氟伐他汀对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾小管上皮细胞核因子κB活性的影响

目的 观察氟伐他汀对血管紧张素（Ang）Ⅱ诱导的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）内核因子（NF）κB活性的影响。 方法 将NRK-52E细胞分为（1）对照组;（2）不同浓度及时间AngⅡ组;（3）AngⅡ（10-6 mol/L）+SB203580（10 μmol/L）组;（4）AngⅡ（10-6 mol/L）+不同浓度氟伐他汀（10-7、10-6、10-5 mol/L）组;(5)AngⅡ（10-6 mol/L）+氟伐他汀（10-5 mol/L）+甲羟戊酸（10-4 mol/L）组。电泳迁移率变动分析法（EMSA）检测NF-κB活性变化。Western印迹方法检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化水平。RT-PCR方法检测单核细胞趋化因子（MCP-1）mRNA表达。 结果 AngⅡ呈剂量依赖性上调NF-κB DNA结合活性、p38MAPK的磷酸化水平以及MCP-1 mRNA表达（P < 0.01）。AngⅡ(10-6 mol/L) 刺激5 min即可增加p38MAPK蛋白磷酸化水平（P < 0.01）。AngⅡ刺激30 min后NF-κB活性显著升高（P < 0.01）,2 h达高峰（P < 0.01）。p38MAPK 特异性抑制剂SB203580可阻断AngⅡ对NF-κB的激活作用（P < 0.01）。氟伐他汀可呈剂量依赖性下调AngⅡ诱导的NRK-52E细胞内p38MAPK磷酸化和NF-κB活化,以及其下游趋化因子MCP-1表达（P < 0.05）。甲羟戊酸（10-4 mol/L）可逆转氟伐他汀的作用（P < 0.05）。 结论 氟伐他汀可能通过抑制p38MAPK信号转导通路,下调AngⅡ诱导的NRK-52E细胞内NF-κB的活化。甲羟戊酸可部分逆转氟伐他汀的作用。     

吡格列酮对高糖诱导大鼠腹膜间皮细胞合成细胞外基质的作用及机制

目的　观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ配体吡格列酮对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）合成细胞外基质的作用以及调节机制。 方法 胰蛋白酶消化法分离培养RPMC。随机分为正常对照组、高糖组（2.5%葡萄糖）、吡格列酮干预组（10 μmol/L、20 μmol/L+2.5%葡萄糖）、二硫氨基甲酸吡咯烷干预组（PDTC,NF-κB抑制剂,25 μmol/L、50 μmol/L+2.5%葡萄糖）、姜黄素干预组[活化蛋白1（AP-1）抑制剂,15 μmol/L、30 μmol/L+2.5%葡萄糖]。RT-PCR方法检测纤连蛋白（FN）、Ⅰ型胶原（COLⅠ）、纤溶酶原激活抑制因子1（PAI-1）、c-fos、c-jun mRNA表达。ELISA方法检测细胞上清液中FN、COLⅠ和PAI-1蛋白水平。Western印迹方法检测IκBα、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κBp65、磷酸化NF-κBp65 （p-p65）蛋白表达。 结果 常规培养的腹膜间皮细胞表达基础量的FN、COLⅠ和PAI-1,高糖显著上调其蛋白及mRNA表达（P < 0.01）。吡格列酮预处理后,高糖诱导的FN、COLⅠ和PAI-1蛋白及mRNA表达显著低于高糖组（P < 0.01）。高糖作用后,磷酸化IκBα和NF-κBp65水平显著增高,c-fos、c-jun mRNA表达增加,与对照组差异有统计学意义（P < 0.01）。PDTC预处理后,高糖诱导RPMC的FN和PAI-1蛋白水平降低（P < 0.01）,COLⅠ蛋白表达无明显变化。AP-1抑制剂姜黄素预处理后,高糖诱导的RPMC FN、COLⅠ和PAI-1蛋白水平均显著降低,与对照组差异有统计学意义（P < 0.01）。吡格列酮抑制高糖条件下磷酸化IκBα和NF-κB p65水平,抑制c-fos、c-jun mRNA表达（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 NF-κB和AP-1信号通路参与高糖条件下RPMC的FN、COLⅠ和PAI-1表达的调节。吡格列酮通过NF-κB 和AP-1途径下调高糖诱导的RPMC的FN、 COLⅠ和PAI-1的表达,从而发挥抗纤维化作用。     

罗格列酮通过核因子κB抑制脂多糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞CD40和胞间黏附分子1的表达

目的 探讨罗格列酮对脂多糖（LPS）诱导的体外培养大鼠腹膜间皮细胞CD40和胞间黏附分子1（ICAM-1）表达的影响以及调节机制。 方法 分离及培养大鼠原代腹膜间皮细胞。将细胞随机分为正常对照组、LPS（5 mg/L）组、BAY11-7085（NF-κB抑制剂）组（5 μmol/L预刺激3 h后加入LPS作用3 h）、不同浓度罗格列酮（过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ配体）组（10、20 μmol/L分别预处理3 h再加入LPS 5 mg/L）、GW9662（过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ拮抗剂）预处理组（预处理3 h后加入罗格列酮10 μmol/L,3 h后再加入LPS 5 mg/L）和溶媒对照组。加入LPS后 1 h收集细胞检测核因子κB（NF-κB） p65水平;3 h收集细胞分别检测CD40和ICAM-1基因表达;24 h收集细胞分别检测CD40和ICAM-1蛋白表达。RT-PCR法检测基因表达;Western印迹和免疫荧光方法检测蛋白表达及核因子磷酸化。 结果 （1）常规培养的腹膜间皮细胞表达基础量CD40和ICAM-1,LPS显著上调其表达（P < 0.05）;LPS作用1 h时腹膜间皮细胞磷酸化NF-κB p65活化水平显著增高,与对照组差异有统计学意义 (1.10±0.17比0.55±0.06,P < 0.05)。（2）NF-κB抑制剂BAY11-7085预处理后LPS诱导的磷酸化NF-κB p65水平、CD40 和ICAM-1表达显著低于LPS组（0.22±0.11比1.10±0.17,P < 0.01;0.34±0.02 比 0.50±0.06,P < 0.05;0.35±0.16 比0.74±0.03,P < 0.05）。（3）罗格列酮预处理后,LPS诱导的磷酸化NF-κB p65水平、CD40以及ICAM-1蛋白表达亦显著低于LPS组（0.77±0.08比0.90±0.10,P < 0.01;0.79±0.16 比0.99±0.06,P < 0.05;0.83±0.20比1.22±0.13,P < 0.05）。GW9662和罗格列酮联合预处理后,LPS诱导的磷酸化NF-κB p65水平与罗格列酮预处理组差异无统计学意义,但CD40和ICAM-1表达显著高于罗格列酮预处理组（0.95±0.19比0.79±0.16;1.04±0.24比0.83±0.20,均P < 0.05）。 结论 NF-κB信号通路参与调节LPS诱导的腹膜间皮细胞表达CD40和ICAM-1。罗格列酮通过 NF-κB途径下调CD40和ICAM-1表达,从而发挥抗炎作用。     

脂氧素A4对脂多糖活化小鼠巨噬细胞NF-κB和TNF-α转化酶的影响

目的 研究脂氧素A4（LXA4）对脂多糖（LPS）活化的小鼠巨噬细胞NF-κB及TNF-α转化酶的影响。方法 小鼠RAW 264．7巨噬细胞株培养于细胞培养板,随机分为空白对照组、LPS处理组（LPS 1μg/ml）和LPS＋LXA4组（LPS 1μg/ml＋LXA4 10^-7mol/L）。酶联免疫吸附法测定上清液TNF-α水平,提取细胞总蛋白,Western blot法测定NF-κB p65、IκB-α及TNF-α转化酶含量,荧光素酶报告质粒测定NF-κB活性。结果 LXA4抑制LPS活化的RAW 264．7巨噬细胞IκB-α降解、NF-κB p65核转位及NF-κB活性,同时抑制TNF-α蛋白表达和上调TNF-α转化酶蛋白表达。结论 LXA4通过抑制NF-κB活性和下调TNF-α转化酶表达而减少LPS活化的RAW264．7巨噬细胞分泌TNF-α。     

雷公藤内酯醇对AngⅡ介导的肾小球系膜细胞核因子-κB活化及MCP-1表达的影响

目的：观察不同剂量雷公藤内酯醇对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）介导的肾小球系膜细胞（GMC）核因子-κB（NF-κB）活化及单核细胞趋化因子-1（MCP-1）表达的影响，探讨雷公藤内酯醇抑制肾小球系膜细胞炎症因子表达的可能机制。方法：分离培养大鼠GMC，用10^-6mol／L AngⅡ刺激GMC，将培养的大鼠GMC随机分为5组：正常培养对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ和3种不同浓度的雷公藤内酯醇共孵育组。分别采用酶联免疫激光扫描共聚焦显微镜、ELISA、RT—PCR法、Western Blot法，检测GMC内NF-κB p65核易位阳性率、细胞培养上清液中MCP-1水平、GMC内MCP-1 mRNA表达及ⅠκBα蛋白表达水平。结果：雷公藤内酯醇呈剂量依赖性下调AngⅡ介导的大鼠GMC内NF-κB p65水平，抑制AngⅡ诱导的大鼠GMC MCP-1及MCP-1 mRNA的表达，抑制AngⅡ诱导的大鼠GMC内ⅠκBα蛋白表达下调。结论：雷公藤内酯醇能够抑制AngⅡ诱导的大鼠GMC ⅠκB的磷酸化降解及NF—κB活化；抑制AngⅡ诱导的大鼠GMCMCP-1 mRNA表达MCP-1分泌。     

硫喷妥钠对内毒素诱导小鼠肺组织NF-κB表达的影响

目的研究硫喷妥钠对内毒素（LPS）诱导小鼠肺组织NF-κB的表达的影响。方法雄性昆明小鼠24只，随机分为4组（n=6）：对照组（C组）、LPS组（L组）、硫喷妥钠处理组（L＋T组）、单纯硫喷妥钠处理组（T组）。C组腹腔注射生理盐水1ml／ks；L组腹腔注射LPS5mg／kg；L＋T组腹腔注射LPS5mg／kg 20min时再注射1％硫喷妥钠注射液60mg/kg；T组单纯腹腔注射1％硫喷妥钠注射液60mg／kg。在注射LPS后3h放血处死小鼠，立即开胸取肺。免疫蛋白印迹法测定肺组织NF-κB p65的表达；酶联免疫吸附法测定肺组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）含量。结果与C组相比，L、L＋T组肺组织NF-κB p65表达增加，L、L＋T、T组肺组织，TNF-α、IL-1β含量上升（P〈0．05）；与L组相比，L＋T、T组肺组织NF-κB p65表达降低，肺组织TNF-α，IL-1β含量降低（P〈0．05）。结论硫喷妥钠通过下调小鼠LPS诱导的肺组织NF．KB065表达，降低了TNF-α及IL-1β的释放。     

镧对内毒素/脂多糖诱导的巨噬细胞核因子κB活化的抑制作用

目的 了解稀土元素镧对内毒素／脂多糖（LPS）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞（Mφ）核因子KB（NF-κB）活化的影响，并探讨其机制。方法分离培养小鼠腹腔Mφ，分为：空白对照组，无刺激因素：LPS组，用1μg／mlLPS刺激30min；镧离子（La^3＋）组，用2，5μmol／L La^3＋刺激30min；La^3＋＋LPS组，先后用2，5-μmol／L La^3＋、1μg／ml LPS各刺激30min；La^3＋／L PS组，2．5μmol／L La^3＋刺激30min后，洗涤细胞，再加入1μg／ml LPS刺激30min。采用细胞免疫荧光染色法观察NF-κB在各组细胞中的分布与表达；酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测胞核中NF-κB／p65蛋白活性；蛋白质印迹法检测细胞核内NF-κB／p65蛋白及胞质中核因子抑制蛋白α（IκBα）的表达量。ELISA法测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。结果 （1）免疫荧光染色显示，空白对照组、La^3＋组、La^3＋＋LPS组和La^3＋／LPS组M小绿色荧光多分布于胞质，胞核荧光强度分别为42±7、73±30、48±11和67±19；LPS组绿色荧光集中于胞核，荧光强度为116±14，明显高于其余4组（P〈0.01）。（2）胞核NF-κB／p65蛋白活性：LPS组吸光度值为0．435±0．066，与空白对照组（0．048±0．027）、La^3＋组（0．062±0．049）、La^3＋＋LPS组（0.066±0.031）、La^3＋／LPS组（0．108±0.017）比较．明显偏高（P〈0．01）。（3）LPS组M由胞核NF-κB／p65蛋白表达水平明显高于其余4组，胞质IκBα蛋白表达水平明显低于其余4组。（4）TNF-α含量：La^3＋组培养上清液中TNF-α含量低于试剂盒检测下限（25pg／m1）及空白对照组（P〈0.05），La^3＋＋LPS组和La^3＋／LPS组低于LPS组（P〈0．01），但高于空白对照组。结论 LPS可激活小鼠腹腔M由NF-κB／p65核移位，并使胞核中NF-κB／p65的表达量和活性升高、胞质IκBα蛋白表达下调，导致TNF-α分泌增多。镧可抑制上述效应。     

拮抗Toll样受体4的表达对内毒素血症小鼠肾脏损伤的保护作用

目的观察拮抗Toll样受体4（TLR4）的表达对内毒素血症小鼠肾脏损伤的保护作用以及对细胞核因子-κB（NF-κB）p65的影响。 方法采用内毒素（LPS）诱导的小鼠急性肾功能衰竭模型,并应用TLR4单克隆抗体进行干预,观察TLR4单克隆抗体对内毒素血症小鼠的肾脏组织学、血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、胱抑素C、白细胞介素（IL）-1β、IL-6水平以及肾组织中TLR4及NF-κB水平的影响。 结果与模型组比较,TLR4单克隆抗体能够明显改善内毒素血症小鼠肾脏组织病理学损害;降低血清中Cr、BUN、胱抑素C、IL-β和IL-6水平（t = 7.20、7.86、9.99、8.79、3.92,P均< 0.05）,并且降低肾组织中TLR4及NF-κB p65水平（t = 20.94、11.21,P均< 0.05）。 结论TLR4单克隆抗体能够保护内毒素血症小鼠肾脏组织损伤,其作用机制可能与调节TLR4/NF-κB信号转导通路有关。     

表面活性蛋白-A对脂多糖诱导的人肾小管近曲上皮细胞白介素-6表达的影响

目的：探讨表面活性蛋白-A（SP-A）的表达改变对脂多糖（LPS）诱导的人肾小管近曲上皮细胞（HK-2细胞）白介素-6（IL-6）表达的影响及机制。方法培养HK-2细胞,ELISA方法检测不同浓度的LPS（0、0．1、1、2、5、10 mg／L）作用8 h及5 mg／L的LPS于不同时间（0、2、4、8、16、24 h）作用HK-2细胞后IL-6蛋白表达的变化;应用脂质体转染法将SP-A SiRNA转染入HK-2细胞,筛选稳定转染细胞株,采用5 mg／L的LPS刺激SP-A SiRNA稳定转染的HK-2细胞8 h,ELISA方法检测细胞上清中IL-6的分泌量,Western印迹检测细胞NF-κB p65蛋白的表达。结果应用1、2、5、10 mg／L的LPS刺激HK-2细胞8 h后,IL-6蛋白表达水平较0、0．1 mg／L的LPS刺激后显著升高（P＜0．05）;同时,应用5 mg／L的LPS作用HK-2细胞4、8、16、24 h后,IL-6蛋白的表达水平较5 mg／L的LPS作用0、2 h显著升高（P＜0．05）。SP-A SiRNA转染的HK-2细胞经LPS刺激后,其NF-κBP65和IL-6蛋白表达较未转染经LPS刺激细胞明显升高（P＜0．05）。结论 SP-A可能通过抑制NF-κB p65的表达进而下调LPS诱导的HK-2细胞IL-6的表达,在脓毒症急性肾损伤时发挥保护作用。     

镧对内毒素/脂多糖诱导的巨噬细胞核因子KB活化的抑制作用

目的了解稀土元素镧对内毒素/脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)核因子κB(NF-κB)活化的影响,并探讨其机制。方法分离培养小鼠腹腔 Mφ,分为:空白对照组,无刺激因素;LPS 组,用1μg/ml LPS 刺激30 min;镧离子(La~(3 ))组,用2.5 μmol/L La~(3 )刺激30 min;La~(3 ) LPS 组,先后用2.5μmol/L La~(3 )、1μg/mI LPS 各刺激30 min;La~(3 )/LPS 组,2.5μmol/L La~(3 )刺激30 min 后,洗涤细胞,再加入1μg/ml LPS 刺激30 min。采用细胞免疫荧光染色法观察 NF-κB在各组细胞中的分布与表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)法捡测胞核中 NF-κB/p65蛋白活性;蛋白质印迹法检测细胞核内 NF-κB/p65蛋白及胞质中核因子抑制蛋白α(IκBα)的表达量。ELISA 法测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死冈子α(TNF-α)的含量。结果 (1)免疫荧光染色显示,空白对照组、La~(3 )组、La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组 Mφ绿色荧光多分布于胞质,胞核荧光强度分别为42±7、73±30、48±11和67±19;LPS 组绿色荧光集中于胞核,荧光强度为116±14,明显高于其余4组(P<0.01)。(2)胞核 NF-κB/p65蛋白活性:LPS 组吸光度值为0.435±0.066.与空白对照组(0.048±0.027)、La~(3 )组(0.062±0.049)、La~(3 ) LPS 组(0.066±0.031)、La~(3 )/LPS 组(0.108±0.017)比较,明显偏高(P<0.01)。(3)LPS 组 Mφ胞核 NF-κB/p65蛋白表达水平明显高于其余4组,胞质 IκBα蛋白表达水平明显低于其余4组。(4)TNF-α含量:La~(3 )组培养上清液中 TNF-α含量低于试剂盒检测下限(25 pg/ml)及空白对照组(P<0.05),La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组低于 LPS 组(P<0.01),但高于空白对照组。结论 LPS 可激活小鼠腹腔 MφNF-κB/p65核移位,并使胞核中 NF-κB/p65的表达量和活性升高、胞质 IκBα蛋白表达下调,导致 TNF-α分泌增多。镧可抑制上述效应。     

游离脂肪酸激活HaCaT细胞表面TLR对NF-ΚB信号转导通路的影响

目的：观察长链游离脂肪酸对体外培养的角质形成细胞的作用,探讨其对TLR及NF—KB信号转导通路的影响。方法：①体外培养Hacat细胞,实验分为N、PA、SA、LPS四组,N组为正常对照组,软脂酸（Palmitic Acid,PA）750μmol／L、硬脂酸（Stearic Acid,SA）750μmol／L、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）500ng／L和Macat细胞共培养72h组分别为N组、PA组、SA组、LPS组;②LPS、SA与角质形成细胞共培养72h检测LPS、SA对Hacat细胞NF—KB、p-IκBα、IκBα表达的影响。通过免疫印迹法（Weston blot）检测SA、LPS对Hacat细胞TLR2、TLR4、NF—κB、p-IκBα、IκBα表达的影响;Real Time PCR方法检测对Hacat细胞内NF—κB、TNF—α mRNA表达的影响。结果：SA、LPS激活细胞表面TLR后可以明显促进细胞表面TLR2、TLR4表达及细胞内NF—κB、TNF-α等促炎症因子的表达。PA促进Hacat细胞内NF—κB、p-IκBα、IκBα表达无明显影响（P〉0．05）结论：SA可促进角质形成细胞分泌NF-κB、TNF-α等因子表达促进炎症反应;其机制可能为：SA可能通过TLR及NF—κB信号传导通路促进细胞释放NF—κB、TNF—α等促炎因子。     

血管紧张素Ⅱ通过TLR4-MyD88途径诱导大鼠肾小管上皮细胞炎性因子释放

目的 观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激肾小管上皮细胞（NRK-52E）后肿瘤坏死因子α（TNF-α）和热休克蛋白47（HSP47）的表达,分析Toll样受体4（TLR4）信号通路的变化与上述因子的关联,探讨AngⅡ促进NRK-52E细胞炎性反应、纤维化的天然免疫机制。 方法 细胞同步化后,将其分为4组：对照组、AngⅡ（10-7 mmol/L）组、坎地沙坦（10-5 mmol/L）+AngⅡ组、TLR4阻断剂（20 mg/L）+AngⅡ组,培养6 h后RT-PCR法检测TLR4及转接信号髓分化因子88（MyD88）mRNA表达水平;12 h后免疫荧光法检测细胞表面TLR4蛋白表达;24 h后以ELISA法检测细胞上清液TNF-α及HSP47的浓度。 结果 与对照组相比,AngⅡ显著上调NRK-52E细胞 TLR4、MyD88 mRNA和TLR4蛋白表达（均P < 0.01）,并诱导细胞TNF-α和HSP47的释放（均P < 0.01）。与AngⅡ组相比,TLR4阻断剂和坎地沙坦干预均显著抑制 AngⅡ对细胞TLR4、MyD88的刺激效应（均P < 0.01）;坎地沙坦抑制AngⅡ诱导的细胞 TNF-α、HSP47的释放（均P < 0.01）,TLR4阻断剂对细胞 TNF-α、HSP47的下调呈剂量依赖性。 结论 AngⅡ对NRK-52E细胞天然免疫信号TLR4、MyD88具有激活效应,该信号激活可能是AngⅡ促进肾小管细胞炎性相关因子释放的重要机制之一。坎地沙坦抑制肾小管细胞炎性因子的体外效应也与其调节该信号通路有关。     

氯胺酮对脂多糖诱导人单核细胞NF-κB表达和肿瘤坏死因子-α释放的影响

目的研究氯胺酮(KT)对脂多糖(LPS)诱导的人单核细胞核因子κB(NF-κB)表达和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)释放的影响,探讨氯胺酮抗炎效应的机制。方法将采集分离的健康志愿者外周血单核细胞接种于培养板,按培养液不同分为四组,每组20孔。LPS组:加入1 mg·L-1 LPS 1 ml;对照组:加入等体积生理盐水;LPS KT 20mg·L-1组:加入20mg·L-1 KT 1 ml后加入LPS 1 ml;LPS KT 100 mg·L-1组:加入100 mg·L-1 KT 1 ml后加入LPS 1 ml。按孵育时间不同分成5个亚组,每组4孔,分别于孵育0．5、2、6、12和16 h取细胞及细胞培养上清液,应用免疫细胞化学染色法检测细胞NF-κB p65 表达,计算阳性率,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中TNF-α浓度。结果与对照组比较,LPS、 LPS KT 20 mg·L-1、LPS KT 100 mg·L-1组NF-κB p65阳性率孵育0．5 h增加,2 h时达高峰。TNF-α浓度在孵育2 h时开始升高,6 h时达高峰。与LPS组比较,LPS KT 20 mg·L-1组NF-κB p65阳性率在孵育0．5、2 h时,TNF-α浓度在2、6 h时降低,LPS KT 100 mg·L-1组NF-κB p65阳性率在0．5、2、6 h时, TNF-α浓度在2、6、12、16 h时降低。与LPS KT 20 mg·L-1组比较,LPS KT 100 mg·L-1组NF-κB p65阳性率在孵育2、6 h时,TNF-α浓度在6、12、16 h时降低(P<0．05或0．01)。结论 KT抑制LPS诱导人单核细胞NF-κB的表达和TNF-α的释放,其作用可能与剂量有关。     

TLR4在高糖诱导的HK-2细胞凋亡中的作用

目的:探讨TLR4在高葡萄糖诱导的HK-2细胞凋亡中的作用及机制。方法:设置不同的葡萄糖干预浓度梯度和时间梯度,采用WB的方法检测TLR4和NF-κB的表达情况以研究TLR4和NF-κB的表达与葡萄糖刺激的浓度和时间关系;使用TLR4和NF-κB特异性阻断剂处理HK-2细胞以探究阻断TLR4/NF-κB后对下游的影响,实验分为对照组、高糖组、TLR4阻断组和NF-κB阻断组,采用RT-PCR和WB的方法检测PGC-1α和剪切的caspase-3的表达,采用免疫荧光技术在共聚焦显微镜下观察Cyt C的分布,并用荧光显微镜观察细胞核及DNA的损伤情况。结果:TLR4的蛋白表达与葡萄糖刺激呈浓度和时间依赖关系(P 0. 05),高葡萄糖环境下磷酸化的NF-κB p65蛋白表达升高,以干预2 h组升高最为显着(P 0. 05);高葡萄糖刺激后PGC-1α的表达减少、Cyt C重分布、剪切的caspase-3的表达增多、细胞核碎裂及细胞DNA损伤增加,而TLR4/NF-κB阻断后上述高葡萄糖导致的变化被逆转(P 0. 05)。结论:TLR4/NF-κB在高葡萄糖环境中被激活并介导高葡萄糖所致PGC-1α的下调、线粒体功能障碍及细胞凋亡。     

异丙酚预先给药对BV-2细胞缺氧复氧时TLR4表达的影响

目的 评价异丙酚对BV-2细胞缺氧复氧时Toll样受体4(TLR4)表达的影响.方法 小鼠小胶质细胞(BV-2细胞)于6孔培养板中培养4～6 d后随机分为4组(n=4),正常对照组(C组)不给予任何处理;缺氧复氧组(A/R组)缺氧3 h、复氧12 h;缺氧复氧+25μmol/L异丙酚组(P25组)和缺氧复氧+100μmol/L异丙酚组(P100组)于缺氧前30 min加入异丙酚,终浓度分别为25、100μmol/L.于复氧12 h时收集细胞,测定TLR4 mRNA、NF-κB mRNA和TLR4蛋白水平;收集细胞上清液,测定TNF-α水平.结果 与C组比较,A/R组、P25组和P100组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、TLR4蛋白和TNF-α水平均升高(P<0.01);与MR组比较,P25组和P100组TLR4 mRNA、NF-κB mBNA、TLB4蛋白和TNF-α水平均下降(P<0.01);与P25组比较,P100组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、TLR4蛋白和TNF-α水平均降低(P<0.01).结论 异丙酚25、100 μmol/L预先给药可抑制BV-2细胞缺氧复氧时TLR4 mRNA表达上调.     

NADPH氧化酶介导血管紧张素Ⅱ诱导的腹膜间皮细胞转分化及细胞外基质积聚

目的 探讨NADPH氧化酶在血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的腹膜间皮细胞转分化以及细胞外基质积聚中的作用。 方法 体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞，静止24 h后，随机分为以下4组：正常对照组，AngⅡ（10^-7 mol/L）组，AngⅡ+ Los(洛沙坦,10 μmol/L)组及AngⅡ+DPI（NADPH氧化酶活性抑制剂，10 μmol/L）组。应用荧光染料（DCF）及激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧（ROS）的产生。RT-PCR检测NADPH氧化酶亚单位p47phox以及纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）1、α平滑肌肌动蛋白（SMA）、E钙黏蛋白（cadherin） mRNA的表达。Western印迹检测p47phox、α-SMA的蛋白表达。 结果 （1）外源性AngⅡ可显著增加大鼠腹膜间皮细胞ROS的产生，刺激15 min后，ROS 的表达较对照组上升了(3.64±0.53)倍。DPI和洛沙坦可显著抑制AngⅡ刺激后ROS的产生（P < 0.05）。（2）AngⅡ刺激腹膜间皮细胞后， NADPH氧化酶亚单位p47phox mRNA和蛋白的表达均呈上升趋势。洛沙坦和DPI可阻断由AngⅡ诱导的p47phox表达上调（P < 0.05）。（3） AngⅡ诱导α-SMA表达的上调以及 E-cadherin mRNA的下调, 洛沙坦和DPI可部分逆转AngⅡ的这种作用。（4）AngⅡ刺激8 h后可明显上调PAI-1的mRNA表达，为正常对照组的（3.06±0.77）倍。 洛沙坦和DPI可明显阻断PAI-1的表达上调（P < 0.05）。 结论 NADPH氧化酶依赖产生的ROS介导了AngⅡ诱导的腹膜间皮细胞转分化及细胞外基质积聚。阻断AngⅡ的作用及抑制NADPH氧化酶的表达和活性可作为防治腹膜纤维化的潜在治疗靶点。     

TLR4和NF-κB在大鼠肾缺血再灌注损伤中的表达及意义

目的：观察大鼠肾缺血再灌注损伤后Toll样受体4（TLR4）和核因子-κB（NF-kB）的表达变化及其关系.方法：将40只SD大鼠随机等分为假手术组（S组）和肾缺血再灌注损伤组（I/R组）,建立肾缺血再灌注模型.在肾缺血再灌注后24 h切取肾脏.采用免疫组织化学法观察TLR4蛋自及NF-κB蛋白在肾脏组织中的表达变化及其相关性 采用半定肇逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组肾组织中TLR4、NF-κB的mRNA水平表达变化.结果：TLR4蛋白在S组大鼠肾小管细胞中有少量表达,在I/R组24 h后肾组织中表达明显增加,与S组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.NF-κB P65蛋白在S组大鼠肾小管细胞胞浆和少量胞核中有表达.在I/R组24 h后肾小管细胞胞浆和胞核均可见NF-κB P65明显表达.差异有统计学意义（P〈0.01）.TLR4和NF-κB在肾缺血再灌注损伤组织中的表达具有明显的相关性.I/R组中的TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达均较S组上调,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论：大鼠肾缺血冉灌注损伤后,肾组织TLR4和NF-κB P65的表达明显上调,且有明显的相关性.TLR4有可能通过激活NF-κB继而引起下游的炎症因子募集,介导肾缺血再灌注损伤.     

雷公藤甲素对TNF-α诱导的肾系膜细胞MCP-1和ICAM-1表达干预及其机制的研究

目的：观察雷公藤甲素对TNF-α诱导的肾系膜细胞（GMC）MCP-1,ICAM-1表达的干预并探讨其作用机制。方法：把培养的GMC按刺激及干预情况分为正常对照组、TNF-α刺激组、雷公藤甲素低（5ng/ml）,中（10ng/ml）,高浓度（15ng/ml）干预组,以及吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）干预组（阳性对照组）、PDTC与雷公藤甲素（10ng/ml）联合干预组。TNF-α刺激干预诱导24h后,分别提取细胞上清液、细胞质、细胞核等成分,采用ELISA法检测MCP-1,ICAM-1,IκB,IκBα,ELISA结合EMSA方法检测各组NF-κB p65,以RT-realtime PCR方法检测MCP-1,ICAM-1的mRNA。结果：TNF-α刺激组MCP-1、ICAM-1的mRNA及蛋白表达、NF-κB p65分子水平较对照组显著增高（P〈0.01）;各浓度雷公藤甲素或PDTC干预后上述指标显著下降（P〈0.01）,其中PDTC与雷公藤甲素联合干预组较单用PDTC干预组MCP-1、ICAM-1更低。相关分析表明NF-κB p65与MCP-1及ICAM-1的蛋白和mRNA表达水平呈正相关。GMC经TNF-α刺激后IκB有所下降,雷公藤甲素呈剂量依赖性上调κB,TNF-α刺激后磷酸化的IκBα较正常对照组显著升高（P〈0.05）,低浓度雷公藤甲素可显著下调其水平（P〈0.05）。结论：雷公藤甲素能显著抑制GMC分泌MCP-1、ICAM-1等促炎因子的mRNA及蛋白表达,其机制可能是促进IκB表达上调,并抑制IκBα磷酸化,从而阻断细胞核NF-κB p65活化所致。     

二硫代氨基吡咯烷预先给药对内毒素诱发大鼠心肌损伤的影响

目的 评价二硫代氨基吡咯烷预先给药对LPS诱发大鼠心肌损伤的影响.方法 成年Wistar大鼠72只,体重200～250 g,雌雄各半,随机分为3组(n=24):对照组(C组)、LPS组和二硫代氨基吡咯烷组(PDTC组).LPS组腹腔注射LPS 8 mg/kg;PDTC组尾静脉注射二硫代氨基吡咯烷120 mg/kg,30 min后腹腔注射LPS 8 mg/kg;C组注射等量生理盐水.分别于注射LPS后1、3/6、12 h时,腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠,下腔静脉取血样后处死,开胸取心脏,采用ELISA法测定血清肌钙蛋白T(cTnT)浓度,免疫组化法检测心肌组织Toll样受体4(TLR4)的表达和NF-κB p65的活性;光镜下观察心肌组织病理学结果.结果 与C组比较,LPS组和PDTC组各时点血清cTnT浓度升高,心肌组织TLR4表达上调,NF-κB p65活性升高(P＜0.01);与LPS组比较,PDTC组各时点血清cTnT浓度下降,心肌组织NF-κB p65活性降低,注射LPS后6、12 h时心肌组织TLR4表达下调(P＜0.01),病理学损伤减轻.结论 二硫代氨基吡咯烷可减轻LPS诱发大鼠心肌损伤,其机制可能与抑制心肌组织NF-κB的活性和TLR4的表达有关.     

1，25（OH）2D3对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞维生素D受体及肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1表达的影响

目的 研究脂多糖（LPS）对大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）维生素D受体(VDR)及肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响,从而为1,25（OH）2D3在腹膜透析相关腹膜炎中的应用提供理论依据。 方法 胰蛋白酶消化法原代培养腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组：(1)正常对照组;(2)脂多糖组：不同浓度的脂多糖（1、10、100 mg/L）分别作用6 h;10 mg/L脂多糖分别作用2、6、12 h;(3)1,25（OH）2D3作用组：10 mg/L脂多糖预孵育2 h后,加1,25（OH）2D3(10－8 mol/L、10－7 mol/L、10－6 mol/L)再作用6 h。RT-PCR法检测VDR mRNA的表达;Western印迹法检测VDR蛋白表达;ELISA法检测上清液TNF-α、TGF-β1的表达。 结果 与对照组相比,LPS组RPMC VDR mRNA和蛋白表达均显著下调（均P < 0.05）。与LPS组相比,1,25（OH）2D3组VDR mRNA和蛋白表达均显著上调（均P < 0.01）。LPS组上清液中TNF-α、TGF-β1浓度均显著高于对照组（均P < 0.01）;1,25（OH）2D3组上清液中TNF-α、TGF-β1浓度均显著低于LPS组（均P < 0.01）。 结论 LPS能下调RPMC VDR mRNA和蛋白的表达,上调TNF-α、TGF-β1表达。1,25（OH）2D3可逆转LPS的作用,上调RPMC VDR mRNA和蛋白的表达,并下调TNF-α、TGF-β1表达。VDR对腹膜透析相关腹膜炎具有一定的保护作用,并具有抑制腹膜纤维化的作用。