Accutase和胰蛋白酶消化传代对人胚纹状体来源神经干细胞凋亡的影响

目的探讨Accutase和胰蛋白酶消化神经干细胞(NSCs)后对其凋亡过程的影响。方法来自人类12~16周自然流产胚胎纹状体组织,分离并体外培养NSCs,将体外培养的第3~5代神经球,分别用胰蛋白酶、Accutase消化,消化过程中仅振荡打散,避免巴斯德吸管反复吹打。将神经球打散成的单细胞悬液接种。用Annexin V/碘化丙啶染色、Hoechst 33342活细胞染色镜下观察等方法,在培养传代后2和24 h时间点检测神经干细胞凋亡率。结果两种酶消化后立即用台盼蓝染色判断细胞活性,Accutase消化后活细胞比例为(91.65±4.43)%,胰蛋白酶仅有(83.10±6.76)%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。体外培养的第3~5代人胚纹状体NSCs形成的神经球传代后2 h,Accutase和胰蛋白酶传代的细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.01),而到24 h时间点,Accutase消化的细胞凋亡率经Annexin V/碘化丙啶、Hoechst 33342活细胞染色两种方法检测已经达到50%,而胰蛋白酶消化后的细胞凋亡率在此时间点维持在15%~20%。Accutase消化后的NSCs生长4 d后,克隆形成率和神经球直径分别为(7.83±1.32)%和(43.5±9.76)μm,均显著低于胰蛋白酶传代组的(19.22±3.66)%和(58.4±18.73)μm(P<0.01)。结论虽然台盼蓝染色显示Accutase消化神经球后的细胞存活比胰蛋白酶更多,但消化后24 h内,Accutase消化的细胞凋亡率显著升高,最终神经球新克隆形成率低,直径更小。胰蛋白酶消化振荡打散神经球后的凋亡率较Accutase具有明显优势;神经球消化后台盼蓝即时染色的结果不足以预示后期NSCs凋亡率。     

神经干细胞的培养观察及鉴定

目的：建立一个稳定的神经干细胞系．方法：从孕12～16d小鼠胚胎脑内分离纹状体，吹打消化为单细胞悬液，于DMEM／F12(1：1)培养基(含有bFGF，EGF和N2添加剂)中培养．通过MTT法检测细胞活性，并绘制生长曲线．采用免疫荧光法观察神经干细胞nestin的表达情况和其分化的子代细胞NSE及GFAP等的表达情况．结果：原代分离培养4～6d后，培养基内可见神经克隆球，分散克隆球所获的单细胞继续培养可以重新生成克隆球．新生克降球细胞呈nestin阳性，传代入含血清的培养基后可以分化为NSE和GFAP阳性细胞．结论：所获新生克隆球细胞是神经干细胞．     

胚胎神经干细胞的分离和培养

目的：分离培养胚胎神经干细胞,探讨神经干细胞的取材方法。方珐：在解剖显微镜下,从孕11d(E11d)大鼠胚胎剥离神经管,剪成组织块进行培养,同时取部分神经管经胰酶消化后,获取细胞悬液进行单细胞培养;于培养后不同时间观察细胞的生长状况。结果：在组织块培养和单细胞培养中,接种细胞均生长良好;体外培养5d时,从组织块边缘放射状生长、迁移出细胞,并伸出突起;单细胞培养中,细胞增殖成团并长出突起连成网状。结论：组织块和单细胞培养法均可以从胚胎神经管分离、培养神经干细胞。     

体外培养神经干细胞球的离散:一种安全有效的方法

目的:探讨一种安全有效地对体外培养神经干细胞球进行离散的方法.方法:采用常规胰蛋白酶消化、单纯巴斯德吸管吹打、滤网研磨、控制神经球体积的胰酶短时消化4种方法,比较其各自的离散效果和离散后细胞存活情况.结果:胰酶消化较长时间虽然可以得到单细胞但是细胞难以存活,单纯巴斯德吸管吹打不能完全离散神经球,不锈钢滤网研磨细胞损伤大,存活率低下,而采用控制神经球体积结合胰蛋白酶短时消化可以轻易获得单细胞并且细胞存活率明显高于其他方法(93.2%,P<0.05).结论:控制神经球体积的胰酶短时消化法是离散神经干细胞球的一种安全有效的方法.     

酵素-Ⅱ分离人神经干细胞球

目的：寻找一种有效分离神经干细胞球并获得大量单个神经干细胞的方法。方法：取20周胎龄人胚胎脑组织分离单细胞,应用DMEM／F12培养基培养形成神经干细胞球,取神经干细胞球,分别以2．50g／L、1．25g／L胰蛋白酶及0．6u／ml、1．2u／ml、1．8u／ml、2．4u／ml酵素-Ⅱ(DispaseⅡ)消化,观察消化过程及细胞形态,对消化后的单个细胞进行培养,观察细胞生长情况,并进行免疫细胞化学染色鉴定。结果：各浓度DispaseⅡ均能较完全地消化神经干细胞球,其中1．2u／ml、1．8u／ml DispaseⅡ消化后的细胞生长状况最佳。胰蛋白酶消化后细胞有较大的损伤,成活细胞少。消化后的细胞Nestin抗体染色结果( ),证实为神经干细胞。结论：一定浓度的DispaseⅡ消化神经干细胞球后,可获得大量成活单个神经干细胞。     

大鼠肠神经干细胞分离和体外培养的初步研究

目的:探索和建立大鼠肠神经干细胞分离与体外培养的方法.方法:取胎龄20 d的SD大鼠肠道,剥取含有肌间神经丛的外纵肌,并以胶原酶消化,获得单细胞悬液;接种单细胞悬液到改良的肠神经干细胞培养液,置于37℃、5%CO2培养箱内常规培养,待神经球出现后进行免疫学鉴定,并观察培养细胞的部分生物学特性.结果:培养第2天有细胞集落形成,第10天左右出现肠神经球;免疫细胞化学染色显示Nestin阳性,已分化的肠神经球免疫双染示TUJ-1、GFAP阳性.结论:初步建立了肠神经干细胞分离与体外培养方法,为下一步肠神经干细胞的移植应用奠定基础.     

染色体和遗传

060052单细胞克隆人胚胎干细胞系的建立及其生物学特性的鉴定/彭红梅…∥中华妇产科杂志.—2005,40(8).—521~524建立单细胞克隆人胚胎干细胞系,并对其生物学特性进行鉴定。方法:采取分离自人囊胚内细胞团并传代20代的细胞,用胰酶消化将细胞分散成单细胞悬液,将单个细胞接种至9     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的探索人胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法采用机械方法从流产的10～18周胎龄的人胚胎前脑分离神经干细胞,用无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激细胞增殖,进行体外扩增、传代培养.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果从人胚胎前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养.神经细胞球用特异性的鼠抗人巢蛋白(nestin)抗体鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论从人胚胎前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

神经干单细胞获得的一种方法

目的寻找一种有效获得神经干细胞单细胞的方法。方法运用胰蛋白酶，EDTA和不同浓度酵素对人胚神经干细胞球进行消化，免疫细胞化学染色鉴定及其分化。结果运用一定浓度的酵素可以获得大量成活的单个神经干细胞。而运用胰蛋白酶，EDTA消化后成活细胞少。结论运用一定浓度的diapase消化神经干细胞球是可获得大量成活的神经干细胞单个细胞的方法。     

胚胎小鼠神经干细胞的培养和诱导分化

目的 探索体外培养和诱导分化胚胎小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法 .方法分离12.5 d ICR小鼠胚胎的大脑皮质,通过Accutase酶消化法和机械消化法,将组织消化成单个细胞,置于完全培养基中培养,3d后神经干细胞增殖成神经球;将传代的神经球消化,通过诱导培养基诱导其分化;采用细胞免疫荧光染色和qRT-PCR技术检测巢蛋白(Nestin)、中间微管相关蛋白2(Map2)和胶质纤维酸性蛋白(Gfap)的表达,鉴定NSCs、分化形成的神经元和星形胶质细胞.结果 NSCs能被Nestin特异性标记,诱导分化后的细胞可被Map2和Gfap抗体特异识别;qRT-PCR结果显示,诱导后Nestin的表达水平降低,而Map2和Gfap的表达水平升高.结论 通过Accutase酶消化法联合机械消化法分离小鼠胚胎脑皮质,进行体外培养,可获得具有自我更新能力和多向分化潜能的NSCs.     

胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞的培养及鉴定

目的:探讨胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞(neural stem cell,NSCs)的分离、培养、传代及鉴定的方法。方法:分离E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织,用机械吹打方法形成细胞悬液,接种到含有表皮生长因子(ep i-derm al growth factor,EGF)、碱性成纤维生长因子(fibrob last growth factor-basic,bFGF)、B27(B27 sup lem ent)的DMEM/F12(1∶1)的无血清培养液中培养,待形成原代克隆球后,用有限稀释法进行单细胞克隆和传代扩增,以获得大量来源相同的NSCs克隆球,并且进行B rdu和Nestin检测;然后取培养细胞诱导分化后行GFAP,NeuN,TH检测。结果:E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织细胞培养两周后可以形成较多的悬浮生长的神经球,经单细胞克隆和传代扩增后得到大量的同源细胞克隆球。经过B rdu和Nestin的免疫细胞化学检测90%以上的细胞呈阳性;诱导分化后细胞呈GFAP,NeuN阳性,少量细胞呈TH阳性。结论:从E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新的能力,是胚胎大鼠中枢神经系统的NSCs,并可以分化为TH阳性神经元。     

人脐带间充质干细胞的无动物血清培养及向肝细胞诱导分化

目的 探索从脐带组织中分离培养间充质干细胞的无动物血清方法,并将其向肝细胞诱导分化。方法 分离自体脐血清用于后续细胞培养,利用酶消化法从脐带组织中分离培养间充质干细胞,检测其形态和免疫表型,并采用两步法诱导其向肝细胞诱导分化。结果  流式细胞术检测结果表明,自体脐血清培养得到的贴壁细胞表型符合间充质干细胞特征,且在合适诱导条件下能肝样细胞分化,经过4周处理,能表达肝细胞特异性基因,部分细胞具有吞噬低密度脂蛋白的能力。结论  采用自体脐血清有效地培养脐带间充质干细胞,具备向肝细胞的分化能力。     

胎鼠、新生鼠和成年鼠神经干细胞的体外增殖和分化

目的比较个体发育不同阶段所得神经干细胞的体外增殖和分化情况。方法常规的神经干细胞分离培养方法，用免疫细胞化学方法鉴定细胞。结果从胎鼠所得的神经干细胞增殖能力最强，新生鼠的次之，成年鼠的较差。神经干细胞的分化更多地决定于培养条件。结论个体发育不同阶段所得的神经干细胞有不同的生物学特性。     

小鼠中脑神经干细胞体外培养方法的研究

目的改进小鼠中脑神经干细胞(NSCs)分离培养方法。方法分别采用机械法和酶消化法分离出生1～3d的小鼠中脑组织,在含体积分数为2%B27及20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养。采用巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、及神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色方法鉴定NSCs和分化细胞。结果在含bFGF及B27的DMEM/F12培养基中,可形成悬浮生长Nestin呈阳性的神经球。诱导分化的细胞可见GFAP或NSE免疫反应阳性细胞。机械法较酶消化法可获得较多的NSCs。结论在DMEM/F12培养基中添加2%B27及20ng/mL的bFGF可成功获得中脑NSCs,机械法为一种简便而有效的NSCs分离方法。     

谷氨酸对体外培养胎鼠神经干细胞的损伤作用

目的:探讨谷氨酸对体外培养胎鼠神经干细胞的损伤作用,为开发神经干细胞保护药物的研究提供理论依据。 方法:取妊娠15 d的Wistar大鼠胚胎脑组织行体外细胞培养,采用免疫组化方法检测证实为神经干细胞。以正常培养的神经干细胞为对照组,谷氨酸处理组加入不同浓度的谷氨酸,MTT比色法观察神经干细胞的存活率。结果:从神经干细胞球内分化的细胞既有神经元又有神经胶质细胞,免疫组化结果显示,神经元特异性烯醇化酶（NSE）染色阳性和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。谷氨酸处理组给药 24 h后,与对照组比较神经干细胞存活率明显降低,50 μmol·L^-1 谷氨酸组细胞存活率为86.45%,与对照组比较差异无显著性（P>0.05）; 100及1 000 μmol·L^-1 谷氨酸组干细胞存活率（分别为71.22%和15.14%）低于对照组（P<0.05,P<0.01）。结论:谷氨酸对神经干细胞有损伤作用,且呈剂量依赖关系,随着谷氨酸剂量的增加,神经干细胞的存活率逐渐降低 。     

不同方法培养SD大鼠心肌干细胞的比较

摘 要：【目的】比较不同方法分离和体外扩增SD大鼠心肌干细胞的特点。【方法】分离出SD大鼠心肌组织，分别采用组织块培养法、改良组织块培养法进行心肌干细胞原代培养；分别采用差速消化法、快速消化洗脱法进行传代。【结果】倒置相差显微镜下对培养细胞进行形态学观察，成纤维样细胞首先从组织块爬出，其后小、圆、亮细胞迁移至成纤维样细胞层上并长成大量集落。改良组织块培养法小、圆、亮细胞较易爬出；快速消化洗脱法传代可去除大量成纤维样细胞混杂。【结论】改良组织块培养法是一种良好的大鼠心肌干细胞培养方法，快速消化洗脱法传代纯化率较高。     

胰腺成体干细胞的体外培养和鉴定

目的:用目前常用的干细胞分离方法对正常SD大鼠的胰腺成体干细胞进行分离、培养和鉴定,为胰腺癌干细胞的进一步研究奠定基础.方法:选取正常SD大鼠胰腺用胶原酶P消化分离,并用低血清无糖培养基纯化胰腺细胞,以RT-PCR,免疫组化和Western blot方法鉴定胰腺成体干细胞标志物巢蛋白(nestin)并通过RT-PCR证明细胞中存在ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G member 2).结果:成功分离到所需胰腺成体干细胞,并通过以上3种方法证明分离所得细胞表达巢蛋白.结论:以胶原酶P作为消化液,低血清无糖培养作为分离方法能够成功的从正常胰腺中分离得胰腺成体干细胞.     

新生大鼠神经干细胞的体外分离和培养

目的改进大鼠神经干细胞的分离和培养方法。方法用出生1～3d的新生大鼠，取脑用刀片剁碎和吸管吹打的机械分离法代替酶消化法。用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞、神经元和星形胶质细胞。结果用机械分离法从新生大鼠脑组织分离神经干细胞的获得率较高，并培养出较多的神经球，还能分化成神经元和星形胶质细胞。结论该方法简便，能得到较多的神经球，细胞获得率也较高。     

新生大鼠脊髓源性神经干细胞的分离培养及分化鉴定

目的：探讨分离、培养新生大鼠脊髓源性神经干细胞的方法并对其进行分化鉴定,为临床应用脊髓神经干细胞进行周围神经系统疾病的替代治疗奠定细胞学基础。方法：首次采用注射器灌注法分离新生24 h Wistar大鼠脊髓源性神经干细胞,神经细胞培养液调节细胞终浓度并进行培养,形成克隆后,传代。将传至第1代培养细胞加入含10%胎牛血清的DMEM /F12 培养基诱导其分化。形态学方法观察细胞的生长状态,利用鼠抗Nestin抗体、鼠抗GFAP抗体、鼠抗MAP-2抗体进行分化的神经干细胞免疫组织化学鉴定。 结果：新生大鼠脊髓源性神经干细胞可在体外培养条件下贴壁生长,在血清的作用下可分化为具有典型神经细胞形态、表达特异性组织蛋白Nestin、GFAP、MAP-2的神经细胞。结论： 大鼠脊髓内可分离出脊髓源性神经干细胞,呈贴壁增殖状态,并有分化能力。