环氧合酶-2反义寡核苷酸对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用

目的研究COX-2反义寡核苷酸(AS-ODNs)对宫颈癌Hela细胞的抑制作用.方法Hela细胞分以下6组培养:Hela细胞对照组(A),仅用常规培养液培养Opitin-MEM/MEM;正义组(B):加入正义COX-2核苷酸至终浓度10μmol/l+lipofectin+Opitin-MEM;脂质体组(C)lipofectin+Opitin-MEM.每组设4个复孔;反义寡核苷酸转染组(D)设置3个浓度亚组,分别转染AS-ODNs至终浓度为5 μmol/l(D1)、10μmol/1(D2)、15 μmol/l(D3);在转染后24、48、72、96、120小时采用MTT方法检测各组细胞增殖状态,根据测得的OD值画细胞生长曲线.结果(1)与其他组相比,经AS-ODNs的细胞形态和生长状态都有明显改变,可见细胞生长状态差,增长缓慢该组细胞OD值与其它组比较,差异显著(P＜0.01);(2)根据各组细胞的OD值,绘制细胞生长曲线,可见对照组、正义组、脂质体组生长曲线呈明显上升的趋势;AS-ODNs作用的三个亚组则呈下降趋势,且随浓度的增高,细胞生长曲线下降幅度增大,其抑制效果与作用时间有关,转染后48～72小时抑制效果最强,如果不行AS-ODNs补充,120小时抑制效果基本消失.结论COX-2反义寡核苷酸对宫颈癌Hela细胞的增殖具有抑制作用.     

VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及与细胞增殖的关系

目的:研究VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及其对宫颈癌细胞增殖的影响。方法:采用反义技术,脂质体介导VEGF-C反义寡核苷酸转染人宫颈癌Hela细胞。应用荧光定量RT-PCR法、间接免疫荧光标记法,检测转染后细胞内VEGF-C在mRNA、蛋白水平的变化。MTT比色法检测细胞生长的变化。结果:脂质体介导VEGF-C反义寡核苷酸,转染宫颈癌Hela细胞的转染效率大于90％。转染了反义寡核苷酸的反义组VEGF-C在mRNA和蛋白水平上,较未转染组和正义组均明显下降（P<0.05）。MTT法检测转染了VEGF-C反义寡核苷酸的细胞,明显看到反义组细胞的生长受到明显抑制。结论:VEGF-C可影响人宫颈癌Hela细胞增殖,本实验通过抑制VEGF-C,进而可阻断宫颈癌的淋巴转移,为实现靶向性基因治疗的可行性,提供了实验依据。     

Survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察Survivin反义寡核苷酸对SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响.方法：设计合成特异性Survivin 反义寡核苷酸,转染肝癌SMMC-7721细胞,MTT法测定Survivin ASODN对细胞增殖抑制情况的影响,FCM法检测对细胞周期、凋亡及Survivin蛋白表达的影响.结果：Survivin ASODN可抑制SMMC-7721细胞的生长增殖,并呈浓度和时间依赖性.ASODN转染组可诱导SMMC-7721细胞凋亡（P＜0.01）,细胞周期阻滞于G2/M期（P＜0.05）.ASODN转染组Survivin蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）.结论：Survivin ASODN能下调SMMC-7721细胞Survivin表达,并可抑制其增殖并诱导凋亡.     

转染血管内皮生长因子C反义寡核苷酸对子宫颈癌Hela细胞增生和凋亡的影响

目的体外研究脂质体介导转染血管内皮生长因子C（VEGF—C）反义寡核苷酸（VEGF—C,ASODN）对子宫颈癌Hela细胞增生和凋亡的影响。方法实验组将VEGF—CASODN（优化筛选）用脂质体导人Hela细胞,设正义（SODN）和空白对照组进行比较。用荧光显微镜观察转染率,MTT比色法检测细胞增生,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期变化,RT—PCR、Western blotting法检测VEGF—C mRNA和蛋白的表达。结果经脂质体介导可成功将VEGF—C反义核酸转染至子宫颈癌Hela细胞;细胞的增生受到明显抑制,G2／M期细胞比例增多,转染作用48h时凋亡率最高,达（19．39±1．81）％;VEGF—C在mRNA和蛋白水平的表达均明显减少,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论体外转染VEGF—CASODN可在mRNA和蛋白水平下调Hela细胞VEGF—C的表达,阻滞并同步化细胞周期,抑制细胞增生,诱导细胞凋亡。     

CD151对人宫颈癌Hela细胞增殖反应的影响

目的：探讨CD151对人宫颈癌Hela细胞增殖的影响。方法：利用脂质体分别将pcDNA3．1-CD151、pcD—NA3．1-antiCD151和pcDNA3．1-GFP重组质粒转染Hela细胞。Westernblot分析细胞CDl51及核增殖抗原（PCNA）的表达；MTT法检测细胞增殖反应；流式细胞仪分析细胞周期变化。结果：转染pcDNA3．1-CD151与未转染组及转染pcDNA3．1-GFP对照组比较，Hela细胞CD151表达显著上调（P〈0．01）；细胞增殖反应显著提高（P〈0．01）；增殖期S＋G2/M细胞比例增高（P〈0．05）；PCNA表达亦明显增强（P〈0．01）。而转染pcDNA3．1-antiCD151后，Hela细胞CD151表达明显下调（P〈0．01）；细胞增殖反应及PCNA表达明显下降（P〈0．01）；S＋G2／M细胞比例降低（P〈0．05）。结论：CD151的表达对肿瘤细胞的增殖反应起重要作用，通过反义CD151基因干预．可下调细胞中CD151的表达，抑制肿瘤细胞增殖。     

RNAi沉默环氧合酶-2基因对宫颈癌Hela细胞细胞周期影响的实验研究

目的:利用RNA干扰(RNAi)抑制宫颈癌Hela细胞环氧合酶-2(cyclooxygen-ase-2,COX-2)表达研究其对细胞周期的影响。方法:构建特异性COX-2小干扰RNA(siRNA)真核表达载体质粒Pgenesil-COX-2,以脂质体法将其转染至人宫颈癌Hela细胞。转染48h分别用RT-PCR和Western blot方法评价Pgenesil-COX-2对COX-2表达的抑制效应,48和96h时用流式细胞技术检测Hela细胞细胞周期,用RT-PCR方法检测CyclinE的表达变化。结果:转染48h后,Pgenesil-COX-2特异性抑制了Hela细胞COX-2的表达,与对照组比较差异有统计学意义,t=4.496,P=0.002。48及96h流式细胞仪分析显示,转染Pgenesil-COX-2后Hela细胞增殖活性降低,与对照组比较G0/G1期细胞增多,t值分别为3.217和2.495,P值分别为0.011和0.043;S期细胞减少,t=5.978和6.137,P值均为0.000。同时,CyclinE表达降低,t值分别为2.879和8.612,P值分别为0.020和0.000。结论:siRNA真核表达载体可特异性抑制Hela细胞COX-2基因的表达,抑制COX-2表达可能通过下调Cy-clinE的表达使细胞周期阻滞于G0/G1期。     

Survivin反义寡核苷酸抑制EC9706细胞增殖并诱导细胞凋亡

目的 观察Sunrivin反义寡核苷酸(ASODN)对人食管癌细胞系EC9706细胞增殖和凋亡的影响.方法 人工合成Survivin基因反义和正义ODN,并进行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径分别转染 EC9706 细胞;应用 RT-PCR 和 Western Blot 检测 SurvivinmRNA和蛋白表达;应用MTT法检测 Survivin ASODN 对 EC9706 细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率.结果 体外培养的 EC9706 细胞可表达较强的 Survivin mRNA 和蛋白;Survivin ASODN 可呈浓度依赖性地抑制 Survivin mRNA 和蛋白表达,50μmoL/L ASODN 几乎可以完全抑制.MTT 研究结果表明,Survivin ASODN 可呈浓度依赖性地抑制 EC9706 细胞增殖,50μmol/L ASODN 对细胞生长的抑制率可达78.5%,诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M 期.Survivin SODN 对 Survivin mRNA 和蛋白以及 EC9706 细胞的增殖和细胞周期无明显的抑制作用.结论 脂质体介导转染 Survivin 反义寡核苷酸可抑制细胞增殖、诱导细胞G2/M 期阻滞而促进细胞凋亡.     

Aurora A反义寡核苷酸对人肺癌细胞系A549细胞生长与细胞周期的影响

目的：探讨Aurora A基因表达的下调对肺癌细胞生长和细胞周期分布的影响。方法：用脂质体瞬时转染法介导Aurora A反义硫代磷酸寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides,ASODN）处理肺腺癌A549细胞,RT-PCR及Western-blot方法检测Aurora A mRNA和蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期分布的变化,四氮唑盐法（MTT）检测转染前后细胞生长抑制率变化。结果：Aurora A反义寡核苷酸作用于A549细胞后,细胞的生长抑制率在一定范围内呈剂量和时间依赖性,其中48h的IC50值约为300nmol/L,在此浓度和时间下,Aurora A反义寡核苷酸可明显降低Aurora A mRNA和蛋白的表达,且细胞周期阻滞于G2/M期和S期。结论：下调Aurora A表达可抑制肺腺癌细胞系A549的增殖,同时导致细胞阻滞于G2/M期及S期。     

脂质体介导反义C-FLIP对BGC823细胞凋亡的影响

目的：探讨脂质体介导下c-FLIP（Cellular—FLICE Inhibitory Protein）反义寡核苷酸对胃癌细胞系BGC823的作用。方法：RT—PCR和Western Blot方法检测c-FLIPL、c—FLIPs的mRNA和蛋白的表达；MTT法检测细胞抑制率：原位末端标记法、流式细胞术检测细胞凋亡：Western Blot检测蛋白表达变化。结果：c-FLIP基因编码的2种mRNA和蛋白在Hela、BGC823细胞中呈阳性表达。MTT显示脂质体介导反义寡核苷酸可显著抑制BGC823细胞增殖：反义寡核苷酸作用细胞36h后．TUNEL检测可见明显阳性染色，流式细胞分析发现在G1峰前出现凋亡峰；Western Blot可见c-FLIPL和c-FLIPs蛋白表达显著下降。结论：c-FLIPL、c—FLIPs mRNA和蛋白在Hela、BGC823细胞中表达。脂质体介导c-FLIP反义寡核苷酸转染BGC823细胞后抑制目的蛋白表达，抑制细胞生长、促进凋亡．其作用呈剂量依赖性。研究靶向c-FLIP的反义基因治疗药物可能为胃癌的临床治疗提供新的方法和思路。     

Survivin反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:采用survivin反义寡核苷酸(ASODN)封闭骨肉瘤细胞survivin的作用,观察其对骨肉瘤细胞系MG63增殖和凋亡的影响。方法:以脂质体为载体,介导survivin反义寡核苷酸转染人骨肉瘤细胞系MG63,用MTT法测定细胞增殖;流式细胞仪检测转染survivin反义寡核苷酸后细胞凋亡率;Westernblot及半定量RTPCR检测转染survivin反义寡核苷酸后的骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达。结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染骨肉瘤细胞系MG63后,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率明显增加,骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达均明显降低。结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以抑制细胞增殖,有效降低细胞内survivin基因的表达,促进细胞凋亡。     

miR-134-5p 对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制

目的:观察微小核糖核酸-134-5p(miR-134-5p)转染对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响,验证其可能的分子机制.方法:收集湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心2016年5月至8月收治的8名宫颈癌患者肿瘤组织和相应癌旁组织.利用lipo-fectamine 2000将miR-134-5pmimics转染至宫颈癌Hela和SiHa细胞.采用MTT法和集落形成实验检测细胞增殖活性;流式细胞术(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡;qRT-PCR检测宫颈癌组织和细胞miR-134-5pmRNA表达以及宫颈癌细胞EGFR mRNA表达;Western blotting检测宫颈癌细胞EGFR信号通路相关蛋白的表达.结果:宫颈癌组织miR-134-5pmRNA表达显著低于癌旁组织(P＜0.01).和转染miR-NC的Hela和SiHa细胞比较,转染miR-134-5pmimics的宫颈癌Hela和SiHa细胞miR-134-5pmRNA表达显著升高;细胞增殖能力显著降低(转染第5天,Hela细胞:1.06±0.13 vs 1.32±0.07;SiHa细胞:1.12±0.10 vs 1.42±0.12,均P＜0.05);形成的集落数减少;G0/G1期细胞比例显著上升,S期和G2/M期细胞比例显著下降;细胞凋亡率显著增加[Hela细胞:(26.53±13.48)％ vs(3.25±1.74)％;SiHa细胞:(30.49±12.04)％ vs(5.10±2.86)％,均P＜0.05];EGFR mRNA和EGFR蛋白表达显著下调,其中EGFR mRNA,Hela细胞下调58％(P＜0.01),SiHa细胞下调41％ (P＜0.05);EGFR下游靶蛋白p-AKT、p-ERK1/2和CyclinD1蛋白及pEGFR蛋白表达显著下调.结论:miR-134-5p可显著抑制宫颈癌细胞增殖并促进细胞凋亡,其可能的分子机制是通过抑制EGFR基因的表达,抑制EGFR通路的活化.     

地西他滨诱导宫颈癌细胞凋亡分子机制探讨

目的 地西他滨(decitabine, DAC)具有较好的抗肿瘤活性,其分子机制与DNA去甲基化有关,本研究通过DAC对腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposiscoli,APC)基因的表达水平和去甲基化的影响,探讨DAC诱导宫颈腺癌Hela细胞凋亡分子机制.方法 不同浓度的DAC作用于宫颈腺癌Hela细胞24、36和48 h,MTT法检测对宫颈癌细胞的增殖抑制作用,观察DAC对Hela细胞增殖的浓度依赖效应和时间依赖效应.流式细胞术检测DAC对宫颈腺癌Hela细胞凋亡和细胞周期的影响.在DAC作用于宫颈腺癌Hela细胞前后,通过甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR, MSP)检测APC基因的甲基化状态;RT-PCR法检测APC基因mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测APC蛋白、β-catenin蛋白在胞内及核内表达的变化.结果 DAC对宫颈腺癌Hela细胞增殖抑制具有浓度依赖效应和时间依赖效应,Hela细胞半数抑制浓度(IC50) 24、36、48 h 分别为 28.23、7.65和5.64 μmol/L.DAC处理后的宫颈腺癌Hela细胞的凋亡率为(73.82±0.11)%,明显高于对照组的(12.41±0.24)%,P<0.001.DAC处理Hela细胞后,S期细胞比例(47.82±2.57)%和G2期细胞比例(30.87±2.28)%显著高于空白对照组的S期细胞比例(24.08±0.71)%和G2期细胞比例(2.52±0.84)%,P<0.001.DAC处理后,APC基因启动子区域去甲基化状态明显增高,APC mRNA表达量上升,处理前后比较差异有统计学意义,P<0.05.DAC处理后,胞内APC蛋白表达上调,而胞内和核内的β-catenin蛋白表达下调,差异均有统计学意义,P<0.05.结论 DAC可通过对APC基因的去甲基化作用,上调胞内APC蛋白表达,下调胞内和核内β-catenin表达,诱导宫颈癌细胞凋亡.     

鸟氨酸脱羧酶基因沉默抑制宫颈癌细胞生长的研究

目的：探讨鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因作为宫颈癌治疗靶基因的可行性。方法：采用慢病毒介导的RNA干扰技术，沉默Hela细胞ODC基因，建立ODC稳定沉默的细胞系Hela／ODC，用定量RT—PCR和免疫印迹检测ODC的表达水平。用MTT实验、克隆形成实验、细胞倍增时间和细胞周期分析评价ODC基因沉默对Hela细胞生长的影响。结果：Hela／ODC的ODCmRNA和蛋白质表达水平均明显下降，mRNA水平下调93．4％。Hela／ODC的增殖受到明显抑制，细胞倍增时间从22．3h延长到32．0h，细胞周期分析S期细胞增加，G0／G1期和G2／M期细胞显著减少。结论：慢病毒载体介导RNA干扰能够稳定沉默ODC基因表达，从而成功抑制肿瘤细胞的生长，表明以ODC基因为靶基因进行宫颈癌的基因治疗是可行的。     

microRNA-545抑制宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响

【摘 要】目的 探讨microRNA-545（miR-545）在宫颈癌组织及细胞系中的表达情况,并探讨其对宫颈癌Hela细胞生物学行为的影响。方法 采用实时定量PCR（qPCR）检测52例宫颈癌组织、30例宫颈上皮内瘤样变（CIN）组织和25例正常宫颈组织石蜡包埋组织中的miR-545表达水平,分析miR-545表达与宫颈癌临床病理特征的关系,并检测其在宫颈癌细胞株Hela、Siha、CaSki、C33a及宫颈正常上皮细胞中的表达情况。采用miR-545的特异性过表达载体pcDNA6.2／GW／EmGFP-miR-545转染miR-545表达水平最低的宫颈癌细胞（过表达组）,同时设pcDNA6.2/GW/EmGFP-miR空载体组和空白对照组。分析转染后Hela细胞的增殖水平（四甲基偶氮唑盐法）、凋亡情况（流式细胞仪Annexin V／PI双染法）及细胞周期（流式细胞仪PI单染法）。结果 宫颈癌组织中miR-545的相对表达量为0.245±0.051,低于CIN组织的0.761±0.073和正常宫颈组织的1.027±0.024,差异有统计学意义（P＜0.05）,且宫颈癌组织中miR-545水平与临床分期、分化程度及淋巴结转移有关（P＜0.05）;与宫颈正常上皮细胞相比,宫颈癌细胞的miR-545水平均降低,由高到低依次为CaSki、C33a、Siha和Hela细胞;与空载体组和空白对照组相比,转染过表达载体细胞的增殖抑制率、凋亡率及G0／G1期细胞比例均升高,而S、G2／M期细胞比例均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 miR-545在宫颈癌组织和细胞中均为低表达,上调其水平可达到抑制增殖、诱导凋亡和阻滞细胞周期的作用,在宫颈癌防治中具有一定价值。     

辛伐他汀通过调控Chk1基因的表达对宫颈癌细胞增殖、凋亡以及放疗敏感性的影响

目的:探讨辛伐他汀（simvastatin,SVA）通过调控细胞周期检测点激酶1（checkpoint kinase 1,Chk1）基因表达对宫颈癌细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响。方法:体外培养宫颈癌Hela细胞，采用不同浓度（3.25 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)SVA处理细胞，以0 μmol/L SVA为空白组（Con组）。采用MTT法检测SVA对细胞的增殖抑制率，筛选SVA最适浓度（SVA组）用于后续研究。流式细胞术检测各组细胞凋亡率。采用2、4、6、8 Gy剂量X射线照射细胞。将Chk1阴性对照质粒、Chk1 siRNA分别转染至Hela细胞，分别命名为si-NC、si-Chk1组；重组pcDNA 3.1/Chk1基因过表达质粒及空载体对照质粒分转染至SVA组细胞中，分别命名为SVA+pcDNA-Chk1组、SVA+pcDNA组。采用qRT-PCR与Western blot法检测各组细胞中Chk1 mRNA及蛋白表达水平；MTT法检测各组细胞增殖能力；流式细胞术检测细胞凋亡情况；克隆形成实验检测细胞放疗敏感性。结果:随着SVA浓度的增加Hela细胞增殖抑制率明显升高且呈剂量依赖性，SVA浓度为12.5 μmol/L时Hela细胞增殖抑制率约为50%，以此用作后续实验研究。SVA组Hela细胞凋亡率显著高于Con组，且不同剂量X射线照射后Hela细胞存活分数明显降低（P＜0.05）；SVA处理Hela细胞后可显著降低Chk1 mRNA及蛋白表达水平（P＜0.05）；si-Chk1组Hela细胞中Chk1蛋白表达水平及细胞存活分数均显著低于si-NC组（P＜0.05），细胞增殖抑制率及凋亡率均显著升高（P＜0.05）；SVA+pcDNA-Chk1组Hela细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均显著低于SVA+pcDNA组（P＜0.05），细胞存活分数显著升高（P＜0.05）。结论:SVA可通过下调Chk1基因表达进而抑制宫颈癌细胞增殖并促使细胞凋亡，同时能够增强宫颈癌细胞放疗敏感性。