表达金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控溶瘤腺病毒载体的构建、鉴定及其抗膀胱肿瘤作用

目的 构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA及对照组携带超抗原SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA,并探讨其潜在的抗膀胱肿瘤作用.方法 将超抗原SEA基因片段经SpeⅠ和SalⅠ双酶切后,克隆入经同样酶切后的非增殖溶瘤腺病毒载体pSG218中,将鉴定正确的腺病毒载体命名为pDC318-SEA.同样方法将超抗原SEA基因片段克隆入双调控特异性增殖溶瘤腺病毒载体pSG502中,将鉴定正确的腺病毒载体命名为pSG502-SEA.将以上两种携带SEA基因的病毒载体与病毒骨架质粒PPE3-ccdB共转染293细胞,9～14 d出现病毒空斑,经过3次病毒空斑纯化,提取腺病毒DNA,应用PCR进行鉴定,经鉴定正确的腺病毒分别命名为DC318-SEA和SG502-SEA.大量扩增后,氯化铯梯度离心纯化腺病毒,测病毒滴度.结果 经PCR及酶切鉴定,SEA基因成功克隆到两病毒载体中,可以表达SEA基因,且病毒滴度为2.5 × 1010pfu/ml.结论 成功构建表达超抗原SEA基因的双调控、高靶向选择增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA及对照组携带超抗原SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA.     

携带超抗原SEA基因的特异性溶瘤腺病毒载体的构建和鉴定

目的 构建携带超抗原SEA基因的肿瘤特异性溶瘤腺病毒表达载体.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得SEA全长基因序列,酶切后克隆入pCA13质粒,构建重组病毒质粒pCA13-SEA.将鉴定正确的pCA13-SEA与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-SEA.Ad-SEA在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度.结果 克隆得到771bpSEA全长基因.经PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,SEA基因成功克隆到溶瘤腺病毒载体中,可实现SEA基因的表达,且病毒滴度达6.5×109pfu/ml.结论 成功构建表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体.     

靶向前列腺癌并携带SATB1基因shRNA溶瘤腺病毒的构建

目的:构建DD3启动子调控并携带SATB1基因shRNA溶瘤腺病毒,研究其对前列腺癌的特异抗肿瘤作用。方法:以pSilencer3.1-SATB1为模板,通过PCR扩增出SATB1-shRNA表达框并克隆至pZD55载体,构建重组质粒pZD55-SATB1-shRNA。EcoRⅤ和XbaⅠ分别酶切pZD55-SATB1-shRNA和pZXC2-DD3-E1A,将目的片段连接重组,获得质粒pDD3-ZD55-SATB1,将其与腺病毒包装质粒pBHGE3共转染293细胞。PCR鉴定正确者即为溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SATB1。扩增,纯化,测病毒滴度。结晶紫染色观察对前列腺癌细胞毒性;Western印迹检测E1A在列腺癌细胞中的表达;RT-PCR和Western印迹检测列腺癌细胞中SATB1基因沉默效果。结果:成功构建DD3启动子调控同时携带SATB1-shRNA的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SATB1,初步证实DD3-ZD55-SATB1复制具有高度的前列腺癌靶向性和特异的SATB1基因沉默效果。结论:成功构建的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SATB1为进一步体内外研究其对前列腺癌的治疗作用奠定基础。     

肾癌G250启动子及肿瘤细胞p53突变双重调控的表达Ki67-siRNA的增殖腺病毒的构建

目的 构建一种受肾癌G250启动子及肿瘤细胞p53突变双重调控的表达Ki67基因小干扰RNA(Ki67-E1B 55kDsiRNA)的新型增殖腺病毒.方法 将含有H1启动子的Ki67-siRNA表达框插入E1B 55kD缺失增殖腺病毒载体pZD55中,构建pZD55-Ki67质粒.用G250启动子取代pZD55-Ki67的E1A启动子,构建双调控增殖腺病毒载体pZD-G250-Ki67.将pZD-G250-Ki67与腺病毒右臂质粒pBHGE3共转染293细胞,9～12 d后出现病毒空斑.提取重组腺病毒的DNA、聚合酶链反应(PCR)鉴定正确者即为条件增殖腺病毒ZD-G250-Ki67.鉴定、扩增、纯化、测病毒滴度.结果 成功构建G250启动子调控E1B 55kD蛋白编码基因缺失的表达Ki67-siRNA的双调控增殖型腺病毒ZD-G250-Ki67.病毒滴度为2×10~(11)PFU/ml.结论 成功构建的ZD-G250-Ki67为利用Ki67-siRNA靶向肾癌治疗奠定基础.     

PDEF及其与前列腺特异性抗原表达的关系

前列腺特异性抗原(PSA prostate specific antigen)是由前列腺上皮分泌产生的一种丝氨酸蛋白酶,目前已广泛应用于临床,作为前列腺癌临床筛查诊断的一个重要指标,具备高度的组织特异性,多种因素在不同阶段发挥着对PSA的调控作用。PDEF是E ts家族成员之一,它通过多种途径对PSA的表达进行调控,特别是在雄激素非依赖性前列腺癌的PSA表达中,通过PSA启动子及雄激素受体(AR androgen receptor)发挥其对PSA表达的正向调控作用。本文就PDEF结构及其与PSA表达关系及相关研究进展做作一综述。     

hTERT启动子调控的腺病毒载体的构建及在前列腺癌细胞中的表达

目的　构建人端粒酶逆转录酶 (hTERT )启动子调控的表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒系统 ,并研究其在前列腺癌细胞株PC 3中的表达。方法　构建带有hTERT启动子的腺病毒穿梭载体pDC3 15 Tp EGFP ,细胞重组技术获得腺病毒AdhTERT EGFP ,体外转染PC 3及人胚肺成纤维细胞株MRC 5 ,通过RT PCR和倒置荧光显微镜分别在mRNA和蛋白质水平检测EGFP的表达。带有小鼠巨细胞病毒 (mCMV)启动子的腺病毒Ad EGFP作为阳性对照。结果　成功构建出腺病毒AdhTERT EGFP ,滴度为 4.2× 10 9空斑形成单位 (pfu) /ml,分别转染PC 3和MRC 5 ,前者表达EGFP的阳性细胞数为 (66.4% 3 .3 ) % ,而后者不表达EGFP(P <0 .0 1) ;对照病毒Ad EGFP在PC 3和MRC 5中分别有 (88.1± 2 .2 ) %及 (89.2± 3 .1) %的细胞表达EGFP ,两者表达量差异无统计学意义。结论　该腺病毒系统中hTERT启动子调控下游基因可选择性地在前列腺肿瘤细胞中表达 ,在正常细胞中不表达 ,具有明显的靶向性。     

双靶向溶瘤腺病毒携带内皮抑素基因对肝癌的抑制作用

目的 构建双调控溶瘤腺病毒,携带小鼠内皮抑素基因(mE),研究其对裸鼠肝癌移植瘤的抗瘤活性.方法 以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)和缺氧调控元件序列(HRE)调控腺病毒E1a和E1b基因,基因组插入mE基因,构建双调控溶瘤腺病毒CNHK500-mE;在裸鼠模型中观察CNHK500-mE对肝癌移植瘤模型的疗效.结果 CNHK500能够在hTERT阳性的肝癌细胞中增殖[24 h:(16.67±4.04)％;48 h:(65.33 ±7.02)％;P＜0.01],并介导mE高效表达;与空白对照组( 1895.80±323.37) mm3比较,CNHK500-mE和Ad-mE的抑瘤率分别为50.95％[(929.80±211.10) mm3,P＜0.01]和29.99％[(1327.23 ±319.36) mm3,p＜0.05];CNHK500-mE对癌组织间质血管的抑制作用明显强于Ad -mE(P ＜0.05).结论 将mE与溶瘤腺病毒结合,发挥病毒增殖的溶瘤作用和基因产物的血管抑制作用,表现出明显的协同抗瘤作用.     

前列腺特异性抗原启动子中雄激素反应元件的克隆和表达

目的:利用前列腺特异性抗原(PSA)启动子的组织特异性表达的特点,克隆出DNA片段并对其表达效率和组织特异性表达进行初步研究。方法:从前列腺组织中提取染色体组,PCR扩增出PSA启动子的两个上游片段a(含ARⅠ和ARⅡ)和b(含ARⅢ),利用报告基因egfp,分别构建3个载体pa-EGFP、pba-EGFP和p△ba-EGFP,并转染细胞HepG2、SMMC-7721、Hela和PC-3,观察表达情况。结果:pba-EGFP在前列腺癌细胞PC-3中的绿色荧光强度明显高于pa-EGFP和p△ba-EGFP,说明片段b(含ARⅢ)能显著增强PSA启动子的转录能力。pa-EGFP、p△ba-EGFP和pba-EGFP转染HepG2、SMMC-7721和Hela细胞,未见表达。结论:基于PSA启动子的组织特异性和调节序列构建的靶向载体,在治疗中加上功能蛋白将为临床实验提供一个坚实的平台。     

前列腺特异性膜抗原和前列腺特异性抗原在前列腺癌组织中的表达

目的：观察并比较前列腺特异性膜抗原（PSMA）和前列腺特异性抗原（PSA）在不同前列腺为组织中的表达差异；比较组织PSMA与PSA对前列腺癌诊断和鉴别诊断的意义。方法：采用ABC三步法免疫组织化学染色方法，用PSMA和PSA单克隆抗体对70例前列腺癌（PCA）、21例前列腺上皮内瘤（PIN）、20例前列腺良性增生（BPH）组织进行染色。结果：PSMA在前列腺癌组织中明显高表达，PSA则在前列腺良性增生组织中高表达；组织PSMA对前列腺癌的阳性检出率明显高于PSA。结论：PSMA是较PSA更具特异性的前列腺癌瘤标，可望取代PSA成为诊断前列腺癌的新型瘤标，并在前列腺癌免疫治疗方面具有良好的应用前景。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定

目的探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性，了解增强子增强转录效率的能力。方法采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA启动子和增强子序列，先后克隆到含有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒载体，脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在不同细胞的表达情况。结果成功构建质粒pEGFP—PS—MAPro和pEGFP-PSMAEP，转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的有效表达，且pEGFP—PSMAEP的调控转录能力较pEGFP—PSMAPro强20倍。结论PSMA启动子增强子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性，增强子能够明显增强启动子的转录效率，增加了目的基因的表达水平。PSMA启动子和增强子的共调控可以保证基因表达的强度和细胞特异性，为前列腺癌基因靶向性治疗研究提供实验依据。     

新型增殖性腺病毒的构建及对肝癌细胞的抑制

目的 构建携带p53基因新型增殖性腺病毒CNHK600-p53,研究其对肝癌细胞株抑制效应是否优于Ad-p53.方法 PCR扩增p53基因,利用酶切连接方法 将其插入CNHK600载体,PCR鉴定.经293细胞包装成病毒,抽提病毒DNA,PCR鉴定.氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,TCID50 方法 测病毒滴度.病毒增殖实验检测病毒在不同细胞增殖能力.四甲基偶氮唑盐(methyl-thiazolyl tetrazolium assay,MTT)法观察CNHK600-p53、Ad-p53两种病毒分别对肝癌细胞株的抑制率.结果 成功构建新型增殖性腺病毒载体CNHK600-p53;293细胞包装成病毒,PCR方法 鉴定无野生型病毒存在;病毒滴度为1.99×10~（10）pfu/ml;CNHK600-p53在肝癌细胞HepG2、SMMC-7721内复制能力明显高于正常肝细胞HEL-1和L02.对6种肝癌细胞(PLC/PRF5、SMMC7721、HepaG2、BEL-7402、BEL-7404、QGY-7703)而言,随着MOI值的不断增高.其对肝癌细胞的抑制作用也不断增强;在相同MOI情况下,CNHK600-p53组较Ad-p53组的细胞抑制率高(P＜0.05).当细胞抑制率达到80%以上时.两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用新型增殖性腺病毒CNHK600一p53较 Ad-p53能更有效的抑制肝癌细胞,可能成为肝癌的基因治疗更有效的一种基因治疗手段.     

荷载β-actin、GAPDH基因小干扰RNA的双调控增殖腺病毒的构建

目的 构建hTERT启动子调控的表达β-actin、GAPDH基因小干扰RNA(siRNA)的条件增殖腺病毒.方法 分别将β-actin-siRNA、GAPDH-siRNA的模板DNA克隆至质粒pGPH1/GFP/Neo,构建pGPHI/GFP/Neo-β-actin、pGPH1/GFP/Neo-GAPDH.以pGPH1/GFP/Neo-β-actin为模板,PCR扩增出β-actin-siRNA表达框并克隆进质粒pZHTERT,获得pZHTERT-β-actin;以pGPH1/GFP/Neo-GAPDH为模板,扩增出GAPDH表达框并克隆进质粒pZD55,获得pZD55-GAPDH.将pZHTERT-β-actin、pZD55-GAPDH重组,构建穿梭质粒pTD-GAPDH-β-actin,并与腺病毒右臂质粒pBHGE3共转染293细胞,9～12 d后出现病毒空斑,提取重组腺病毒的DNA、聚合酶链反应(PCR)鉴定正确者即为双调控增殖腺病毒TD-GAPDH-β-actin.扩增、纯化、测病毒滴度.结果 成功构建hTERT启动子调控的表达GAPDH、β-actin小干扰RNA的条件增殖腺病毒.病毒滴度为2×10~(11)PFU/ml.结论 成功构建了TD-GAPDH-β-actin,为研究双基因小干扰RNA靶向治疗肿瘤奠定了基础.     

负载PCA3启动子及CD-TK自杀基因腺病毒载体的构建及包装

目的 构建负载PCA3启动子联合CD-TK基因的腺病毒载体,并对其进行包装及滴度测定.方法 将PCA3启动子无缝克隆到pHBAd-U6-GFP上,取代原有U6启动子形成pHBAd-PCA3-GFP,AgeI单酶切该重组载体,将CD-TK基因片段无缝克隆至线性化pH-BAd-PCA3-GFP上,抽提质粒抗性筛选后经PCR及测序鉴定为pHBAd-PCA3-CD-TK载体.取上述重组载体质粒及骨架质粒pHBAd-BHG,用LipofiterTM转染试剂进行转染HEK293细胞包装成病毒,大量扩增并测定病毒感染性滴度.结果 经PCR及测序验证证实成功构建负载PCA3启动子及CD-TK自杀基因的重组腺病毒pHBAd-PCA3-CD-TK并包装扩增,病毒滴度为1×1010PFU/mL.结论 构建负载PCA3启动子及CD-TK自杀基因的重组腺病毒,为进一步体内外对前列腺癌细胞的杀伤效应研究奠定了基础.     

NICD基因转染对胰腺腺泡细胞凋亡的影响

目的 观察重组腺病毒介导的NICD基因对胰腺腺泡细胞凋亡的影响.方法 在293细胞中培养扩增重组腺病毒Ad-NICD,当细胞汇合度达到60％～70％时,用蚀斑形成实验测定其感染滴度;将该病毒感染胰腺腺泡细胞AR4-2J (48 h)通过实时定量聚合酶链反应(PCR)检测其表达.同时分对照组(未转染组)、Ad-CMV转染组、Ad-NICD转染组分别用Ad-CMV( MOI:100)和Ad-NICD( MOI:100)转染AR4-2J细胞,采用Annexin V/PI双标流式细胞术检测Ad-NICD对细胞凋亡的影响.结果 重组腺病毒Ad-NICD滴度为2.2×1010 pfu/L,病毒颗粒感染腺泡细胞可以有效地提高NICD的表达,在MOI为100时,NICD的表达量最高.Ad-NICD感染胰腺腺泡细胞后,雨蛙素诱导的细胞凋亡率为(7.32±1.67)％,与对照组(18.55±2.61)％及Ad-CMV转染组(19.76±4.28)％比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组腺病毒介导的NICD基因转染可以显著抑制雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞凋亡,这种抑制可能与急性胰腺炎的严重程度有关.     

携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带小鼠白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体,研究肝脏Hepa l石细胞的IDO基因mRNA及蛋白表达情况.方法 酶切含有小鼠全长IDO cDNA的IDO质粒,亚克隆至穿梭载体pAdTrack.ALB上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,生成并筛选阳性克隆,测序、鉴定正确后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,检测病毒滴度,RT-PCR和荧光显微镜鉴定重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达.重组腺病毒进一步感染Hepa 1-6细胞,RT-PCR和WesternBlot法分别检测IDO基因在细胞内表达情况.结果 经酶切及测序证实携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,病毒感染滴度为2.9×10~6pfu/ml.感染Hepa 1-6细胞后,RT-PCR和Western Blot可以检测到IDO mRNA水平和蛋白水平表达.结论 构建了携带白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体.     

人磷酸二脂酶基因反义RNA重组腺病毒载体的构建

目的探讨人磷酸二脂酶5(PDE5)基因反义RNA重组腺病毒载体的构建方法。方法根据基因库确定具有完整PDE5A1启动子活性的cDNA基因序列,并设计反义链,两'端加内切酶修饰;通过转载体克隆方法构建转入载体(pENTR)并测序;借助Gateway腺病毒表达载体系统进行重组反应构建重组腺病毒表达载体pAd/CMV/V5/antisense PDE5A1;PacⅠ酶切后转染293A细胞系进行包装、扩增;病毒质粒酶切后电泳鉴定及PCR检测;CsCl梯度离心法纯化病毒,病毒空斑实验进行滴度测定。结果pENTR载体测序证实目的基因序列及插入方向正确;pAd/CMV/V5/antisense PDE5A1酶切后电泳鉴定,可见145bp的片段;PCR检测证明实验设计的目的反义基因成功插入腺病毒载体中;重组腺病毒滴度达108～1010/μl。结论借助Gateway腺病毒表达载体系统可成功地将人工合成的反义基因装入到腺病毒载体中;纯化病毒液量和滴度符合体内基因转染实验的要求。