016-050为出发菌株,用λpL启动子及其调控下的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的丙氨酸脱氢酶基因(ala D)替换B0016-050菌株染色体上丙氨酸消旋酶基因(dad X),获得温度控制型L-丙氨酸合成菌株B0016-060BC。菌株B0016-060BC以甘油为唯一碳源进行两阶段发酵(包括菌体生长阶段和L-丙氨酸合成阶段),表明在菌体生长至对数后期起始L-丙氨酸合成或者提高L-丙氨酸发酵阶段的通气量可提高L-丙氨酸合成水平。进一步经5 L发酵罐发酵,可合成63.64 g/L L-丙氨酸,整个发酵阶段体积生产强度达到1.91 g/L h、转化率达到62.89 g/100 g甘油,仅合成少量的乙酸(1.73 g/L)等副产物。实现了以甘油为唯一碳源高效合成L-丙氨酸,为工业应用提供了重要参考。     

安全酵母Candida glycerinogenesis食品级甘油合成关键基因的研究

为了研究酵母甘油合成关键酶基因在食品级甘油合成中的重要作用,以产甘油假丝酵母基因组为模板,设计引物,克隆获得甘油合成关键酶基因3-磷酸-甘油脱氢酶基因(CgGPD),并在大肠杆菌中通过tac启动子串联表达来自酿酒酵母的3-磷酸甘油酯酶基因(ScGPP2)。经IPTG诱导培养后,3-磷酸-甘油脱氢酶(CgGPD)的比酶活达到了60mU/mg。在30%的葡萄糖浓度下,经过48h的摇瓶发酵,可合成甘油2.52g/L。表明3-磷酸甘油酯酶在甘油合成过程中起了关键作用,过表达CgGPD基因有助于食品级甘油大量合成,从而降低下游分离纯化的难度,可从分子水平进一步提高甘油的产量。     

底物选择性大肠杆菌共发酵葡萄糖和木糖产生乙醇

为了实现混合糖发酵产乙醇过程中葡萄糖和木糖的同步利用,采用基因删除技术,经代谢工程改造,构建了葡萄糖/木糖选择性代谢产乙醇大肠杆菌,并通过摇瓶发酵试验研究双菌株共发酵产乙醇的发酵性能。在删除了甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸合成途径的出发菌株Escherichia coli B0013-1031 (pta-ackA,ldh A,pfl B,frd A)基础上,删除木糖异构酶基因xyl A,得到木糖不利用菌株B0013-2010;通过回复突变修复B0013-1031 xyl H功能,并删除其中葡萄糖运输和代谢途径关键酶基因pts G、glk和man Z,得到葡萄糖不利用菌株B0013-2011H。将携带Zymomonas mobilis乙醇合成途径关键酶基因pdc和adh B的质粒p Etac-PA分别转入上述菌株,获得产乙醇重组菌B0013-2010PA和B0013-2011HPA;以此双菌株共发酵葡萄糖和木糖合成乙醇,乙醇合成速率为1. 01 g/(L·h),葡萄糖和木糖消耗速率分别为2. 02 g/(L·h)和1. 05 g/(L·h)。双菌株共发酵显著改善了乙醇发酵过程葡萄糖和木糖的同步利用。     

甘油替代葡萄糖作为碳源生产丙酮酸

光滑球拟酵母是重要的丙酮酸工业生产菌株,主要利用葡萄糖作为碳源生产丙酮酸。该研究以产量大且价格便宜的甘油部分替代葡萄糖并控制碳源组成为80 g/L葡萄糖和20 g/L甘油,摇瓶条件下发酵52 h,丙酮酸产量达到27.6 g/L,在7 L发酵罐上最终丙酮酸产量为61.7 g/L,与碳源为100 g/L葡萄糖的对照条件相比,几乎没有任何变化。由于碳源是培养基的主要成分,用甘油替代葡萄糖可以降低丙酮酸生产的原料成本,减轻由于大量生物柴油合成造成的甘油产能过剩问题。     

产琥珀酸大肠杆菌工程菌株的构建

大肠杆菌在厌氧条件及不额外添加电了受体的条件下可利用葡萄糖进行混合酸发酵,主要产物为甲酸、乙酸和乙醇,丁二酸及乳酸含量较低.为减少副产物的生成,使更多的代谢流流向丁二酸,本研究拟失活厌氧条件下甲酸、乙酸及乳酸主要生成途径相关的酶(乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂解酶).借助Red重组系统和位点特异性重组技术,无痕敲除了野生大肠杆菌W3110染色体上编码2个酶的基因pfl和ldh,构建了1株pfl和ldh双突变重组菌JM1307(△pfl △ldh),并引入PYC前后对比实验表明:JM1307(pTrc99a-pyc)较出发菌株解除了生长抑制,在8g/L初糖条件下,发酵48h,菌体密度可提高全OD6002.5,产物主要为丁二酸(2.8g/L),乙酸含量很低,无甲酸、乳酸生成.     

碳源对圆酵母(Torula sp.)B84512发酵合成赤藓糖醇及副产物甘油的影响

研究了圆酵母(Torula sp.)B84512以不同碳源发酵产赤藓糖醇过程中副产物甘油的生成与消耗情况。发现该菌株在以任何碳源为底物发酵过程中均会产生甘油,且在发酵中后期甘油逐渐被消耗。以甘油为唯一碳源时该菌株合成赤藓糖醇的速率及产率均低于葡萄糖。葡萄糖为圆酵母B84512发酵产赤藓糖醇的最佳碳源。采用分批补料的方式提高赤藓糖醇的产率并期望能抑制甘油的生成,实验结果表明补料至总糖浓度为50%时赤藓糖醇产量最高为253 g/L,产率为1.03 g/(L.h)。但甘油产量与葡萄糖的浓度呈正相关,分批补料并不能有效抑制甘油的生成,反而导致发酵周期大大延长,对于工业化生产极其不利。通过对甘油的生成及消耗过程中关键酶胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)、3-磷酸甘油酯酶(GPP)、线粒体3-磷酸甘油脱氢酶(mtGPD)酶活测定,确定胞浆3-磷酸甘油脱氢酶为甘油合成途径的关键酶,为以后对圆酵母B84512中甘油代谢途径的基因工程改造选育奠定了基础。     

高产琥珀酸重组大肠杆菌的构建及厌氧发酵

以野生型大肠杆菌Escherichia coli W为出发菌株,利用Red同源重组系统分别敲除了乳酸脱氢酶基因(ldhA)、乙醇脱氢酶基因(adhE)、丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)、丙酮酸氧化酶基因(poxB)和乙酸激酶基因(ackA),再通过无氧生长进化筛选过程,构建得到在厌氧条件下能有效生长,并以琥珀酸为主要发酵产物的重组大肠杆菌WS100(△ldhA,△adhE,△pflB,△poxB,△ackA)。利用15 L发酵罐进行厌氧发酵测定显示,经72 h发酵,菌体密度OD600最大值可提高至6.48,琥珀酸产量达到70.13 g/L,琥珀酸的生产强度为0.98 g/(L.h),葡萄糖-琥珀酸转化率为76%。发酵液中副产物含量低,乙酸含量为5.34 g/L,乳酸产量仅为0.15 g/L,未检测到甲酸和乙醇生成。结果表明,厌氧条件下,该工程菌可有效利用低营养成分的无机盐培养基,在不表达任何外源基因的条件下可稳定高产琥珀酸,具有极大的工业化开发前景。     

重组大肠杆菌内PDC和ADH表达条件优化

丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶II可将丙酮酸定向转化成乙醇。将已构建的含有丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶II基因的表达载体p ET-28a(+)-pdc-RBS-adh B转入大肠杆菌BL21中,实现在大肠杆菌体内高产乙醇的目的。对该工程菌株进行定性检测,优化诱导表达条件,定量检测,SDS-PAGE分析和做发酵试验,结果表明丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶II的最佳表达条件为IPTG浓度1.0 mmol/L,诱导时间7 h,诱导温度37℃。其最大酶活分别为1.34 U/mg和3.88 U/mg。重组子利用葡萄糖、木糖和混合糖发酵。在葡萄糖中发酵72 h,获得最大乙醇产量6.86 g/L,最高乙醇得率0.40 g/g。     

产细菌纤维素菌株中间葡糖醋杆菌的分离与发酵条件优化

从中国传统固态发酵食醋醋醅中分离出5株产细菌纤维素(BC)的菌株,经生理生化特征及16S rDNA序列分析,它们均属于中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius),其中编号为1-17的菌株初始产量较高。应用扫描电镜技术(SEM)和傅里叶红外光谱技术(FT-IR)分析了BC结构特征。采用单因素研究了温度、培养时间、碳源、初始pH对BC合成的影响。确定菌株1-17最适温度为35℃,发酵时间为7d,甘油和葡萄糖为最适碳源,最适初始pH为6.0,乳酸根离子和钙离子能够促进BC的合成。通过培养条件优化使得细菌纤维素产量从初始的(3.90±0.08)g/L增加到(7.90±0.19)g/L。     

玉米皮渣类纤维兼氧发酵产丁二酸

采用酶酸两步法水解玉米皮渣,重点考察了稀HCl水解条件变化对还原糖产率的影响,并以产琥珀酸放线杆菌为发酵菌株,探讨以玉米皮渣类纤维为原料替代葡萄糖为碳源,兼氧发酵产丁二酸的可行性。结果表明:在HCl浓度1.5%,底物浓度为12%,100℃水解4h的水解工艺下,还原糖产率达83%。在还原糖质量浓度40g/L,玉米浆为氮源,35℃发酵60h的条件下,丁二酸产率达到19.41g/L。应用玉米加工副产物玉米皮渣和玉米浆为原料发酵产丁二酸具有良好的应用前景。     

响应面试验优化产琥珀酸放线杆菌GXAS137发酵粗甘油产丁二酸工艺

通过优化产琥珀酸放线杆菌GXAS137发酵粗甘油产丁二酸的培养基,提高丁二酸产量,降低生产成本。先通过单因素试验对粗甘油发酵产丁二酸的电子受体、初始粗甘油质量浓度及氮源进行了优化,再利用响应面试验确定重要参数的最佳水平。结果表明：二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）为最适电子受体,玉米浆可替换酵母粉作为氮源,各因素的最佳条件为：初始粗甘油质量浓度55.43?g/L、DMSO质量浓度10.35?g/L、玉米浆质量浓度17.69?g/L。优化后丁二酸产量达到37.02?g/L,丁二酸得率为66.79%,生产强度为0.51?g/（L·h）。与初始条件下丁二酸产量（16.88?g/L）相比,优化后提高了1.19?倍。本研究为微生物发酵粗甘油原料生产丁二酸提供了理论支持。     

海藻酸钠裂解酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶条件的优化

以海藻酸钠为唯一碳源培养基,对广西北海涠洲岛采集的马尾藻进行微生物的筛选和分离,采用 3, 5-二硝基水杨酸法 (DNS)进行海藻酸钠裂解酶相对酶活力测定,获得高产酶菌株M0101;依据形态、生理生化特征及 16S rDNA 序列分析对其进行鉴定,该菌属于弧菌属,命名为Vibrio gangliei M0101;通过单因素实验确定了菌株M0101的产酶优化方案:海藻酸钠50 g/L,(NH₄)₂SO₄ 2 g/L,K₂HPO₄ 1 g/L,NaCl 100 g/L,MgSO₄·7H₂O 1 g/L,FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L,培养温度30 ℃,初始pH9.0,200 r/min;优化后菌株 M0101产酶最大活性可达221.90 U/mL,相较于优化前最大酶活36.32 U/mL,优化后酶活力是优化前的6.11倍。表明M0101能高效水解高浓度海藻酸钠,是强耐盐的菌株,具有大规模制备海藻酸钠裂解酶的潜力。     

基于高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌培养基优化

该研究从东北酸菜中筛选出高产γ-氨基丁酸（GABA）的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LAG-1003,并通过单因素试验及响应面法对菌株LAG-1003发酵培养基成分进行优化,以提高该菌产GABA的能力。结果表明,最佳培养基成分组成为：复合碳源（葡萄糖与丁二酸钠比例为3∶1）添加量26 g/L,复合氮源（酵母膏与小米糠比例为1∶1）添加量26 g/L,谷氨酸钠添加量16 g/L。采用优化后的培养基,33℃条件下培养48 h,发酵液中的γ-氨基丁酸的含量为6.15 g/L,是优化前的2.91倍。     

玉米秸秆糖醇发酵产丁二酸及表征

以玉米秸秆糖醇液为原料,考察产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）X-1对不同单一碳源的同化能力,并验证产琥珀酸放线杆菌可同化利用玉米秸秆糖醇液。利用Box-Behnken中心组合设计试验,通过响应面分析法优化发酵工艺参数为：玉米秸秆糖醇液初始还原糖质量浓度42.81 g/L、酵母膏质量浓度12.53 g/L、缓冲剂MgCO3质量浓度15.90 g/L,经5 L发酵规模实验,发酵周期48 h,丁二酸产率为85.1%,还原糖利用率为85.4%。经红外光谱和核磁共振表征其发酵产物为生物基丁二酸。     

碳源对克氏菌合成PTT原料PDO的影响及对DhaB的表达调控

为提高1,3-丙二醇（PDO）产量,加快聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）的产业化应用。考察了不同碳源对克雷伯氏菌合成PDO过程中碳流的影响和对关键酶DhaB的表达调控。结果表明,克雷伯氏菌不能直接利用葡萄糖合成PDO;以甘油为单一碳源时,PDO的产量仅为9 g/L,同时细胞生长受到一定抑制;而在甘油为底物的情况下,添加5 g/L的葡萄糖能够使菌体生物量提高66.7%、dhaB的转录上调20%、DhaB酶活提高64%,同时PDO产量提高1.5倍。上述结果表明混合碳源策略能够激活克雷伯氏菌PDO合成途径关键酶DhaB的表达,提高PDO的产量。     

稀酸水解玉米皮制备丁二酸发酵糖液的研究

研究了稀酸水解玉米皮制备丁二酸发酵糖液的工艺条件,通过正交试验及优化调整得到稀酸水解玉米皮的优化工艺条件:水解温度110℃、加酸量1%、粒径20～40目、反应时间90min,总糖收率90.37%,总糖浓度85g/L。其糖液经活性炭脱色,脱色率达92.27%,脱色的总糖损失率低于5%,糠醛含量仅为0.236g/L。经厌氧发酵实验初步验证,玉米皮水解液可替代葡萄糖作为丁二酸发酵的碳源。     

农用废弃物固态发酵生产衣康酸工艺研究

以土曲霉AS32811为发酵菌种,农用废弃物麸皮7.5g,玉米芯6.0g为出发培养基,在自然pH值条件下采用单因素试验研究碳源、氮源、无机盐对衣康酸产酸效果的影响。结果显示,该菌可以利用实验所选择的碳源生产衣康酸,葡萄糖为碳源时得率最高;氮源实验结果表明,NH4NO3是最适的产酸氮源。在单因素试验的基础上进行了五因素四水平的正交试验以优化产酸工艺。衣康酸生产的优化条件为:250mL三角瓶中加入玉米芯7.5g、麸皮6.0g、葡萄糖4g、营养液25mL(NH4NO3,4g/L;KH2PO4,0.1g/L;MgSO4,6g/L;C6H12O6,4g;ZnSO4.7H2O,0.015g/L),接种量为1mL(1×107孢子/mL)、温度36℃、湿度为65%条件下自然发酵72h,衣康酸产率可达63.5%。以土曲霉AS32811为发酵菌种,农用废弃物麸皮7.5g,玉米芯6.0g为出发培养基,在自然pH值条件下采用单因素试验研究碳源、氮源、无机盐对衣康酸产酸效果的影响。结果显示,该菌可以利用实验所选择的碳源生产衣康酸,葡萄糖为碳源时得率最高;氮源实验结果表明,NH4NO3是最适的产酸氮源。在单因素试验的基础上进行了五因素四水平的正交试验以优化产酸工艺。衣康酸生产的优化条件为:250mL三角瓶中加入玉米芯7.5g、麸皮6.0g、葡萄糖4g、营养液25mL(NH4NO3,4g/L;KH2PO4,0.1g/L;MgSO4,6g/L;C6H12O6,4g;ZnSO4.7H2O,0.015g/L),接种量为1mL(1×107孢子/mL)、温度36℃、湿度为65%条件下自然发酵72h,衣康酸产率可达63.5%。     

利用生物柴油副产物粗甘油发酵生产EPA

实验利用生物柴油副产物甘油为碳源,培养畸雌腐霉(Pythiumirregulare)发酵生产EPA。实验中所用废甘油为利用碱法催化大豆油与甲醇进行酯交换反应生成,粗甘油经过纯化精制作为碳源。EPA产量采用气相色谱分析,分析之前采用浓硫酸-甲醇酯化法进行脂肪酸甲酯化。由实验得出,最佳发酵条件为:温度为25℃,pH为6,转速为170r/min,粗甘油加入量为70g/L,此条件下获得的EPA产量为:105mg/L。