编码EIAV核输出因子蛋白Rev的cDNA克隆和序列测定

ＥＩＡＶ在繁殖过程中涉及到多种转录因子的调节,其中Ｒｅｖ蛋白是病毒编码的转录后调节因子,决定了病毒复制由早期到晚期的过渡。Ｒｅｖ是非结构蛋白,由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用ＥＩＡＶ疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物,在病毒繁殖早期提取细胞总ＲＮＡ,反转录后使用中国ＥＩＡＶ毒株特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆后经过核苷酸序列分析,和与基因组全序列的比较,确定了编码Ｒｅｖ蛋白的病毒基因组转录产物的编码序列和拼接位点。     

马传贫病毒基因组转录图谱的研究

ＥＩＡＶ和ＨＩＶ－１、ＦＩＶ等病毒均属慢病毒属成员,这些病毒在基因组结构、复制的分子机制、抗原漂移及病毒与宿主的相互作用等方面都十分相似。在慢病毒基因转录过程中,首先形成一个与病毒基因组等长的ｍＲＮＡ,然后经过不同方式的拼接,得到长短不一的ｍＲＮＡ,进而出现核表达不同的蛋白。我们知道,慢病毒的基因表达受多种病毒蛋白及细胞核因子的复杂调控,这一过程的改变往往会影响病毒的致病力和繁殖能力。马传贫白细胞弱毒疫苗是目前唯一成功的慢病毒疫苗,因此比较 ＤＬＡ ＥＩＡＶ的拚接位点及拚接方式与其他毒株的异同,对于揭示 ＤＬＡ ＥＩＡＶ致弱的分子机制是十分必要的。本研究首先鉴定了 ＤＬＡ ＥＩＡＶ和 ＤＡ ＥＩＡＶ的几个拼接位点和几个转录产物,将这些拼接位点与已报道毒株相比较,发现 ＤＬＡ ＥＩＡＶ和 ＤＡＥＩＡＶ外显子３上游拼接位点为新发现的位点信号。同时,Ｒｅｖ的靶序列ＲＲＥ的核苷酸序列差异较大。在本研究试验条件下,未克隆到ＤＬＡＥＩＡＶ的１、２、４外显子拼接产物及ＤＡＥＩＡＶ感染动物细胞的１、４外显子拼接产物,这可能由于样品采集时间及病毒体内外繁殖环境差异造成的假阴性结果,但也有一种可能的情况,就是这两个毒株在转录产物的构成或构     

编码EIAV核输出因子蛋白Rev的cDNA克隆和序列测定

EIAV在繁殖过程中涉及到多种转录因子的调节，其中Rev蛋白是病毒编码的转录后调节因子，决定了病毒复制由早期到晚期的过渡，Rev是非结构蛋白，由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用EIAV疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物，在病毒增殖早期提取总RNA，反转录后使用EIAV特异引物扩增病毒基因组拼接产物，将扩增产物克隆后经过核苷酸序列分析，通过与基因组全序列的比较，确定了编码Rev蛋白的病毒基因组转录产物的编码序列和拼接位点。     

EIAV反式激活蛋白(TAT)基因的分子克隆与序列测定

以马传染性贫血病毒 (EIAV)疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物 ,在病毒繁殖期提取细胞总 RNA,反转录后使用特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆、测序并与基因组全序列比较 ,确定了编码 EIAV反式激活蛋白(TAT)的转录产物及阅读框架 ,发现至少有 2种拼接产物编码 TAT。比较 2种阅读框架 ,以保守序列作为模板扩增得到完整的编码 EIAV反式激活蛋白的基因。     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR的克隆及序列分析

从马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）弱毒株感染的驴胎皮肤（ＦＤＤ）细胞中提取前病毒ＤＮＡ，以其为模板，通过ＰＣＲ扩增出ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ，并将其克隆到载体质粒ｐＵＣ１９中。经酶切分析，ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选、鉴定，获得含有ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ片段的重组质粒ｐＬＴＲ。对该质粒的序列分析发现，在中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ的Ｕ３区含有４个与细胞转录因子结合的位点，其中有３个ＰＵ．１位点和１个ＡＰ－１位点，Ｕ３区还存在１个ＴＡＴＡＴＡＡ启动子序列；Ｒ区长为８１ｂｐ，含有１个帽位点ＧＧ和１个Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列ＡＡＴＡＡＡ；在帽位点下游是１个病毒Ｔａｔ蛋白结合位点，即ＴＡＲ位点；Ｕ５区长为３９ｂｐ。中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ序列与国外发表的其他毒株序列相比，在ＬＴＲ的一些调控部位有变异发生，中国ＥＩＡＶ弱毒株与美国ＥＩＡＶ原型株（Ｗｙｏｍｉｎｇ株）ＬＴＲ区核苷酸序列有１８．７２％的差异。     

家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的克隆和序列分析

利用ＰＣＲ方法扩增了家蚕核型多角体病毒苏州株（ＢｍＮＰＶｓｕ）的ＩＥ－１启动子全序列并进行克隆和序列分析，结果表明ＢｍＮＰＶｓｕ的ＢｍＮＰＶｓｕ启动子符合真核生物启动子特点，在其序列中有典型的增强子类似元件、加帽位点、ＴＡＴＡ盒等基序。与ＧｅｎＢａｎｋ报道的其它几种ＮＰＶ病毒基因组中的ＩＥ－１启动子序列进行同源性分析表明ＢｍＮＰＶｓｕ与ＩＥ－１（家蚕核型多角体病毒Ｔ_３株）、ＡｃＭＮＰＶ（首蓿尺蠖核型多角体病毒）、ＯｐＭＮＰＶ（黄衫毒蛾核型多角体病毒）、ＬｄＮＰＶ（舞毒蛾核型多角体病毒）的同源性分别为９９．５％、９６．４％、６６．２％和５０．２％。根据各ＮＰＶ基因组中ＩＥ－１启动子序列分析了几种ＮＰＶ的进化关系。     

马传染性贫血野毒辽宁株前病毒全基因组核苷酸序列测定

采取马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）辽宁野毒株（Ｌ株）感染马的血液,分离白细胞。提取白细胞中的ＤＮＡ,并以此为模板,利用ＰＣＲ技术分四个片段扩增 ＥＩＡＶ前病毒 ＤＮＡ。将其分别克隆到载体质粒 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ中,经酶切鉴定后测序。对测序结果分析、拼接,得到 ＥＩＡＶ　 Ｌ株前病毒基因组全序列。     

减蛋综合征病毒pVⅢ基因和E3区序列测定及结构分析

克隆了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国分离株基因组ＨｉｎｄⅢ－Ｅ片段，并分析了其核苷酸序列。该片段位于基因组中央５８．７～６８．９物理图谱单位（ｍｕ），片段全长共３１９４ｂｐ。其中含有１个完整的和２个不完整的开放性读码框架（ＯＲＦ），分别编码ｐＶⅢ蛋白、１００Ｋ蛋白基因Ｃ端和纤维蛋白Ｎ末端部分。ｐＶⅢ蛋白基因由７５３个碱基（ｎｔ）组成，编码２５０个氨基酸（ａａ），编码产物的分子量为２８５００。氨基酸水平的同源性比较表明，ＥＤＳＶ的ｐＶⅢ蛋白与禽腺病毒１型（ＦＡＶ１）及人和其他动物腺病毒ｐＶⅢ蛋白的同源性为２８％～３６％，而与羊腺病毒（ＯＡＶ）的同源性高达５２％，提示ＥＤＳＶ与ＯＡＶ间的亲缘关系更近。按照人腺病毒基因组结构的特征，在ｐＶⅢ和纤维蛋白基因之间，应为Ｅ３区，但该序列只有２４５个ｎｔ组成，序列中保留了ＴＡＴＡＢｏｘ和ｐｏｌｙＡ信号。但除了２个仅编码４９ａａ和３２ａａ多肽的ＯＲＦｓ外，不编码任何产物，且核苷酸序列与其他腺病毒的Ｅ３区无同源性，证实此区无明显Ｅ３区样结构。     

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒株LTR启动子功能的研究

为了证明我国马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）驴白细胞弱毒株的长末端重复序列（ＬＴＲ）是否能够启动基因的表达,我们将该ＬＴＲ克隆于含ＣＡＴ基因的载体中,获得重组质粒ｐＣＡＴ－ＬＴＲ,用ｐＣＡＴ－ＬＴＲ分别转染驴胎皮肤细胞（ＦＤＤ）、胶质母细胞瘤（ＴＪ－９０５）细胞、驴白细胞及接种ＥＩＡＶ弱毒的ＦＤＤ及驴白细胞,结果以ＥＩＡＶ弱毒的ＬＴＲ为启动子,ＣＡＴ在这几种细胞中均获得了不同程度的表达,证实了我国ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ在ＦＤＤ、ＴＪ－９０５及驴白细胞中确实具有一定的启动子功能,并能被反式激活表达,为进一步研究ＥＩＡＶ弱毒复制及表达调控奠定了基础。     

鸡痘病毒282E4株基因组2.9 kb Bam HI片段的序列测定与分析

对我国鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ４株基因组２．９ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ片段进行了序列测定与分析。结果表明,该片段全长２９２３ｂｐ,Ａ＋Ｔ含量为７２．０８％,含６个完整的开放读码框架（ＯＲＦ）和２个不完整的ＯＲＦ,最大的ＯＲＦ所编码多肽的相对分子质量为２４６００。在２个ＯＲＦ在上游存在痘苗病毒晚毒启动子的保守序列ＴＡＡＡＴ,在６个ＯＲＦ的下游和２个ＯＲＦ的编码区内存在痘苗病毒早期转录终止信号Ｔ５ＮＴ。把     

马传染性贫血病病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶ　 ＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ,这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组,ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接,获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组质粒,将其命名为ｐ８．０。将此８．０Ｋｂ ＥＩＡＶ全基因再亚克隆到含有一完整 ＥＩＡＶ ＤＬＡ株长末端重复序列的质粒中,获得一含有 ＥＩＡＶ驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒,将其命名为ｐ８．２,经核苷酸序列分析,证明ｐ８．２含有ＥＩＡＶ前病毒的全基因。用ｐ８．２转染驴白细胞,将其作为种毒进行传代,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶,说明在驴白细胞中由ｐ８．２衍生出了ＥＩＡ病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后,第４天出现病变,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子,进一步证明ｐ８．２具有感染性,我们获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆,为进一步在分子水平上阐明我国ＥＩＡＶ疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础。     

Differential responses of Equus caballus and Equus asinus to infection with two pathogenic strains of equine infectious anemia virus

Most in vivo studies with equine infectious anemia virus (EIAV) have been performed in horses and ponies (Equus caballus) with little published information available detailing the clinical responses of donkeys (Equus asinus) to infection with this virus. Consequently, donkeys were inoculated with two strains of EIAV (EIAV(PV) and EIAV(WY)) which have been documented to produce disease in E. caballus. Four ponies, 561, 562, 564 and 567 and two donkeys, 3 and 5 were infected with EIAV(PV) and one horse (94-10) and one donkey (4) were infected with EIAV(WY). Although the horse and ponies all experienced clinical signs of disease, which in some cases were severe, the donkeys remained asymptomatic throughout a 365-day observation period, except for mild transient reductions in platelet counts. The results from serological assays, virus isolation from plasma and detection of plasma-associated viral RNA by RT-PCR, indicated that initial replication of EIAV(PV) and EIAV(WY) was lower in donkeys than in horses and ponies. This conclusion was confirmed using competitive RT-PCR, in which viral RNA levels in the plasma of EIAV(PV)-infected ponies was up to 100,000-fold higher than in infected donkeys during the first 20 days post-infection (dpi). Similar results were obtained in the EIAV(WY)-infected animals, in which viral RNA burdens in the donkey at 20 dpi were 1000-fold less than in the horse. However, infection of donkey and horse monocyte-derived macrophage cultures with EIAV(PV) demonstrated that these cells in vitro were equally susceptible to virus-induced cytopathic effects and yielded similar levels of progeny virus. This result suggests that factors other than host cell permissiveness mediate the clinical differences observed between horses and donkeys infected with EIAV(PV) or EIAV(WY).     

带有组氨酸标签的马传染性贫血病毒感染性分子克隆的构建

马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题.本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入NspV位点,获得带有组氨酸标签的重组质粒pOK8266-HIS.将pOK8266-HIS转染驴白细胞,将驴白细胞转染产物传至第6代时,在电镜下观察到了典型的马传染性贫血病毒粒子.提取pOK8266-HIS衍生病毒的前病毒基因组DNA,通过PCR扩增和测序表明,衍生病毒基因组中引入了6个组氨酸标签,从而获得了带有分子标志的马传染性贫血弱毒疫苗株,为野毒株和疫苗病毒的鉴别诊断奠定了基础.本研究还证明了S2基因中的插入突变并不影响马传染性贫血病毒的体外复制.     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株跨膜蛋白主要免疫决定区基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码跨膜蛋白主要免疫决定区(TMIR)的基因，并在大肠杆菌中进行了表达。所表达的融合蛋白有一部分是可溶的，其氨基端带有6个组氨酸的标签，因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。在间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验中，重组的TMIR蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应，而与健康马血清无任何反应。这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性，可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制、接种马体内免疫应答及马传贫诊断的研究。     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株基质蛋白基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码基质蛋白（p15)的基因，并在大肠杆菌中进行了表达，所表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白，其氨基端带有6个组氨酸的标签，因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化，在间接ELISA和免疫印迹试验中，重组的基质蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应，而与健康马血清无任何反应，这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性，可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体人免疫应答的研究中。     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR点突变型嵌合感染性克隆的构建

马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）长末端重复序列（Long terminal repeat,LTR）是基因组中高度变异区之一,EIAV LTR的变异对于指导病毒的复制和病毒致病性具有重要的生物学意义。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,由马传贫强毒至弱毒致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,以驴胎皮肤弱毒株疫苗全长感染性克隆pLGFD3-8为父本,选取LTR R区的TAR起始碱基,poly（A）附加位点,采用反向遗传操作对其位点进行PCR体外定点突变,将弱毒序列构建的逆向点突变型全基因克隆转染到驴胎皮肤细胞（FDD）并在FDD上传代,通过逆转录酶活性（RT）检测、RT-PCR方法及real-time RT PCR检测并验证其感染性。检测结果为构建的逆向点突变型感染性克隆在FDD上被拯救,其衍生病毒感染的FDD上出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性;电镜下可见大量典型的EIAV颗粒pLGFD-M点突变型嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8复制水平相似。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。     

Scanning and transmission electron microscopic study of equine infectious anemia virus.

Scanning and transmission electron microscopy were used to study in detail the morphogenesis and replication of equine infectious anemia virus (EIAV) in cultured, persistently infected equine fetal kidney fibroblasts. The EIAV was shown by thin-section electron microscopy to resemble morphologically more closely the members of the genus Lenti-virus in the family Retroviridae than other genera. Scanning electron microscopy demonstrated budding virus on only about 5% of the equine fetal kidney fibroblasts; however, the entire surface of these cells was involved in viral replication. Except where virus budding was observed, EIAV-infected cells were smooth and free of the topographic surface alterations characteristic of cells transformed by type C retroviruses. The morphologic relationship of EIAV and pathologic manifestations of EIAV infection to those of other Retroviridae are discussed.