IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达

研究异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达的效果。在利用IPTG和乳糖分别作为诱导剂对右旋糖酐蔗糖酶工程菌Escherichia coliBL21（DE3）/pET28-dexYG进行诱导表达的基础上,尝试将此两种诱导剂联合使用,在降低成本的同时获得较好的表达效果。在获得最佳培养基的基础上,考察菌体IPTG与乳糖的联合加入量、菌体浓度、诱导时间对右旋糖酐蔗糖酶表达的影响。在菌浓（OD600 nm）达到3.0时,加入0.1 mmol/L IPTG 95 μL＋2.5 g/L乳糖,25 ℃混合诱导培养4 h,酶活力最高,达到40.44 U/mL。IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达可行。     

产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件的优化

在摇瓶中对产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件进行了优化,优化培养基为甘油10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,KH2PO4 2 g/L,K2HPO4 4 g/L,Na2HPO4·12H2O 7 g/L,(NH4)2SO4 1.2 g/L,NH4Cl 0.2 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L;优化的诱导条件为:对数生长中期诱导,IPTG浓度为0.3 mmol/L.在优化的培养基和优化的诱导条件下,单位菌体产酶量达745.86 U/g,菌体产酶水平达1 625.97 U/L,为优化前的700 U/L的2.3倍.     

嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化

为了在3L发酵罐水平上提高重组菌E.coli BL 21(DE3)/pET20b(+)-BapulA的普鲁兰酶的表达量和胞外分泌,将嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶(Bacillus acidopullulyticus)在大肠杆菌中进行重组表达,并在3L发酵罐水平上对重组菌进行发酵优化,考察了发酵条件对重组酶表达的影响。重组菌发酵的最佳条件为:发酵前期菌体生长温度和pH分别为30℃和7.0,当菌体浓度OD_(600)达到50时,发酵温度降低至25℃,此时调节pH为6.2,同时开始流加乳糖[0.4g/(L·h)]进行诱导;在发酵过程中,当菌体浓度OD_(600)依次达到15,45,75时,分别加入浓度为1.5g/L的甘氨酸,当菌体OD600为105时,再加入浓度为3g/L的甘氨酸。发酵结束后普鲁兰酶的胞外酶活达659.0U/mL,最高总酶活达1 910.1U/mL,与摇瓶的初始总酶活(41.1U/mL)和胞外酶活(6.5U/mL)相比,分别提高了45.4倍和100倍。     

乳糖诱导重组大肠杆菌表达胆固醇氧化酶的研究

采用乳糖诱导胆固醇氧化酶(COD)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,研究了培养基成分、乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对胆固醇氧化酶表达的影响。结果显示,在对诱导条件进行优化控制的前提下,胆固醇氧化酶酶活达到15.2 U/mL。研究结果为乳糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。     

产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母高密度发酵及产物的分离纯化研究

以实验室构建的产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母基因工程菌作为出发菌株,在摇瓶培养的基础上,建立了100 L发酵罐中高密度发酵工艺及产物分离纯化方法。研究了不同培养基、菌体密度、诱导物及其添加方式等对产物的影响。结果表明,用BSM培养基发酵培养至菌体密度达到190 g/L时开始添加乳糖诱导,乳糖添加量为5 kg,补料流加速度为1 L/h,诱导25 h,菌体细胞湿重达280 g/L,发酵液中蛋白产量达27.8 mg/L,抗菌肽PSI效价达到2.36×109U/L。采用多种分离纯化方法对发酵液中抗菌肽PSI进行分离纯化,结果表明,阴离子交换色谱纯化效率最高,纯化后蛋白效价为8.83×109U/L,其次为丙酮沉淀、超滤、硫酸铵分级沉淀,纯化后蛋白效价依次为6.35×109、4.56×109、3.28×109U/L。     

乳糖诱导大肠杆菌产褐藻胶裂解酶的条件优化

本文研究了使用乳糖替代IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导褐藻胶裂解酶在重组大肠杆菌中表达的可行性,通过摇瓶实验,分别对诱导终浓度、诱导温度、诱导时机、诱导时间等方面进行了单因素实验并利用响应面对条件进行了优化设计,并使用Ni-NTA亲和柱对粗酶液进行了纯化得到纯酶。结果表明,诱导乳糖终浓度22 mmol/L,诱导温度29℃,诱导22 h,酶活可达到8.552 U/m L。说明乳糖可以作为基因工程菌的高效诱导剂。     

重组蔗糖异构酶的制备及应用条件优化

对重组菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-24a-pal I摇瓶发酵产酶进行研究,探讨了3 L发酵罐中不同乳糖诱导浓度对菌体高密度发酵产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵得到胞外上清酶活253.1 U/m L,3 L发酵罐高密度发酵时,在0.4 g/(L·h)乳糖诱导浓度下,发酵上清酶活可达到最大值654 U/m L。对重组蔗糖异构酶转化蔗糖生成异麦芽酮糖的酶转化条件进行了优化,结果表明,当底物浓度为400 g/L,反应初始p H 6.5,温度30℃,加酶量20 U/g蔗糖,转化时间8 h,异麦芽酮糖可以达到最大转化率87.9%。     

特异腐质霉角质酶在大肠杆菌中的表达和发酵优化

应用大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)表达系统实现特异腐质霉(Humicola insolens,H.insolens)来源角质酶的重组表达。对重组角质酶进行酶学性质研究,发现其最适pH为8.5、最适温度为80℃,并有良好的pH稳定性和温度稳定性。经3L发酵罐中扩大培养并进行发酵条件优化,其最佳发酵条件:发酵前期控制菌体生长pH 7.0、温度37℃,培养时间12~14h;菌体浓度OD600达到50时进入诱导期,调节温度降至30℃,恒速流加0.2g/(L·h)的乳糖溶液进行诱导,总发酵周期为36h,最高酶活2 233U/mL,是摇瓶水平酶活的13倍。     

产气荚膜梭菌磷脂酶C的重组表达及其脱胶应用

将产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)磷脂酶C(Cp-PLC)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了重组表达,并对重组Cp-PLC表达条件进行了优化。结果表明:当菌体生长至OD600为1.0时,添加8 g/L乳糖在30℃下诱导32 h,得到的重组Cp-PLC的酶活最大,为398.35 U/mL;重组Cp-PLC用于菜籽毛油脱胶的最佳条件为温度57℃、pH 5.0、加酶量600 U/kg、反应时间1.5 h;在最佳条件下,菜籽毛油的磷含量可降至5.66 mg/kg,能够满足物理精炼的要求。     

大肠杆菌表达古菌基因的发酵条件研究

对重组大肠杆菌BL21(DE3)表达古菌基因的发酵条件进行了研究,最终确定葡萄糖浓度为10g/L,蛋白胨浓度为19g/L,酵母膏浓度为11.5g/L,硫酸铵浓度为4g/L,磷酸盐浓度为100mmol/L,硫酸镁浓度为10mmol/L.当菌体密度(OD600)达到7.0左右时,加入乳糖至终浓度1g/L,继续诱导培养8h,古菌高温酸性α-淀粉酶酶活力最高达192U/mL.在分析了该菌对葡萄糖利用情况的基础上,对该菌进行了pH-stat流加培养,36h菌体浓度与高温酸性α-淀粉酶活力分别达到67和600U/mL,比摇瓶最好结果分别提高了5.1和3.1倍.     

乳糖诱导极耐高温木聚糖酶基因B在大肠杆菌中的表达

以融合极耐高温木聚糖酶基因B(XynB)的大肠杆菌(E coli)BL2 1(DE3)为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间、诱导培养温度及初始pH对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,IPTG诱导时酶活力达到16 18U/ 10 0mL。乳糖诱导的最优发酵条件为:初始培养基pH 7 0 ,当OD60 0 为2 5时加入0 5 %的乳糖,在37℃条件下诱导培养10h ,收获时OD60 0 达3 5 5 ,酶活力为2 5 91U/ 10 0mL。     

渗透压诱导表达重组Clostridium thermosulfurogenes β-淀粉酶基因

以热硫梭菌Clostridium thermosulfurogenes基因组为模板,PCR扩增出β-淀粉酶基因;将该基因克隆到pET-22b(+)载体上,转入大肠杆菌BL21-SI,采用NaCl形成的高渗透压诱导表达。研究了不同诱导条件对重组菌产β-淀粉酶的影响,结果以菌体密度达到OD600为0.6,诱导剂NaCl浓度为0.6 mol/L,诱导温度为35℃最佳。重组菌以LBON为培养基分批发酵时,由于营养限制,菌体密度OD600仅为4.60,β-淀粉酶活力为118U/mL。采用pH-Stat分批补料发酵时,在菌体密度仅是分批发酵的2.35倍的条件下,得到6.12倍的产酶量,酶活力达722U/mL。重组β-淀粉酶70℃水解可溶性淀粉3h的麦芽糖转化率为62.2%,高于大麦β-淀粉酶的转化率。     

蔗糖异构酶基因在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达及重组菌的细胞固定化

分别利用IPTG和乳糖两种诱导物诱导蔗糖异构酶(SIase)基因在E.coliBL21(DE3)中实现表达,对诱导温度、诱导时机、诱导物浓度、诱导持续时间进行比较分析并优化,确定了二者的最佳诱导条件,在E.coli培养3h后(OD600约为0.9)添加终浓度为0.8mmol/L的IPTG(0.5mmol/L乳糖)在20℃(24℃)条件下诱导14h(12h)能获得最高的蛋白表达量及SIase酶活。在最优条件下以IPTG为诱导物时目的蛋白占总蛋白的41.6%,单位体积培养液中SIase酶活为12.37U/mL,以乳糖为诱导物时分别为27.2%,14.72U/mL,从收获酶活角度考虑可见乳糖作为诱导物的优势;而后利用海藻酸钠包埋法固定化重组菌,转化初始浓度为500g/L的蔗糖溶液,转化10～11h后异麦芽酮糖平均得率在83%以上,蔗糖平均转化率大于99%,固定化细胞能够连续稳定转化25批次,转化效率相对于原始菌提高了近55%。     

Multi-enzyme biosensors with amperometric detection for determination of lactose in milk and dairy products

 In home-made sensors coimmobilizing enzymes in thin-layer plexi-cells on natural protein membranes, three enzyme cells: β-galactosidase and galactose oxidase (A), β-galactosidase and glucose oxidase (B) and β-galactosidase, galactose oxidase and glucose oxidase (C) were built into a flow-injection-analyzer system. The lactose was decomposed and oxidized by the immobilized enzymes and the hydrogen peroxide generated during the enzymatic reactions was determined by amperometric detection. The parameters for biochemical and electrochemical reactions (concentration of buffer, temperature, flow rate) were optimized in each enzyme cell. The pH optima of the lactose measurement was determined in the three enzyme cells mentioned above. The pH optimum of the cells A, B and C were 6.4, 4.5 and 4.8, respectively. The measuring ranges were 1–5 mM, 2–10 mM and 1–5 mM, while the detection limits were 0.5, 1.0 and 0.5 mM, respectively. More than 600, 1000 and 800 samples could be measured with these cells, respectively. Commercial milk and instant dessert powder products were analysed also. Our results showed that the cells B and C were more suitable for the determination of the lactose content of milk. For samples of dairy products containing added glucose, starch and other carbohydrates, enzyme cell A could be used for the efficient determination of lactose in one step. Received: 24 August 1998 / Revised version: 9 November 1998     

乳糖诱导葡萄球菌肠毒素A基因在大肠杆菌中的表达

以乳糖作为诱导剂代替传统方法中的IPTG,分别从菌龄、诱导剂浓度、诱导时间及诱导剂的添加方式等方面,对乳糖诱导金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxins A,SEA)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达进行了研究。结果表明,重组大肠杆菌表达SEA的优化条件为:在对数生长期(OD600约为0.6),一次性添加终浓度为0.5 mmol/L的乳糖诱导6 h。目标蛋白的表达量占菌体总蛋白质的36.9%,略低于以IPTG为诱导剂时38.1%的表达量。乳糖价格仅为IPTG的1%左右,因此,在SEA的大规模制备中,使用乳糖作为诱导剂可以大大节约成本。     

Short communication: Screening inhibition of dairy-relevant pathogens and spoilage microorganisms by lactose oxidase

The inhibitory effect of lactose oxidase on the growth of foodborne pathogens and spoilage microorganisms associated with dairy products was evaluated through an overlay inhibition assay. Lactose oxidase generates hydrogen peroxide via lactose oxidation into lactobionic acid. Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica ser. Typhimurium, Staphylococcus aureus, Pseudomonas fragi, and Penicillium chrysogenum were used as indicators. A commercially available solution of lactose oxidase was applied at different concentrations (0, 0.12, 1.2, and 12 g/L) in 4 types of media [brain heart infusion agar (BHI), BHI + sodium thiocyanate (NaSCN), BHI + lactose, and BHI + NaSCN + lactose] to evaluate the effect of lactose and thiocyanate on microbial inhibition. Lactose oxidase inhibited the growth of all the indicators at a concentration of 12 g/L of the enzyme solution in the presence of lactose alone and in combination with NaSCN. However, supplementation with NaSCN had no effect on the magnitude of microbial inhibition. Staphylococcus aureus was the most sensitive pathogen, and Ps. fragi was the most sensitive of all the indicators in general to lactose oxidase. Listeria monocytogenes and Ps. fragi showed higher susceptibility to the antimicrobial effect of lactose oxidase at 6°C than at their corresponding optimum growth temperature. The inhibitory effect was attributed to the generation of hydrogen peroxide from the oxidation of lactose. Findings from this study demonstrate that lactose oxidase could be used as a novel approach to inhibit the growth of mold and bacteria. It could also be applied as a label-friendly preservative in dairy foods.     

黑曲霉产胺氧化酶培养及诱导条件的优化

黑曲霉可经诱导产生胺氧化酶,该酶具有催化生物胺氧化脱氨生成相应醛、氨气和过氧化氢的特性。黑曲霉胺氧化酶产生分菌体生长和诱导产酶两个阶段。通过单因素试验优化得出黑曲霉产胺氧化酶的菌体生长最佳培养条件：氮源为NaNO3,碳源为麦芽糖,接种量1%,培养时间24 h;诱导产酶的最佳培养条件：诱导氮源为质量浓度60 g/L的正己胺,诱导碳源为葡萄糖,培养时间36 h,培养温度30 ℃,摇床转速160 r/min,初始pH 7.0,胺氧化酶酶活力从诱导前的1 006.5 U/g提升至1 422.4U/g,提高幅度为41.3%。