快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法的研究

目的：为产单核李斯特菌提供了一个方便快捷切实有效的检测技术。方法：采用胶体金标记产单核李斯特菌抗体制备免疫层析检测试剂，通过免疫层析作用对产单核李斯特菌进行检测。结果：通过选用柠檬酸钠改良法制备胶体金，测定其最适结合蛋白浓度为28μg／ml，构建起免疫层析检测试剂和检测方法，检测了冷冻猪肉、牛奶、冰激凌以及不同稀释度的产单核李斯特菌标准样品，灵敏度达87．5％，具有良好的重现性。结论：免疫胶体金层析法用于快速检测产单核李斯特菌是可行的。     

2000～2004年浙江省食品中产单核李斯特菌污染状况调查

目的：掌握浙江省食品中产单核李斯特菌污染状况。以及内化素基因（Inl）和李氏溶血素O（Hly）两种致病基因携带情况。方法：按GB4789．30方法分离单增生李斯特菌，采用PCR技术检测李斯特菌的两种致病基因。结果：2000～2004年从2282份食品中共分离产单核李斯特菌163株，总污染率为7．14％（163／2282）。生肉类、熟肉及水产品的污染率分别为12．80％、7．67％和2．24％；114份生食蔬菜中1份标本分离到产单核李斯特菌；285份乳及乳制品、59份冰激凌均未分离到产单核李斯特菌；163株产单核李斯特菌有155株同时检测到内化素基因和李氏溶血素O基因。结论：我省存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险。     

市售猪肉产单核细胞李斯特菌分离及hly基因序列分析

目的：了解市售猪肉中产单核细胞李斯特菌（Lm）的污染状况及Lm分离菌株hly基因部分序列的分析比较。方法：分离菌株鉴定应用聚合酶链反应（PCR）；以PCR产物直接测序，对780bp片段作序列分析。结果：市售猪肉产单核细胞李斯特菌的污染率为1．08％（4／370）；分离菌株WLD1和FCY1与国内外14个参考菌株的同源性分别为96．4％～98．6％和95．0％-97．2％，而两分离株之间的同源性仅为95．9％。结论：合肥市市售猪肉中有一定程度产单核细胞李斯特菌的污染，且存在李斯特菌病的可能性和食物中毒的潜在危险；分离菌株WLD1和FCY1，尤其是FCY1分化程度较高．Lm hly基因核苷酸序列蒡异的距离与地理分布、菌株的样品来源无相关性。     

RT-PCR方法检测单核细胞增生李斯特活菌研究

目的:建立单核细胞增生李斯特活菌快速检测技术,解决PCR带来的假阳性问题。方法:采用以mRNA为基础的RT-PCR方法对单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因进行检测,设计引物,扩增,并作了特异性和灵敏度比较。结果:该引物能较好地扩增单核细胞增生李斯特菌的特异性片断,而对其它的李斯特菌以及常见食源性致病菌无特异性扩增条带;检测的灵敏度纯菌可达到1×104cfu/m l,人工污染样品猪肉、虾肉和牛奶等培养12~16 h,可达4.5 cfu/m l(g)。结论:可以应用该方法对样品中单核细胞增生李斯特活菌进行检测,能较好地解决PCR检测所带来的假阳性问题。     

套式PCR快速检测单增李斯特氏菌

根据GenBank数据库的单增李斯特氏菌iap基因设计两对引物,建立了套式PCR快速检测单增李斯特氏菌的方法。两对引物分别扩增出约1500bp和500bp片段,与预期大小一致。对菌液、模拟样品的检测表明,本方法能有效地克服食品基质、培养基成分和杂菌对PCR检验的干扰作用。套式PCR方法具有很好的特异性;灵敏性实验检测极限为101CFU／ml;人工污染猪肉检测极限为103CFU／ml;可在7h内完成检测,很适宜于进出口食品中单增李斯特氏菌的快速检测。     

荧光实时定量PCR检测单核李斯特菌方法学建立及应用

目的 建立检测单核细胞增多性李斯特菌的荧光定量PCR方法，并利用此方法检测人工污染的牛奶中单增李斯特菌菌量。方法 选择单增李斯特菌特异性的基因Listeriolysin O基因为靶目标设计引物，采用煮沸法抽提纯单增李斯特菌株（1／2a）DNA，建立SYBRGREEN实时定量PCR检测体系：结果 定量PCR对李斯特菌可产生特异扩增信号，对其他菌（大肠杆菌）无响应。标准曲线的相关系数为0．9521。最小检菌量约为100个菌落形成单位／反应体系。在人为污染牛奶检测中，与传统细菌计数方法结果相比，相关系数为0．839。结论 实时定量PCR是一种快速、灵敏的定量检测单增李斯特菌的方法，可用于牛奶样品的检测。     

Taq Man-MGB探针Real-timePCR快速检测单增李斯特菌的研究

目的：建立TaqMan—MGB探针Real—time荧光PCR快速检测单增李斯特菌技术。方法：在对单增李斯特菌invA序列进行分析、比较基础上，设计一对特异性TaqMan—MGB探针法引物及探针，通过Real—timePCR反应条件和反应体系的优化，实现对单增李斯特菌的快速检测；用克隆到pMD18-T载体上的李斯特菌invA基因阳参片段及不同菌株、食品标本验证方法的特异性和敏感性。结果：方法的灵敏性高，其循环阈值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系，最低可检测57个拷贝数，经18h增菌，可检测低至4．5cfu／ml的细菌；特异性强，检测6株单增李斯特菌标准株和100株单增李斯特菌样品分离株的PCR循环域值（cT值）均小于25，而90株威氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌以及非李斯特菌PCR循环域值（CT值）大于35；快速，最快1h可出结果，实际样品20h可出结果，而常规细菌培养法需要一周以上；对103份速冻米面食品进行检测，13份阳性，与常规方法无显著性差异（P〉0．05）。结论：TaqMan—MGB探针的单增李斯特菌Real—time荧光PCR检测方法具有特异性强，敏感性高，易操作等优点，可推广应用。     

单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测技术研究

目的建立快速检测单增李斯特菌的PCR-ELISA方法,将其应用于人工污染的食物样品检测。方法根据GenBank数据库资料,应用分子生物学软件DNAMAN6.0和Primer Premier5.0,以单增李斯特菌的致病基因hlyA为基础,选用PCR引物,应用地高辛标记试剂盒,获得单增李斯特菌特异的地高辛标记片段。根据PCR目的片段序列,设计特异性捕获探针,建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。应用该方法对不同血清型的单增李斯特菌食品分离株进行了检测,并将PCR方法与PCR-ELISA方法对人工污染单增李斯特菌的牛奶样品的检测敏感性进行了比较。结果应用单增李斯特菌特异的PCR-ELISA方法完成检测约需6h。该方法对单增李斯特菌分离株检测的结果,与国家食源性疾病检测网的鉴定结果100%符合。经过12h的增菌培养,PCR-ELISA方法最低可从25ml样品中检出1CFU,检测敏感性为传统PCR方法的10～100倍。结论建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。该方法敏感性高、特异性强、可靠性好,对于提高食源性疾病预警、预测能力,增强检测的时效性和准确性,具有推广应用价值。     

南京地区6类食品中李斯特菌污染状况研究

采用改进后的李斯特菌检验的国标规定方法检测了６类１６７份食品李斯特菌污染情况,结果总的样品阳性率达１１．４％,其中以腌制肉类、冷冻海产品、生猪肉及冷饮较为严重,卤菜也有检出,有些样品中还呈现多重污染．检出菌株中,７７．４％初步判定为单核增生李斯特菌。表明南京地区存在着较为严重的李斯特菌污染。     

应用Taqman实时PCR法检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌

目的建立敏感快速的检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌的实时PCR方法。方法以hlyA基因为靶标,建立并验证实时PCR法的特异性。选用单核细胞增生李斯特菌CMCC 54004,制备不同浓度的纯菌液,用实时PCR进行检测,制作标准曲线并计算扩增效率。进行人工染菌实验,染菌量分别为每25g猪肉样本1.3×100、1.3×101、1.3×102、1.3×103、1.3×104、1.3×105和1.3×106CFU。分别在增菌0、4、8、12、18、24、30、36和46 h取1 ml培养液,提取DNA进行实时PCR检测,并用PCR和传统方法进行检测,比较3种方法检测的敏感性和特异性。采集24份市售猪肉样本,用这3种方法进行检测,进一步比较三者的阳性检出率。结果建立的实时PCR法特异性好,对纯菌液的检出限为1.3×103CFU/ml。人工染菌样本增菌24 h后,实时PCR检出限1.3 CFU/25 g,PCR及传统方法达到这一检出限需要增菌46 h。根据增菌24 h的检测结果,建立实时PCR样本标准曲线。24份猪肉样本,实时PCR检出17份阳性,阳性率70.83%(17/24),与PCR和传统方法的阳性率一致。根据所得的样本标准曲线,对检测样本进行定量分析,确定了阳性样本中初始含量菌。结论所建立的实时PCR具有快速简便、敏感特异等优点,整个操作可在27 h内完成,适用于猪肉中单核细胞增生李斯特菌的快速定量检测。     

牡蛎中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种无需前增菌快速检测牡蛎中单核细胞增生李斯特菌的PCR方法。方法 利用β-环糊精和膨润土包被活性炭处理牡蛎样品，去除聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)反应抑制因子，以单核细胞增生李斯特菌特异基因inlB为靶基因，建立无需样品前增菌的PCR快速检测方法。同时验证该方法的特异性、灵敏度及实用性参数，并评估该方法所用试剂在冷冻保存后的稳定性与实用性。结果 建立的PCR方法对130株目标菌和63株非目标菌的检测特异性为100%,灵敏度达10 CFU/25 g。该方法无需前增菌，4 h即可完成检测。PCR方法和国标方法对实际样品中单核细胞增生李斯特菌的检出率(均为13%)和活菌检测率(均为100%)一致，即符合率100%。此外，该方法所用试剂在-20℃冷冻条件下可稳定保存至少1年。结论 建立的PCR方法特异性强、灵敏度高，可快速、准确检测出牡蛎中的单核细胞增生李斯特菌。     

2005—2007年衢州市食品中产单核李斯特菌污染状况调查

目的:掌握衙州市食品中产单核李斯特菌污染状况.方法:按GB/T4789.30-2003方法分离单增生李斯特菌.结果:2005～2007年从323份食品中共分离产单核李斯特菌27株,总污染率为8.36%(27/323).生肉类、水产品的污染率分别为14.55%、7.32%;熟肉、生食果蔬类及其制品中未检出.结论:我市存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险.     

2005年石家庄市部分食品中产单核细胞李斯特菌污染状况调查

[目的]了解石家庄市主要食品中产单核细胞李斯特菌污染情况，为预防和控制可能由产单核细胞李斯特菌污染引发的食源性疾病提供依据。[方法]2005年，在石家庄市采集市售5类食品进行分离鉴定。[结果]检测5类250份食品样品，检出13株产单核细胞李斯特菌，阳性率为5．20％。130份生肉类阳性率为6．92％（猪肉为20．00%，羊肉、牛肉均为3．33％，鸡肉为2．50％；30份熟肉制品阳性率为6．67％，30份生食蔬菜阳性率为6．67％；36份水产品、24份奶粉均为阴性。13株产单核细胞李斯特菌溶血试验均阳性。[结论]生肉类、熟肉制品、生食蔬菜是主要的危险食品。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单增李斯特菌的比较

目的：比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法及细菌培养法检测单核细胞增生性李斯特菌的灵敏度与特异性。方法：采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR及传统细菌培养法3种方法,同时对单核细胞增生性李斯特菌等细菌进行检测。结果：实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19 cfu/ml,且有很高的特异性,对英诺克李斯特菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论：实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。     

产单核李斯特菌的研究进展

产单核李斯特菌属于典型的胞内寄生菌，是一种可引起全世界范围内人畜共患和食源性疾病的致病菌。文章从该菌的生物学特性、毒力因子、与动物性食品污染的关系以及检测等方面的研究进展进行了阐述。     

近3年来吉林省食品中沙门菌和单增李斯特菌主动监测及结果分析

目的：了解吉林省高危食品中沙门菌、单核细胞增生李斯特菌的污染状况，为国家食品安全监测网提供数据。方法：增菌后，用科玛嘉显色培养基分离，AIP生化板和泰国产血清鉴定。结果：检测生畜肉、生禽肉、非定型包装熟肉制品、生牛奶、淡水鱼、蔬菜共1021件，检出沙门菌102株，检出率10.0％；检测单核细胞增生李斯特菌样品共1181件，检出单核细胞增生李斯特菌169株，检出率14．3％。结论：3年来沙门菌监测结果05年最高，阳性率每年有连续增长趋势。阳性率以生猪肉最高，生鸡肉次之。3年中李斯特菌连续监测阳性率变化，以05年最高，03年次之。生鸡肉阳性率最高，生猪肉次之，生蔬菜少见。     

河北省食品中李斯特菌污染状况调查

产单核李斯特菌是一种严重的人畜共患病原菌并可引起食源性疾病的暴发和流行。该菌可导致人和动物患脑膜炎、败血症、流产等，病死率高达30％-70％。为全面了解河北省居民主要消费食品中李斯特菌污染的本底情况，寻找可能引起食源性李斯特菌病的重点食品，为进一步开展食品安全性研究和预防控制食源性李斯特菌病的发生提供科学依据，我们于2004年9—12月对市场上销售的各种肉类、冷冻食品、蔬菜、海产品、鲜奶等食品进行了监测，结果如下：     

质控样品鉴定结果分析

[目的]提高无锡市食品污染物微生物检验质量及检验能力.[方法]将传统分离鉴定法、PCR检测法同时用于质控样品的检测,并对其PCR检测技术应用结果进行比较分析.[结果]综合菌落形态、染色镜检、生化试验和溶血试验及用PCR技术进行单核细胞增生李斯特菌的快速检测,报告质控样品中检出单核细胞增生李斯特菌.[结论]传统分离鉴定法结果与PCR检测结果相符性好.     

改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌（LMO）的快速方法，应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法：根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，建立改良分子信标-实时PCR检测体系，应用于食品中LMO检测。结果：改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110fg，菌液灵敏度为99cfu／ml或4cfu／PCR反应体系，无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO，均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时问由原来的至少4d缩短至1d。对228份食品进行LMO检测，8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性，其中6份1310细菌培养阳性。结论：改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高，特异性强．能提高LMO的检出率和准确性，可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断。     

深圳市熟肉制品致病菌监测结果分析

目的:了解深圳市熟肉制品受致病菌污染的状况,为食源性疾病的预防和控制提供科学依据。方法:对酒店、超市和市场禽类熟肉制品随机采集360份样品,依据国标方法、荧光PCR方法及全自动微生物分析仪,对上述样品进行致病菌检测。结果:360份样品共检出致病菌38株,检出率10.56%,其中沙门菌4株、金黄色葡萄球菌32株、单增李斯特菌2株。酱卤类、烧烤类、白切类熟肉制品检出率分别为11.66%、3.33%、16.67%。结论:深圳市熟肉制品受致病菌污染严重,以金黄色葡萄球菌、沙门菌和单核李斯特菌污染为主;白切类熟肉制品受致病菌污染最为严重为16.67%;其次是酱卤类为11.66%;最后是烧烤类为3.33%。说明酒店、超市熟肉制品存在很大问题,应加大对熟肉制品监管力度,保证食品质量,确保消费者健康。