酶法制备牡蛎抗氧化肽研究

目的优化牡蛎酶解制备抗氧化肽的工艺。方法通过正交试验法确定胃蛋白酶、胰蛋白酶及这两种蛋白酶的酶解液抗氧化(Fenton体系)的最佳工艺条件;采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱层析法对酶解液中抗氧化肽进行分离纯化。结果胃蛋白酶最佳酶解条件:温度35℃、加酶量2.5%、时间6h、pH 2.0,在此条件下清除率达到50%时的酶解液浓度(EC50)为1.929mg.mL-1;胰蛋白酶最佳酶解条件:温度45℃、加酶量2%、时间8h、pH 7.5,EC50为1.165mg.mL-1;胰蛋白酶、胃蛋白酶分步酶解法的酶解液EC50为0.869mg.mL-1。双酶酶解液经纯化后,得相对分子质量为751的抗氧化活性肽组分(BPO-Ⅱ),其EC50为0.529mg.mL-1。结论双酶酶解法优于单酶酶解法,从双酶酶解液中分离纯化得抗氧化肽BPO-Ⅱ。     

不同水产原料中抑制流感病毒神经氨酸酶活性多肽的研究

目的选用不同种类的水产原料用胰蛋白酶酶解,制备出具有抑制神经氨酸酶(NA)活性的多肽。方法选用中国毛虾、鲢鱼、鳀鱼、鳕鱼皮4种原料采用胰蛋白酶酶解,通过体外检测抑制NA活性和MDCK细胞感染H1N1病毒实验,得到能够抑制NA活性的多肽,考察了酶的种类、酶解时间、加酶量、料液比对活性的影响。结果与结论筛选出中国毛虾为原料,通过单因素实验确定酶解时间为5.5h,加酶量为2000U/g,料液比为1∶7(质量浓度)是胰蛋白酶酶解中国毛虾的最优条件。测得IC50值为1.32mg/mL。MDCK细胞感染H1N1病毒实验显示,浓度为250ug/mL的中国毛虾多肽的抑制效果较为明显。通过氨基酸分析推测多肽中高含量极性氨基酸能提高NA抑制活性。     

海地瓜蛋白酶解物类蛋白反应修饰及其对ACE活性的影响

目的研究海地瓜酶解物类蛋白反应修饰及其对ACE活性的影响。方法采用复合酶酶解海地瓜体壁蛋白,得到具有降血压活性的酶解物,利用类蛋白反应进行修饰,考察酶的种类、底物浓度、温度、酶添加量对类蛋白反应的影响,得到不同修饰程度的产物,测定其ACE抑制活性。结果与结论经过类蛋白反应修饰后,显著提高了酶解液的ACE抑制活性。体系中游离氨基的减少量呈不规则变化,修饰产物的IC50值也呈不规则下降,其中反应1h和4h的修饰产物IC50值最低,分别是0.62mg.mL-1和0.75mg.mL-1。分析体系中游离氨基酸的组成,发现脯氨酸的结合能显著提高海地瓜体壁蛋白酶解物的ACE抑制活性。     

中国毛虾ACE抑制产物的酶法制备及其降低原发性高血压大鼠血压的效果(英文)

目的利用中国毛虾制备具有ACE抑制活性及抗高血压活性的酶解产物。方法采用体外试验法检测中国毛虾5种常用蛋白酶酶解产物的ACE抑制活性,筛选出一种蛋白酶作为酶法制备中国毛虾ACE抑制产物用酶,并对其作用条件进行正交优化,利用原发性高血压大鼠评估酶解产物的抗高血压效应。结果胃蛋白酶优化后的酶解条件是:pH 2.4,温度41℃,酶解时间3 h,酶/底物比(E/S)3%,底物浓度8%。以该条件制备的酶解产物对ACE的抑制活性为IC500.65 mg/ml,以1.0 g/kg体重的剂量喂食原发性高血压大鼠4 h后收缩压降低3 886 Pa(29mmHg)。结论中国毛虾的胃蛋白酶酶解产物具有较强的ACE抑制活性及抗高血压活性。     

扎那米韦等对流感病毒神经氨酸酶的抑制作用

目的:观察扎那米韦等6种临床抗流行性感冒或抗病毒上呼吸道感染药物对流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase ,NA)的抑制作用.方法:应用荧光测定法进行体外酶活性测定.结果:扎那米韦对我国分离的3株流感病毒粤防72 243、济防90 15、四川2000 38的神经氨酸酶均有抑制作用,其半效抑制浓度(IC50)分别为0.40,0.23,2.57 nmol•L 1.金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林(RBV)、α 干扰素(α IFN)和中药抗病毒口服液对流感病毒神经氨酸酶无抑制作用.结论:扎那米韦对我国流感病毒神经氨酸酶具有抑制活性.     

蜈蚣粉酶解工艺最佳用酶的初步筛选

目的分别利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶对蜈蚣粉进行酶解并选取最佳用酶来制备抗肿瘤多肽。方法利用4种酶对蜈蚣粉进行酶解,采用MTT体外抗肿瘤实验方法,以蛋白质的水解度及酶解提取液对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率为指标,同时以蜈蚣粉的水溶性蛋白质含量为标准,评价4种酶对蜈蚣粉的酶解效果并筛选出最佳用酶。结果胃蛋白酶对蜈蚣粉的水解度为10.44%;胰蛋白酶对蜈蚣粉的水解度为28.29%,在0.125 mg·m L~(-1)及0.25 mg·m L~(-1)的较小浓度下对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率低于对照组,但随浓度的增大抑制率逐渐增大,在0.5~2 mg·m L~(-1)浓度时,胰蛋白酶在4种酶中达到最大抑瘤效果;胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的水解度分别为50.45%、44.16%,当浓度>0.5 mg·m L~(-1)时其对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率高于对照组,在浓度为0.5mg·m L~(-1)时抑制率分别为2.86%、36.37%,且随浓度增大抑制率增大。结论蜈蚣粉酶解工艺最佳用酶为胰蛋白酶,其次是胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶,而胃蛋白酶活性较低可以去除。     

表没食子儿茶素没食子酸酯抗甲型流感病毒的作用研究

目的初步探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗甲型流感病毒的活性及其作用机制。方法采用H5N1假病毒检测体系,观察EGCG对A/Thailand/Kan353/2004H5N1毒株假病毒的抑制作用;采用神经氨酸酶抑制实验进一步分析其作用机制;采用H1N1 FM_1病毒检测体系,根据药物与病毒、细胞的不同作用,通过两种给药方式,评估EGCG对甲型流感病毒FM_1的抑制作用。结果 EGCG能特异性的抑制H5N1假病毒的进入,IC50为145.10μmol.L-1;EGCG对神经氨酸酶具有抑制作用,IC50为417.20μmol.L-1,EGCG对预防和治疗给药方式均有一定的抑制作用,其IC50分别为6.88μmol.L-1和14.83μmol.L-1,治疗指数分别为58.02和26.92。结论 EGCG在体外具有明显的抗甲型流感病毒作用,其作用机制包括抑制病毒的进入和神经氨酸酶活性。     

基于响应曲面设计的抑制流感病毒神经氨酸酶活性的组分中药筛选——以双黄连注射液为例

旨在建立组分中药组方筛选新方法,以期客观评估多组分内在关系及优化配比。以流感病毒神经氨酸酶(NA)活性抑制率为指标,采用Box-Behnken响应曲面设计法,对双黄连注射液(SHL)中主要指标成分进行抑制NA活性筛选,探讨其活性组分间的相互作用关系,并以SHL为参照,预测组合成分的最佳配比。结果表明,原方中绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和黄芩苷有较强的NA活性抑制作用,且绿原酸与隐绿原酸间存在拮抗作用,咖啡酸对其他组分具有协同增效作用;连翘酯苷A、连翘苷等未见明显(或协同)NA活性抑制作用;拟合的模型预测组分最佳配比为绿原酸-隐绿原酸-咖啡酸-黄芩苷(107μg.mL-1∶279μg.mL-1∶7.99μg.mL-1∶92μg.mL-1),经实验验证,其NA活性抑制作用强于SHL(P<0.05)。Box-Behnken响应曲面设计法具有普筛高效、预测准确等优势,适合用于组分中药组方的筛选与优化配比研究,为有效推进现代组分中药的发展提供了技术支持。     

磷酸奥司他韦颗粒的临床应用观察

磷酸奥司他韦是一种前体药物,在体内代谢产生奥司他韦羧酸盐,此盐是选择性的流感病毒神经氨酸酶抑制剂。神经氨酸酶是病毒表面的一种糖蛋白酶,其活性对新形成的病毒颗粒从被感染细胞中释放和感染性病毒在人体进一步播撒至关重要。磷酸奥司他韦的活性代谢产物可抑制甲型和乙型流感病毒的神经氨酸酶活性。在体外对病毒神经氨酸酶活性的半数抑制浓度低至纳克水平。在体外观察到活性代谢产物抑制流感病毒生长,在体内也观察到其抑制流感病毒的复制和致病性［1］。该药通过抑制病毒从被感染的细胞中释放,从而减少了甲型或乙型流感病毒的播散。     

流感病毒神经氨酸酶抑制剂筛选模型的建立和应用

目的建立适用于高通量筛选的流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)抑制剂筛选模型。方法从甲型及乙型流感病毒中制备神经氨酸酶,以2′-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid(MUNANA)作为底物,建立检测神经氨酸酶活性的荧光测定法及其抑制剂体外筛选方法,用高通量筛选系统对1 200个化合物与提取物进行初筛。结果神经氨酸酶酶促反应以pH 3.5,二价阳离子浓度为2～6 mmol·L^-1及37℃孵育时酶活性最佳;甲、乙型流感病毒不同株神经氨酸酶的米氏常数(Km)的范围为(4.89～5.94) μmol·L^-1;初筛发现12个化合物对流感病毒神经氨酸酶有可重复的抑制活性。结论优化了神经氨酸酶反应体系,建立的体外模型可用于抗甲、乙型流感病毒药物的高通量筛选及酶抑制动力学的研究。     

乌梅抗氧化作用的实验考察

目的:研究乌梅提取物抗氧化作用。方法:通过检测还原力和清除DPPH、ABTS和超氧阴离子自由基的能力,分析和评价乌梅提取物的抗氧化活性。结果:乌梅醇提物对DPPH、ABTS自由基的IC50分别为0.500 mg.mL-1及0.253 mg.mL-1;乌梅水提物对DPPH、ABTS自由基的IC50分别0.510 mg.mL-1及0.500 mg.mL-1;乌梅醇提物还原能力大于乌梅水提物,且乌梅醇提物对超氧阴离子自由基的清除作用显著,其清除作用优于乌梅水提物及对照品BHT。结论:乌梅提取物有不同程度的抗氧化活性,其中以醇提物抗氧化作用最强。     

猫须草总黄酮抗氧化活性研究

目的：通过体外抗氧化活性测试评价猫须草醇提取物的抗氧化活性。方法以DPPH、ABTS自由基清除,FRAP还原法及金属螯合能力这三个体系的体外抗氧化活性进行分析。结果猫须草醇提取物对DPPH自由基的清除率（ IC50为13．45μg· mL －1）高于BHT（ IC50为46．78μg· mL －1）,但低于Trolox （IC50为6．08μg· mL －1）,而对于ABTS自由基的清除率（IC50为6．06μg· mL －1）则高于 BHT（IC50为12．49μg· mL －1）和Trolox （IC50为6．45μg· mL －1）;猫须草醇提取物（FRAP为516mmol· L－1）具有较强的还原能力。此外,猫须草醇提取物的金属螯合能力（8．35％）高于柠檬酸（3．86％）,低于EDTA（48．32％）,具有一定的金属螯合能力。结论通过体外抗氧化活性检测,得出猫须草醇提取物具有较强的清除DPPH和ABTS自由基的能力,且随提取物质量浓度增加而增加。     

中药对痤疮致病菌的体外抑菌活性实验研究

目的：研究中药在体外对痤疮致病菌的抑制作用,筛选用于治疗痤疮的中药。方法：制备20种中药提取物,采用平板法37℃培养金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌,通过2倍稀释法定量测定20味中药和6种中药单体成分最低抑菌浓度（MIC）。结果：20种中药提取物中大黄、黄芩、甘草、牡丹皮、金银花5种中药对两种致病菌均有抑菌作用,其中对金黄色葡萄球菌的MIC分别为6.25 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1、12.5 mg·mL-1、12.5 mg·mL-1、12.5 mg·mL-1,对痤疮丙酸杆菌的MIC分别为12.5 mg·mL-1、12.5 mg·mL-1、50 mg·mL-1、50 mg·mL-1、50 mg·mL-1。6种中药单体成分中大黄酸、黄芩苷对两种致病菌抑菌作用最佳,对金黄色葡萄球菌的MIC分别为15.625μg·mL-1、7.812μg·mL-1,对痤疮丙酸杆菌的MIC分别为31.25μg·mL-1、15.625μg·mL-1。结论：大黄、黄芩、甘草、牡丹皮、金银花和单体成分大黄酸、黄芩苷表现出良好的抑菌效果,在进一步的药物筛选中可进行重点考察。     

小叶锦鸡儿中异黄酮及其苷类化合物的体外抗肿瘤活性研究

目的研究小叶锦鸡儿中异黄酮及其苷类化合物的体外抗肿瘤细胞增殖作用。方法利用四唑盐比色法检测,观察小叶锦鸡儿中分离出的3种异黄酮及其苷类化合物:雁靛黄素(Ⅰ)、高丽槐树-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅱ)和芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅲ)对人乳腺癌细胞株、宫颈癌细胞株、人肝癌细胞株生长的影响。结果化合物Ⅰ对人乳腺癌细胞株、宫颈癌细胞株的增殖均有明显的抑制作用,IC50分别为20.2、16.9μg.mL-1;化合物Ⅱ对乳腺癌细胞株、肝癌细胞株均有不同强度的抑制作用,IC50分别为17.9、18.8μg.mL-1;化合物Ⅲ对乳腺癌细胞株的增殖有抑制作用,但不呈现浓度依赖关系,对其他两个细胞株的增殖不显示抑制活性。结论化合物Ⅰ、Ⅱ对两种细胞株有不同程度的抗肿瘤活性,化合物Ⅲ不具抗肿瘤活性。     

花生壳提取物对家兔血小板聚集的影响

目的:研究花生壳提取物体内、外给药对血小板活化因子(PAF)诱导家兔血小板聚集的影响。方法:分别采用体内和体外给药,比浊法测定血小板的聚集率,观察花生壳提取物对PAF诱导的家兔血小板聚集的抑制作用。结果:花生壳提取物在20、10mg·mL-1浓度下体外给药对PAF诱导血小板聚集有明显抑制作用(P<0.05),抑制率分别为47.13%、33.48%;在100mg·kg-1剂量下体内给药对PAF诱导血小板聚集有明显抑制作用(P<0.01),抑制率为21.78%。结论:花生壳提取物对PAF诱导的血小板聚集有抑制作用,其作用机制可能与拮抗PAF受体有关。     

朱砂与石膏体外抗肿瘤作用研究

目的观察朱砂与石膏的体外抗肿瘤作用。方法采用MTT法检测朱砂、石膏对BGC-823胃癌细胞、A549肺腺癌细胞增殖的影响;通过Hoechst 33258荧光染色研究其对BGC-823胃癌细胞凋亡的影响。结果朱砂对BGC-823胃癌细胞生长的半数抑制浓度（IC50）为3.44μg.mL-1,抑制肺腺癌A549细胞的IC50为7.69μg.mL-1;石膏仅在1.5mg.mL-1浓度时对BGC-823胃癌细胞、A549肺腺癌细胞生长有显著的抑制作用。朱砂及石膏作用48h后BGC-823细胞贴壁细胞数量明显减少,细胞中未检测到明显的凋亡小体。结论朱砂体外有明显的抗肿瘤作用。     

罗汉果叶不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除作用研究

目的:研究罗汉果叶不同溶剂提取物清除二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基的作用。方法:采用系统溶剂法将罗汉果叶的乙醇萃取物分成石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4种溶剂提取物,采用DPPH自由基体系法测定其抗氧化活性,并与没食子酸、抗坏血酸进行比较。结果:罗汉果叶的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4溶剂提取物对DPPH的半数抑制浓度分别为16.250、0.554、0.596、0.267 mg(生药).mL-1。结论:罗汉果叶不同溶剂提取物均有抗氧化活性,其水提取物的抗氧化能力最强。     

In vitro evaluation of neuraminidase inhibitors using the neuraminidase-dependent release assay of hemagglutinin-pseudotyped viruses

For the treatment of influenza virus infections, neuraminidase inhibitors (NAIs) that prevent the release of virus particles have been effective against most influenza strains. Several neuraminidase (NA) assays are available for the evaluation of NAIs. To understand the NAI functions under physiological conditions, assays mimicking viral particle release should be useful. We have constructed retrovirus-based reporter viruses that are pseudotyped with hemagglutinin (HA) glycoprotein by transfection of producer cells using plasmids expressing retroviral gag-pol, influenza HA, NA, and firefly luciferase genes. Similarly to the life cycle of influenza viruses, the release of pseudotype viruses also requires neuraminidase functions. This requirement was used to develop an assay to evaluate NAI activities by measuring inhibition of pseudotype virus production at different NAI concentrations. The pseudotype virus release assay was used to determine the IC(50) values of Oseltamivir carboxylate, Zanamivir, and the novel phosphonate congeners of Oseltamivir against N1 group neuraminidases and their H274Y Oseltamivir carboxylate-resistant mutants. The deduced IC(50) values obtained using the release assay correlated with those determined using the fluorogenic substrate 2'-(4-methylumbelliferyl)-alpha-d-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) and also correlated with the infectivity results.     

Extraction and separation of total flavonoids from Flos Puerariae and its antioxidant activity

Objective To study the optimum extraction and separation process of total flavonoids in the flowers of Flos Puerariae and its antioxidative activity.Methods The total flavonoids were extracted with assistance of ultrasonic wave and the content was determined at 265 nm wavelength by Spectrophotometric method.Orthogonal experiment L9(34)was carried out to investigate the effects of concentration of solvent,the ratio of material to liquid,time length of extraction,and frequency of extraction on extraction results of total flavonoids from Flos Puerariae.The extracted solution was purified by petroleum ether and ethanol sequently.Under these conditions,the total flavonoids was eluted gradiently with mixed mobile phase of methanol-chloroform solution in the silica gel column system,and then determined by UV scanning and HPLC.Fenton reaction was used to produce and detect hydroxyl radicals(·OH),and pyrogallol system was used to produce and detect the superoxide radical anion(O2-·).Results The optimum conditions were as follows;using 40%(V/V)methanol as extractor with the ratio of material to liquid at 1∶30,and extracting for 2.5 h a time for 3 times.The extraction yield of total flavonoids was 13.6%.Six isoflavone compounds were isolated from the flowers of Flos Puerariae by the method of silica gel column chromatography.Antioxidative test results showed good performance of flavonoid scavenging capacity in both hydroxyl radical system and superoxide radical system and its IC50 was 7.65 μg·mL-1 and 0.18 mg·mL-1,respectively.Conclusions This study provided scientific basis for further development and utilization of Flos Puerariae and make preparation for later pharmacological research.     

8株海洋真菌的抗氧化和抗肿瘤活性筛选

目的通过抗氧化和抗肿瘤活性双生物活性筛选模型评估来源于东海海洋的8株海洋真菌提取物的生物活性。方法对8株海洋真菌菌体甲醇提取物和发酵液乙酸乙酯提取物进行体外抗氧化活性(DPPH法)和抗肿瘤(MTT法)双生物活性模型筛选研究。结果菌株251#,28#,111#的发酵液提取物在剂量为2mg.mL-1时,对DPPH的清除率大于90%;当剂量为50μg.mL-1时,菌株28#,111#,21#发酵液提取物对HeLa和H460肿瘤细胞的抑制率均大于50%。结论菌株28#,111#发酵液提取物在体外具有较强的清除自由基的能力,对HeLa和H460肿瘤细胞具有较高的细胞毒性。提示菌株28#,111#的活性代谢产物可能来源于菌株生长过程中产生的胞外物。同时,表明海洋真菌是潜在的活性代谢产物的重要来源。