多重PCR方法检测食品中转基因成分

根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子（CaMV35S）和根癌农杆菌终止子（NOS）的序列，设计合成了两对不同的引种和相对应的两种荧光双链探针（FDCP），分别建立了多重PCR，应用FDCP的实时荧光PCR同时检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法，并利用该套方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测，发现13份样品有6份检出35S启动子、NOS终止子，其余7份样品的检测结果为阴性，表明作者建立的多重PCR方法能有效检测出35S和NOS成分，其中多重PCR法具有灵敏度高、特异性好的特点，多重荧光PCR法则更为简便、快速、准确。     

圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的28SrRNA和18SrRNA条带。根据PG37所产碱性脂肪酶（Lip PC）N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在3'端具有poly(A）等所提供的生物信息，采用RT－PCR技术扩增了Lip PC成熟肽和3'非编码区的cDNA片段，并将该PCR产物直接克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明，Lip PC含有258个氨基酸残基，其中保守的五肽序列为Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用ClonTech公司的Smart^TM PCR cDNA文库构建试剂盒，扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段，从而完成了Lip PC完整cDNA的分析测定。最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中，SDSPAGE检测结果表明，大肠杆菌BL21所表达的GST－Lip PC融合蛋白质分子质量约为53ku。     

应用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测副溶血性弧菌

以副溶血性弧菌的tlh基因为目的片段设计特异性引物,成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的检测法,进行了特异性和灵敏度实验,并与普通PCR方法进行了比较。该HDA检测方法最低检测限为19.9ng·mL-1,与普通PCR方法相当。副溶血性弧菌的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。     

人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析

为了获得一种具有生物学活性的小分子多肽基因人α-防御素HNP-1，提取人外周静脉血液总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用PCR的方法扩增得到长度约为380bp的防御素(Defensin)基因片段，并将该扩增产物连接入pMD18-T载体，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，对PCR鉴定含有目的片段的克隆进行核苷酸序列测定，获得α-防御素HNP-1基因克隆。用序列处理在线工具包分析HNP-1基因结构。     

牛γ-干扰素基因在大肠杆菌中的克隆

根据牛γ干扰素(bovIFN γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)技术,从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段,将RT PCR产物克隆到pMD18 T载体中,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovIFN γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体pGEX 4T 1中,将pGEX 4T 1/bovIFN γ转化到大肠杆菌中DH5α中。     

用组合引物PCR法简便快速筛选阳性正向克隆

PCR扩增的小片段DNA用T载体连接.转化受体菌后观察不到典型的蓝/白斑.用插入片段的特异性引物对菌落进行PCR来筛选阳性正向重组于,测序鉴定结果吻合率达100%,说明当利用颜色特性挑选阳性克隆成为困难时,菌落PCR技术是一种简单、快速、可靠的筛选方法.     

牛γ-干扰素基因在大肠杆菌中的克隆

根据牛γ-干扰素(bouIFN-γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段，将RT—PCR产物克隆到pMD18-T载体中，经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovIFN-γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中，将pGEX-4T-1／bouIFN-γ转化到大肠杆菌中DH5a中。     

马铃薯X病毒CP基因的原核表达及特异性抗血清的制备

依据马铃薯x病毒(Pottato virus X，PVX)外壳蛋白(CP)基因序列(711bP)设计合成了两对引物，通过RT—PCR扩增得到长0．7bp的目的片段．将目的片段转入大肠杆菌，酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子，测定序列结果与其他PVx分离物CP基因序列比较，发现其核苷酸同源性最高可达99％左右，证明此病毒为PVX．构建了含PVx CP基因的融合蛋白原核表达载体，并在大肠杆菌中得到表达，SDS—PAGE测定该融合蛋白GST—xCP的相对分子质量为52000．Westem blot分析结果显示，GST—XCP与PVX抗血清有很强的免疫反应，表明GST—XCP有天然状态下病毒核衣壳蛋白的抗原性、制备了GST—xCP抗血清，并利用此抗血清建立了PVx的间接ELISA检测方法，检测灵敏度为1mg鲜重的病株叶片．     

抗菌肽基因在E．Coli JM109中的克隆表达

合成5条50～70bp的DNA片段，用“片段拼凑”的方法通过三步PCR扩增得到目的基因，天蚕素基因被克隆到PUC19载体上，再转化大肠杆菌JM109，电泳分析重组质粒，确定天蚕素基因已转化到JM10g上，摇床发酵转化子，IPTG诱导表达目的肽，最后提纯表达产物，SDS-PAGE电泳分析表明有特异性带出现，荧光色谱分析表明表达肽与目的肽组成一致，最后确定天蚕素在JM109中得到表达，抑菌圈活性实验表明，表达肽具有一定抗菌活性。     

多重PCR法检测食品中大肠杆菌O157

以大肠杆菌O157的stx1、stx2、wzy基因为靶基因,建立了一种新的多重PCR检测方法。PCR扩增结果与各参考菌株基因型一致。PCR结果表明,wzy基因特异性强,可作为检测O157菌株的标志基因,且为开发大肠杆菌O157的分子检测技术提供新的研究思路。     

盐生卤虫BADH基因的克隆及序列分析

实验以盐生动物卤虫（Artemia）为材料,采用酚-氯仿法提取总DNA,以已报道的BADH基因的保守序列设计引物,通过PCR技术,从卤虫的基因组DNA中分离得到了1个BADH基因片段,经测序,得到一段868 bp的核苷酸序列,输入Gen-Bank进行BLAST同源性比较,发现所得片段与植物中的籽粒苋的BADH4基因中的一段序列有96%的同源性,此项研究为更深入地研究抗盐动物的BADH基因奠定了良好的基础.     

西施舌16S rRNA基因片段PCR扩增及其核苷酸序列分析

利用酚/氯仿抽提法提取了西施舌闭壳肌总DNA,以总DNA为模板,利用两条16S rRNA基因特异引物,进行PCR扩增,扩增产物测序后进行序列分析。结果从西施舌的闭壳肌提取得到总DNA,获得一个长度约300 bp的PCR扩增产物;测序结果显示此片段为294 bp;核苷酸序列经WU-blast2分析,与Spisula subtruncata(AJ548774)和Corbicula sp(AY097259)的16S rRNA的同源性均为74%。经DNAStar分析,此核苷酸序列A,G,T,C含量分别为35.74%,25.51%,26.19%和13.59%,A T(61.90%)含量明显高于G C(38.10%)含量。     

长白山湿地细菌群落结构分析及优势菌株鉴定

对长白山北坡和西坡不同湿地的土壤细菌的群落结构及优势菌株进行了总体研究.采用PCR-DGGE分子生物学技术,对湿地土壤样品中总DNA的16S rDNA的V3区进行PCR扩增,通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)对扩增产物进行分离.回收了26个清晰的条带,对其中19个特征性条带进行了测序,除了条带12、13、16为可培养的微生物外,其他16个条带都是不可培养微生物.通过传统培养法,利用MIDI微生物鉴定系统,对8种可培养的最优势菌株进行了分析,各菌种分别为Bacillus sp., Bacillus licheniformis, Virgibacillus pantothenticus, Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Paenibacillus alginolyticus, 优势菌株间的相似性水平较低.     

利用线粒体DNA上的cytB鉴定林蛙及林蛙油

目的：以线粒体DNA上cytB为研究对象,采用聚合酶链式反应(PCR)手段,建立林蛙及林蛙油鉴定方法。方法：采用市售成年雌蛙的新鲜组织和林蛙油为实验材料,通过试剂盒提取总DNA;以已报道的东北林蛙、中国林蛙、黑斑蛙和蟾蜍的cytB为模板,设计四对引物;PCR扩增产物回收测序。结果：仅东北林蛙引物的PCR体系获得1100 bp左右大小的产物,产物序列与东北林蛙cytB序列一致性为99%,说明实验对象林蛙为东北林蛙,林蛙油来源为东北林蛙。讨论：利用mtDNA独特的优势,应用PCR扩增cytB,并测序确定了林蛙品种,建立了林蛙种属以及林蛙油基源的鉴定方法,为林蛙油类药材的鉴定提供科学理论依据。     

纳米材料对DNA热变性行为的影响

在基因操作过程中经常需要对脱氧核糖核酸（DNA）进行高温处理,如在聚合酶链式反应PCR操作中就需要对模板DNA进行升降温的操作,因此,DNA的热变性行为是关系到一些基因操作效率高低的关键．琼脂糖凝胶电泳实验显示,1972bp的短链入DNA高温处理后在1000bp左右处出现额外一条下带,而且此条带经过37℃处理数小时即可恢复到1972bp,不像48000bp长链）LDNA那样在高温处理后出现弥散现象．另外,显著添加不同的纳米材料对下带出现的温度有明显的影响,意味着添加适量纳米材料可以改变DNA分子结构对温度的敏感性．所发现的下带可能具有尚未报道过的特殊结构．     

人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析

为了获得一种具有生物学活性的小分子多肽基因人α 防御素HNP 1,提取人外周静脉血液总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到长度约为380bp的防御素(De fensin)基因片段,并将该扩增产物连接入pMD18 T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,对PCR鉴定含有目的片段的克隆进行核苷酸序列测定,获得α 防御素HNP 1基因克隆。用序列处理在线工具包分析HNP 1基因结构。     

超声波破碎法提取活性污泥DNA及其DGGE分析

为快速提取活性污泥中的微生物DNA,进一步应用于变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析其群落结构,采用细胞超声波破碎法直接提取反应器活性污泥DNA,以16S rRNA V3区域通用引物进行PCR扩增,随后利用DGGE技术对扩增产物的多样性进行评估.结果表明,超声波破碎法可以快速地提取活性污泥DNA,用超声波破碎法提取到的活性污泥克服了PCR扩增困难的问题.在一定的超声波功率下,超声时间对DNA产率、PCR扩增效率和DGGE分析均有很大影响,实验的最佳超声时间为27 s.DGGE分析表明,用该法提取到的DNA种类较为丰富,多样性较好,种群强度最高能达到0.7 OD,能够进一步应用于群落结构分析.     

PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交检测鳗弧菌

以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)toxR基因内366~571 bp之间的基因序列为靶序列,采用PCR法制备对鳗弧菌特异性的地高辛标记DNA探针,探针长度为206 bp。选取2株鳗弧菌和8株与鳗弧菌亲缘关系非常接近的常见水产动物致病弧菌,通过斑点杂交法对制备的探针进行特异性检测,结果显示该探针对鳗弧菌杂交阳性,而与弧菌属的其它8株细菌均无交叉反应。这表明该地高辛标记探针具有很强的特异性,它能够很好地对鳗弧菌感染进行检测。     

酒精和冷冻处理对肌肉组织基因组DNA提取的影响

提取基因组DNA的质量对于后续的基因扩增、酶切以及测序等分子生物学研究具有关键的影响,对肌肉组织进行不同的酒精和冷冻处理会显著影响提取DNA的质量。经过-80℃超低温冷冻数日的黄鳝样品解冻,取肌肉组织放入75%酒精处理后提取的基因组DNA完整性差、降解厉害;经过-80℃超低温冷冻数日的黄鳝样品直接取肌肉组织提取的基因组DNA比较完整、降解程度低;活体采取的黄鳝新鲜肌肉组织样品经过75%酒精处理,在-80℃超低温冷冻数日然后提取的基因组DNA质量也较好,电泳条带明晰而锐利,弥散降解带较少。后两种处理方法对黄鳝肌肉组织中DNA酶活性降低显著,因此提取的肌肉组织基因组DNA质量较高,可以有力支持后续的酶切、PCR扩增等分子生物学实验。