福辛普利对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织ACE和ACE2基因mRNA转录水平的影响

目的探讨福辛普利对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)大鼠肝组织ACE和ACE2基因mRNA转录水平的影响,为阐明NASH的发病机制及探索新的治疗策略提供实验依据。方法将40只雄性SD大鼠用普通饲料喂养1周后,随机分为4组:正常对照组(NC组,普通饲料+生理盐水1 ml灌胃)、高脂组(HC组,高脂饲料+生理盐水1 ml灌胃)、药物对照组[NF组,正常饲料+福辛普利3.6 mg/(kg.d)灌胃]和药物干预组[HF组,高脂饲料+福辛普利3.6 mg/(kg.d)灌胃],每组10只。给药24周后,分析各组大鼠肝组织病理学变化,检测各组大鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、血管紧张素转换酶(Angiotensin-convert ingenzyme,ACE)、ACE2、血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)和Ang(-1-7)的水平;RT-PCR检测各组大鼠肝组织ACE和ACE2基因mRNA的转录水平;Western blot检测各组大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)的表达水平。结果给药24周后,HF组非酒精脂肪性肝病活动度评分和肝纤维化程度与HC组相比,均明显下降(P<0.001);HF组血清中ALT、ALP、TG、LDL、TGF-β、ACE和AngⅡ的水平均明显低于HC组(P<0.05),而ACE2和Ang(-1-7)的水平均明显高于HC组(P<0.05);福辛普利可显著降低肝组织ACE基因mRNA的转录水平(P<0.001)和CollagenⅠ蛋白的表达水平(P<0.01),升高ACE2基因mRNA的转录水平(P<0.01)。结论福辛普利可能通过下调ACE和上调ACE2的生成和表达,从而降低AngⅡ和升高Ang(-1-7)的生成,具有改善NASH和抗肝纤维化作用。本实验为阐明NASH的发病机制及探索新的治疗策略提供了实验依据。     

氯沙坦对肾衰大鼠RAS基因表达的影响

目的观察氯沙坦对肾衰大鼠肾组织肾素-血管紧张素系统(RAS)血管紧张素1型受体(AT1)、血管紧张素2型受体(AT2)、血管紧张素转化酶(ACE)及血管紧张素原(AGT)基因表达的影响,探讨RAS在慢性肾衰发生发展过程中的作用。方法复制阿霉素(ADR)慢性肾衰大鼠动物模型,随机分为模型(ADR)组和血管紧张素受体拮抗剂(ARB)氯沙坦(ADR+ARB)组,氯沙坦组给予氯沙坦灌胃,另设正常大鼠对照组。取各组大鼠肾组织,经HE染色进行形态学观察,半定量RT-PCR法检测AT1、AT2、ACE及AGT基因mRNA的转录水平。结果与对照组相比,ADR组大鼠肾小球和肾小管出现明显的病变,而ADR+ARB组病变明显减轻。与对照组相比,ADR组AT1﹑AGT和ACE基因表达上调,AT2基因表达下调;与ADR组相比,ADR+ARB组AT1和AGT基因表达下调;ADR+ARB组的AT2基因表达水平接近对照组,ACE基因表达下调,但仍高于对照组水平。结论慢性肾损伤的发生发展可能与AT1、AGT及ACE基因表达水平增高有关。     

血管紧张素转换酶基因rs4340和rs4343多态性与心房颤动的相关性

目的探讨血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)基因rs4340和rs4343多态性与心房颤动(简称房颤)的相关性。方法选择重庆地区4家三甲医院就诊的102例房颤患者及同期住院的无房颤病史患者100例,抽取患者静脉血,分别提取基因组DNA,采用单核苷酸多态性-限制性片段长度多态性(Single nucleotide polymorphism,restriction fragmentlength polymorphism,SNP-RFLP)法及基因测序检测ACE基因rs4340和rs4343的基因型。结果房颤组ACE基因rs4340多态性的基因型及等位基因分布与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),房颤组rs4343的基因型和等位基因分布与对照组间差异有统计学意义(P<0.001或P=0.001)。与对照组相比,房颤组GG+AG基因型频率明显高于AA基因型频率(P<0.001)。II/AA基因型在房颤组中出现的频率明显少于对照组(P=0.001),而II/AG基因型在房颤组中出现的频率明显高于对照组(P=0.002)。房颤组中rs4340和rs4343各基因型左房前后径与右房横径差异均无统计学意义(P>0.05);而将两位点联合分析发现,携带II/AA基因型房颤患者的左房前后径和右房横径均明显小于其他基因型(P<0.001),同时,携带II/AG基因型房颤患者的左房前后径和右房横径均明显大于其他基因型(P<0.001)。结论 ACE基因rs4343多态性与房颤显著相关,II/AA基因型是房颤发生发展的保护因子,而II/AG基因型是预测房颤发生发展的危险因子。     

高血压三项的实验室检查及临床分析

高血压三项的实验室检查通常用放射免疫法测定血浆中肾素活性、血管紧张素Ⅱ和醛固酮。人体血浆中肾素难以直接检测,通常以肾素活性表示肾素的水平。血浆中内源性肾素催化血管紧张素原产生血管紧张素Ⅰ的速率被称为血浆肾素活性。目前检测血浆中肾素活性、血管紧张素Ⅱ和醛固酮已成为原发性和继发性高血压诊断、治疗及研究的重要指标。     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压的相关性

目的研究血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因A1675G多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压(EH)的相关性。方法随机选取山东省济宁地区汉族女性EH患者127例(EH组)和体检正常的女性119例(正常对照组),提取外周血基因组DNA,PCR扩增A1675G基因,高分辨率熔解(HRM)法测定A1675G基因的多态性。结果EH组AA、AG和GG基因型频率(分别为26.8%、53.5%和19.7%)与正常对照组(分别为27.7%、42.0%和30.3%)比较,差异均无统计学意义;等位基因频率(A:53.5%;G:46.5%)与正常对照组(A:48.7%;G:51.3%)比较,差异也无统计学意义。结论A1675G基因多态性可能与山东省济宁地区汉族女性原发性高血压无明显相关性。     

血管紧张素(-1-7)对血管紧张素Ⅱ在大鼠心脏成纤维细胞中信号转导的影响及其机制

目的探讨血管紧张素(-1-7)[Angiotensin(-1-7),Ang(-1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)在大鼠心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)中信号转导的影响及其机制。方法原代分离培养并鉴定新生SD大鼠的CFs,将细胞分为8组:空白对照组、AngⅡ组、Ang(-1-7)组、AngⅡ+Ang(-1-7)组、AngⅡ+Ang(-1-7)+A-779组、AngⅡ+Ang(-1-7)+PAO组、Ang(-1-7)+PAO组和AngⅡ+PAO组,Western blot法检测细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)和磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)的表达;免疫沉淀捕捉分析法检测蛋白酪氨酸磷酸酶-1(Src-homology domain 2 containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-1)的酶活性;实时荧光定量PCR检测转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、I型胶原蛋白(CollagenⅠ,ColⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ,ColⅢ)基因mRNA的转录水平。结果 AngⅡ可增加细胞内p-ERK1/2的表达水平和p-ERK/ERK值(磷酸化的p-ERK1/2与总的ERK1/2的比值),Ang(-1-7)通过与Mas受体结合可拮抗AngⅡ引起的上述效应;Ang(-1-7)通过与Mas受体结合而激活胞内SHP-1的活性,并可拮抗AngⅡ所致的SHP-1活性降低;抑制SHP-1的活性后,Ang(-1-7)拮抗AngⅡ诱导的p-ERK1/2表达水平和p-ERK/ERK值增高的效应被抑制。Ang(-1-7)对TGF-β1、ColⅠ和ColⅢ基因mRNA的转录水平无显著影响,但可抑制AngⅡ所诱导的上述基因mRNA转录水平的增加。结论 Ang(-1-7)通过与Mas受体结合而激活SHP-1,该效应与Ang(-1-7)拮抗AngⅡ诱导的p-ERK1/2的表达水平和p-ERK/ERK值增高密切相关;Ang(-1-7)可抑制AngⅡ所诱导的TGF-β1、ColⅠ和ColⅢ基因表达上调,这些现象可能体现了一种Ang(-1-7)拮抗AngⅡ所致的不良效应的保护性机制。     

杜仲叶不同溶剂萃取物对ACE酶活的抑制作用

探讨了杜仲叶不同溶剂萃取物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用及抗氧化能力。采用系统溶剂萃取法分离杜仲叶有效成分,分别评价了不同溶剂组分对DPPH·、羟基的清除效果及对ACE的抑制能力。不同溶剂萃取物活性成分含量存在显著性差异(P<0.05)。抗氧化研究表明,正丁醇提取物对DPPH·清除作用最强,清除率为76.55%;二氯甲烷提取物对羟基清除作用最强,清除率为48.9%;乙酸乙酯提取物对ACE活性抑制率最高为30%。ACE抑制率与DPPH·、羟基清除率及黄酮、多酚、绿原酸、京尼平苷酸含量之间存在正相关性。在研究抗氧化及ACE酶抑制剂时正丁醇萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物应被作为重点考察对象,黄酮、多酚、绿原酸、京尼平苷酸可能是抑制ACE的物质基础。     

血管紧张素转换酶2过表达对大鼠急性心肌梗死后心室重构的影响及其分子机制

目的探讨血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)过表达对大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后心室重构的影响及其可能的分子机制。方法采用开胸结扎冠状动脉法建立SD大鼠AMI模型,将模型大鼠随机分为MI、MI+(NS)、MI+AdEGFP、MI+AdACE2组,另设SHAM(假手术)组,每组15只,MI+NS、MI+AdEGFP和MI+AdACE2组沿心肌梗死周边区选取5个点,通过直接心肌内注射方式分别注射NS、AdEGFP和AdACE2,SHAM和MI组不注射。术后4周末,采用Western blot法检测大鼠心肌梗死周边区心肌组织中ACE2、α-SMA、MKP-1、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、TGF-β1蛋白的表达;HE染色后于普通显微镜下观察心肌组织结构及细胞炎症变化,天狼猩红-饱和苦味酸染色后于普通显微镜及偏振光显微镜下分别观察心肌胶原表达分布情况;SP免疫组化染色法检测大鼠心肌梗死周边区心肌组织中AngⅡ、Ang(1-7)、α-SMA蛋白的表达,同时采用ELISA法检测Ang(1-7)蛋白的表达;使用羟脯氨酸试剂盒检测大鼠心肌梗死周边区心肌组织中羟脯氨酸含量。结果术后4周末,MI+AdACE2组大鼠心肌梗死周边区心肌组织中ACE2蛋白的表达量显著高于其他各组,同时Ang(1-7)蛋白的表达量也显著升高(P<0.05);与SHAM组相比,MI、MI+NS、MI+AdEGFP组大鼠心肌梗死周边区心肌组织中AngⅡ、Ang(1-7)、α-SMA蛋白的表达量显著升高(P<0.05),MI+AdACE2组与MI、MI+NS、MI+AdEGFP组相比,AngⅡ、α-SMA蛋白表达水平降低,Ang(1-7)蛋白表达水平升高更显著;与MI、MI+NS、MI+AdEGFP各组相比,MI+AdACE2组大鼠心肌梗死周边区心肌组织中MKP-1蛋白的表达水平明显增加(P<0.05),p-ERK、P38、TGF-β1蛋白的表达水平降低,羟脯氨酸含量显著降低(P<0.05);HE染色和天狼猩红-饱和苦味酸染色证实,ACE2对AMI后梗死周边区的炎症反应和胶原重塑均有明显的改善作用。结论 ACE2在心肌过表达能有效改善大鼠AMI后心肌梗死周边区心肌纤维化进程,缓解心室重构,其机制可能与ACE2调节肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensin system,RAS)、平衡丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)活性相关。     

血管紧张素Ⅱ基因重组杆状病毒的构建

目的构建携带血管紧张素I(IAngiotensin Ⅱ,AngⅡ)基因的重组杆状病毒,并利用Bac-to-Bac重组杆状病毒表达系统进行表达。方法将重组杆粒bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC(rB/HAngⅡ)转染昆虫细胞sf9,包装出重组杆状病毒rBac-P1-2A-4AngⅡs-3ABC(rBAV),通过光学显微镜和透射电镜观察细胞病变(CPE)及病毒形态,采用蚀斑试验检测病毒滴度,PCR及间接免疫荧光技术验证该病毒及感染细胞中AngⅡ和HAV蛋白的表达。结果重组杆粒rB/HAngⅡ转染sf9细胞96 h后,出现典型的CPE;透射电镜下观察可见典型的杆状病毒颗粒;PCR可特异性的扩增出约3 000和1 000 bp的P1-2A-4AngⅡs和3ABC基因片段;P3代重组杆状病毒滴度约为4×108pfu/ml;感染后的sf9细胞中可见特异性的绿色荧光(AngⅡ蛋白)和红色荧光(HAV结构蛋白)。结论已成功构建了携带AngⅡ基因的重组杆状病毒,并在sf9细胞中获得表达,为研制抗高血压疫苗提供了新的思路。     

植物乳杆菌差异表达基因的筛选

目的筛选具有高血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制活性的植物乳杆菌的差异表达基因片段。方法利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选植物乳杆菌差异表达基因片段,构建双向消减文库,用DNAMAN软件比较差异序列,确定差异序列数目及其同源性,用NCBI BLAST软件分析单个差异序列。结果筛选出112个阳性克隆,最终通过对52个阳性菌株测序,获得10条不同序列的差异片段,与已知Lactobacillus plantarum基因组序列高度同源,分别与酶蛋白、膜蛋白及能量运输有关。结论构建了植物乳杆菌ACE抑制酶活消减文库,为进一步研究植物乳杆菌产ACE抑制肽通路机制奠定了理论基础。