低氧诱导因子-1α反义寡核酸联合化疗对Hep-2细胞的影响

目的 探讨应用反义寡核苷酸抑制低氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞(简称Hep-2细胞)化疗敏感性的影响.方法 体外培养Hep-2细胞,脂质体介导反义寡核苷酸转染6h,给予化疗药物顺铂低氧培养24 h后,RT-PCR方法检测HIF-1...     

缺氧诱导因子1α反义寡核苷酸对喉鳞状细胞癌的放疗增效作用

目的探讨缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）反义寡核苷酸结合放射对人喉鳞状细胞癌（简称喉癌）裸鼠移植瘤生长抑制敏感性的影响。方法对25只裸鼠建立喉癌裸鼠模型,分为5组：A组（正义放疗）、B组（反义放疗）、C组（空脂质体放疗）、D组（放疗）和E组（空白对照）,治疗期间每3 d测量1次鼠重、瘤体最大长径及最大垂直径,治疗21 d后将实验鼠脱颈处死,瘤体称重后应用流式细胞仪、免疫组化观察抑瘤、凋亡情况及相关蛋白表达。结果反义放疗组瘤重（1.037±0.106）g明显低于其余4组（P〈0.05）,抑瘤率（50.21±8.10）%和凋亡率（34.52±4.159）%明显高于其余4组（P〈0.05）。免疫组化PV法染色显示：HIF-1α正义放疗组胞浆有大量棕色颗粒沉积着色,而反义放疗组表达较少;正义放疗组p53表达于胞核呈棕色颗粒浓染,而反义放疗组表达较少;VEGF正义对照组胞浆有大量棕色颗粒沉积着色,而反义放疗组表达较少。流式细胞仪检测结果显示：反义放疗组的HIF-1α、p53、VEGF蛋白表达的荧光指数（fluorescen-ceindex,FI）分别为0.98±0.28、2.13±0.03、1.09±0.36明显低于其余4组（P〈0.05）。结论 HIF-1α反义寡核苷酸结合放疗可以抑制喉癌异体移植瘤的生长,增加肿瘤细胞凋亡率,其机制之一可能是HIF-1α的下调降低了喉癌组织中p53、VEGF的蛋白表达,因此HIF-1α反义寡核苷酸增加喉癌对放疗的敏感性。     

干扰素α-1b抑制裸鼠肝异位鼻咽癌种植瘤生长和转移的研究

目的 观察干扰素α-1b对裸鼠肝异位鼻咽癌细胞株CNE-2种植瘤生长和转移的作用并探讨其机理;比较重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体介导干扰素α-1b(interferon-α-1b,IFN-α-1b)基因治疗与IFN-α-1b蛋白治疗的优势.方法 鼻咽癌细胞株CNE-2裸鼠肝包膜下注射,建立裸鼠肝脏鼻咽癌异位种植瘤动物模型;采用随机数字表法将40只裸鼠随机分为A～D组,每组10只;24 h后分别经尾静脉注射.A组:重组腺相关病毒携带人IFN-α-1b(rAAV-IFN-α-1b),C组:重组腺相关病毒携带增强型绿色荧光蛋白基因(rAAV-EGFP),D组:磷酸缓冲液;建模5 d后B组:皮下注射人IFN-α-1b,1次/隔日;3周后每组随机取5只裸鼠断髓处死,观察肝脏成瘤、肺转移及生存期情况,测量肿瘤体积大小,计算抑瘤率,原位末端标记法检测肿瘤细胞凋亡指数;高效液相芯片技术检测外周血中人IFN-α、小鼠IL-12的含量,另5只裸鼠观察生存期.结果 肝脏鼻咽癌异位种植瘤3周后,肿瘤平均体积((x)±s)分别为A组(0.114±0.116)cm3、B组(0.422±0.137)cm3、C组(2.476±0.637)cm3、D组(2.677±0.704)cm3,组间比较差异有统计学意义(F=38.536,P＜0.01);相对对照D组,A组和B组抑瘤率分别为95.74%、84.24%;A、B、C、D组肺转移率分别为0.0%、0.0%、40.0%、60.0%;凋亡平均指数分别为(21.88±3.29)%、(19.85±1.96)%、(4.37±0.50)%、(3.40±1.05)%,组间比较差异有统计学意义(F=120.964,P＜0.01);血清中人IFN-α平均含量分别为(101.50±11.33)pg/ml、(91.55±9.80)pg/ml、(23.06±4.36)pg/ml、(16.93±9.96)pg/ml,组间比较差异有统计学意义(F=69.128,P＜0.01);IL-12平均含量分别为(80.36±13.35)pg/ml、(51.15±9.72)pg/ml、(19.44±7.03)pg/ml、(14.49±4.21)pg/ml,组间比较差异有统计学意义(F=57.116,P＜0.01);平均生存期分别为(55.80±2.77)d、(48.20±2.39)d、(35.40±2.61)d、(36.80±1.92)d,组间比较差异有统计学意义(x2=25.623,P＜0.01).结论 IFN-α-1b能有效抑制裸鼠肝异位鼻咽癌细胞株CNE-2种植瘤生长和转移,重组腺相关病毒介导IFN-α-1b基因治疗效果优于IFN-α-1b蛋白.     

XIAP反义寡核苷酸对hep-2细胞放射治疗的增效作用

目的:通过XIAP反义寡核苷酸转染hep-2细胞株,观察细胞增殖、凋亡及放疗反应。方法:体外培养人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株,脂质体介导反义寡核苷酸转染,6h后4Gyγ射线照射。24h后RT-PCR检测XIAPmRNA表达,流式细胞仪检测蛋白水平及凋亡率,MTT检测细胞存活情况。结果:各浓度的反义寡核苷酸转染组hep-2细胞形态改变,MTT结果为细胞凋亡率随剂量增加而增高。800nmol/LXIAP反义寡核苷酸转染,使XIAPmRNA表达下调,蛋白表达下降,细胞凋亡率增加(P<0.05);4Gy照射后反义寡核苷酸转染组蛋白表达下降明显,较对照组细胞凋亡率增加,细胞存活率明显下降(P<0.05)。结论:XIAP反义寡核苷酸转染hep-2细胞株能够降低蛋白表达,促进细胞的凋亡并能提高对放疗的敏感性。     

HIF-1α反义寡核苷酸对喉鳞状细胞癌hep-2细胞放疗的增效作用

目的：通过HIF-1α反义寡核苷酸转染hep-2细胞株，观察细胞凋亡及对放疗的反应情况。方法：体外培养人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株，脂质体介导反义寡核苷酸转染，6h后4Gy7射线照射。低氧培养24h后RT—PCR检测HIF-1α mRNA表达，流式细胞仪检测HIF-1α蛋白水平及细胞凋亡率，MTT检测细胞存活情况。结果：低氧使人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株对放射的敏感性下降；低氧并未影响HIF-1αmRNA的表达，HIF-1α蛋白在低氧6h时表达已开始升高，低氧36h时达高峰，之后表达逐渐下降；放射刺激对HIF-1α蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）；各浓度的反义寡核苷酸转染组降低HIF-1α的转录及蛋白水平；MTT结果显示随反义核苷酸浓度增高，其增殖抑制效应越强（P〈0．05），正义对照核苷酸及脂质体对照没有显著的抑制效应（P〉0、05），但转染浓度在400nmol／L以上时，正义对照也表现出一定的增殖抑制作用（P〈0．05）；放疗后反义寡核苷酸转染组蛋白表达下降明显，较对照组及单纯放射组细胞凋亡率增加（P〈0．01）。结论：低氧环境下人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株对放射有抵抗作用，这种抵抗作用与低氧时HIF-1α蛋白表达上调有关，而放射本身并未上调HF-1α蛋白的表达；HIF-1α反义寡核苷酸转染hep-2细胞株能够降低HIF-1α蛋白表达，提高低氧环境下人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株对放疗的敏感性。     

Re1A反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的:探讨Re1A反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法:设计Re1A反义寡核苷酸序列,转染Hep-2细胞后在不同的时间点行MTT检测瘤细胞生长抑制情况,取转染48 h的Hep-2细胞行克隆形成实验,应用RT-PCR和Western blot检测RelA mRNA和蛋白的表达.结果:MTT显示转染Re1A反义寡核苷酸可明显抑制Hep-2细胞的增殖,随时间延长抑制率升高,与对照组比较差异有统计学意义.克隆形成实验显示Re1A反义寡核苷酸的Hep-2细胞克隆形成率明显低于对照组,与对照组比较差异有统计学意义.RT-PCR和Western blot结果显示Re1A反义寡核苷酸分别在mRNA和蛋白水平显著抑制RelA基因表达.结论:Re1A反义寡核苷酸可抑制Re1A的mRNA和蛋白的表达,并抑制Hep-2细胞增殖和克隆形成.     

Stat3反义寡脱氧核苷酸在体外诱导喉癌细胞凋亡

目的:探讨Stat3反义寡核苷酸对人喉癌Hep-2细胞株细胞凋亡的影响。方法:设计Stat3反义寡核苷酸序列,应用脂质体瞬时转染法转染人喉癌Hep-2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测Stat3及p-Stat3的表达;MTT实验检测Stat3反义寡核苷酸对转染细胞的抑制情况,应用DNA ladder、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)及流式细胞术检测细胞凋亡水平和形态变化。结果:Western blot和RT-PCR结果显示Stat3反义寡核苷酸分别在蛋白及mRNA水平显著抑制Stat3基因表达,并在蛋白水平抑制p-Stat3表达;转染Stat3反义寡核苷酸的喉癌细胞增殖明显受到抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);DNA ladder、AO/EB及流式细胞术证实Stat3反义寡核苷酸在体外可抑制Stat3基因表达并诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡,且呈现浓度依赖性。结论:Stat3对喉癌细胞的过度生长、增殖起一定作用,Stat3反义寡核苷酸能够诱导喉癌细胞凋亡,抑制其增殖。     

FA-MNP-MMP-9-ASODN复合物构建及其分子靶向研究

目的:构建叶酸(FA)分子靶向载基质金属蛋白酶9(MMP-9)反义寡核苷酸(ASODN)磁性纳米复合物(FA-MNP-MMP-9-ASODN),研究该复合物对叶酸受体(FR)阳性鼻咽癌的靶向能力及基因转染效率。方法:采用课题组前期制备的FA靶向磁性纳米载体,通过醛基与氨基缩合反应与MMP-9-ASODN偶联,制备FA-MNP-MMP-9-ASODN,采用琼脂糖凝胶电泳分析寡核苷酸与载体的偶联。通过分析荷HNE-1及CNE-2瘤裸鼠的MRI,和铁染色、透射电镜结果研究该2种细胞及瘤块吞噬纳米复合物情况以及观察细胞内FITC分析该载体的基因转染。结果:电泳结果显示ASODN已成功连接在FA靶向磁性纳米载体上。HNE-1细胞能有效摄取该纳米复合物,细胞内见较多FITC,而CNE-2细胞不能摄取该纳米复合物,细胞内未见FITC。HNE-1瘤块也能有效地吞噬该纳米复合物。结论:成功构建FA-MNP-MMP-9-ASODN纳米复合物,具有良好的FA分子靶向性及基因转染效率。     

Stat3反义核苷酸通过调节凋亡相关因子诱导喉癌细胞凋亡

目的:探讨反义Stat3基因诱导喉癌细胞凋亡的机制。方法:将设计好的已证实能诱导人喉癌细胞凋亡的Stat3反义寡核苷酸序列,应用脂质体瞬时转染法转染人喉癌Hep-2细胞,应用Western blot、PCR检测Hep-2细胞中Bcl-2,Bax及C-Myc基因及蛋白的表达情况。结果:Western blot和RT-PCR结果显示转染Stat3反义寡核苷酸细胞组,Bax的表达随反义寡核苷酸浓度增加,表达增强,而Bcl-2及C-Myc的表达则减弱。结论:反义Stat3寡核苷酸通过上调Bax,下调Bcl-2及C-Myc基因表达来参与其诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡的过程。     

hTR反义寡核苷酸诱导鼻咽癌细胞凋亡的研究

目的：探讨人端粒酶反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞凋亡的作用。方法：脂质体介导反义寡核苷酸转染鼻咽癌ＨＮＥ１细胞株,采用吖啶橙荧光染色计数,透射电镜观察ＨＮＥ１细胞凋亡改变。结果：反义寡核苷酸转染ＨＮＥ１细胞４８小时后,ＨＮＥ１细胞形态出现改变,细胞娄减少。吖啶橙荧光染色计数及透射电镜分别发现,反义寡核苷酸组较对照组有更多的调亡细胞及更高的调亡指数。结论：针对端粒酶ＲＮＡ的反义寡核苷酸能有效地通过抑制端粒     

XIAP反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞化疗增敏作用的研究

目的 通过X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASODN)转染喉癌Hep-2细胞,探讨其对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响.方法 体外培养人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,应用脂质体法进行XIAP ASODN基因转染,荧光显微镜下观察计算转...     

双重氧化酶1引起变应性疾病发生机制的初步研究

目的 探讨双重氧化酶-1 (dual oxidase-1,DUOX-1)在人气道上皮细胞(human bronchial epithelial cell)中导致气道高反应性的机制.方法 选择正常培养的人气道上皮细胞分为健康对照组、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激组、甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin,M-β-CD)+ TNF-α处理组、地昔帕明(desipramine,DES)+TNF-α处理组、二亚苯基碘(diphenylene iodonium,DPI)+TNF-α组、夹竹桃麻素(apocynin,APO)+TNF-α组.利用TNF-α作为刺激因素,采用蔗糖梯度离心的方法提取脂筏并应用免疫蛋白印记方法分析各组细胞膜上DUOX-1的含量;利用激光共聚焦显微镜观察细胞膜上DUOX-1的表达,同时观察其与脂筏标记蛋白霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit,CTXB)和神经酰胺(ceramide)的共定位现象;用活性氧试剂盒检测细胞内活性氧的生成.采用Sigmastat 3.02软件进行统计学处理.结果 ①活性氧的生成,对照组:l.00±0.00;TNF-α组:1.95±0.16;M-β-CD+TNF-α组:0.91±0.16; DES+ TNF-0组:1.49 ±0.20;DPI+TNF-α组:1.03±0.16;APO+ TNF-α组:1.47±0.26;六组差异有统计学意义(F=3.83,P＜0.05).②DUOX-1蛋白的含量,对照组:0.21 ±0.02;TNF-α组:0.49±0.04;M-β-CD+TNF-α组:0.08±0.02;DES+TNF-α组:0.09±0.03;差异有统计学意义(F=3.96,P＜0.05).③DUOX-1蛋白荧光值,对照组:1.72±0.21;TNF-α组:8.11±1.23;M-β-CD+ TNF-α组:1.51±0.32,DES+TNF-α组:1.43±0.11;差异有统计学意义(F =4.87,P＜0.05).④DUOX-1蛋白基因检测,对照组:1.00±0.00;小胞浆RNA(small cytosol RNA,ScrRNA)+TNF-α组:1.75±0.04;DUOX-1ScrRNA+TNF-α组:1.15±0.02;差异有统计学意义(F=4.19,P＜0.05).结论 TNF-α可以引起气道上皮细胞内DUOX-1在脂筏中的含量增加,并导致该酶的激活,从而致气道上皮细胞活性氧产生增加,引起气道高反应性,可能导致变应性疾病的发生;酸性鞘磷脂酶抑制剂DES可以抑制上述过程,说明这一过程可能依赖于脂筏来源的神经酰胺.     

反义Stat3基因诱导喉癌细胞凋亡的线粒体机制探讨

目的:探讨Stat3反义寡脱氧核苷酸转染人喉癌Hep-2细胞株后,细胞内线粒体的改变,为阐明喉癌细胞凋亡的机制奠定一定的理论基础,为临床上喉癌的治疗开辟一条新思路。方法:将设计好的Stat3反义寡核苷酸序列(ASODN),应用脂质体转染法以不同浓度转染人喉癌Hep-2细胞,并设空白组(MOCK)及正义对照组(SODN)作为比较,检测各转染组Hep-2细胞中线粒体膜电势、电压依赖性阴离子通道(VDAC)以及Cyt-c,以判断线粒体的变化。结果:随着ASODN浓度的增加,线粒体膜电势降低,VDAC逐渐增加,Cyt-c释放逐渐增多。结论:在Stat3影响人喉癌Hep-2细胞凋亡的机制中,线粒体途径发挥了作用。初步阐明Stat3影响喉癌细胞增殖的调控机制,为临床治疗提供了新的研究靶点。     

胆碱能和C纤维在前列腺素和组胺所致粘膜纤毛活动改变中的作用

作者利用光电技术研究了前列腺素(PG)和组胺使活体免上颌窦粘膜纤毛活动兴奋时是否有胆碱能纤维和C纤维参与。实验动物分5组,乌拉坦麻醉后在上颌窦前壁钻孔,通过光电检测窦腔粘膜的纤毛运动,经上颌窦营养动脉进行插管给药。1组:5+5只兔,注入阿托品(0.2mg/kg)前2分钟及注入后分别给PGE_1(0.1μg/kg)或PGF_2α(10μg/kg),对照组动物在用阿托品前至少30分钟只给PGE_1     

HNP1基因转染对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长影响的实验研究

目的:观察人α-防御紊HNP1基因对人鼻咽癌细胞株HNE-1生长的影响,探讨其在裸鼠鼻咽癌移植瘤生长中的作用.方法:HNP1基因通过脂质体介导转染人鼻咽癌HNE1细胞株,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观察对HNE-1细胞的细胞毒性作用,将筛选的含pcDNA3.1( )-HNP1质粒的HNE-1细胞和空pcDNA3.1( )质粒的HNE-1细胞以及单纯的HNE-1细胞培养、收集后分别注射于8周龄雌性BALB/c裸鼠的右侧腹壁皮下,观察肿瘤生长速度,免疫组织化学检测α-防御素1在肿瘤组织中的表达.结果:HNP1基因转入鼻咽癌HNE-1细胞后能成功地表达有活性的α-防御素1,MTT实验证实有细胞毒作用,转染HNP1基因组裸鼠较对照组肿瘤生长速度慢,体积小.结论:通过转基因方法能表达有活性的α-防御素1并能抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生长.