粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)木聚糖酶的合成及性质研究

粗糙脉孢菌1602(Neurosporacrassa)可以产生木聚糖酶。以不同的植物纤维物料及纯木聚糖作为底物都可诱导产生较高的木聚糖酶活,其中玉米芯粉的诱导能力最强,酶活可达25.02IU/mL。纤维素与木聚糖混合对木聚糖酶合成具有促进作用。葡萄糖、木糖对木聚糖酶的合成有很强的阻遏作用,葡萄糖的阻遏作用大于木糖的阻遏作用。其木聚糖酶最适作用pH值为5.4,最适作用温度为60℃。     

低聚合度木聚糖对木聚糖酶合成的影响

研究了木聚糖的聚合度和添加黄豆粉对里氏木霉合成木聚糖酶的影响,并以纯化木聚糖酶水解木聚糖。研究结果表明:木聚糖经酶水解后平均聚合度降低54%,戊聚糖含量为75.4%。采用低聚合度木聚糖为底物碳源和添加黄豆粉都可提高产酶效果。以12g/L低聚合度木聚糖添加2g/L黄豆粉,培养3d后木聚糖酶活力可达到113IU/mL,提高49.3%。通过对木聚糖酶进行纯化处理可以有效除去β 木糖苷酶。以体积分数10%的木聚糖酶水解35g/L木聚糖3h后,低聚木糖得率达到35.5%,而木糖得率仅为1.5%,低聚木糖与总糖的比值达到95.8%,随着酶解时间的延长,低聚木糖不会被降解。     

低聚合度木聚糖对木聚糖酶合成的影响

研究了木聚糖的聚合度和添加黄豆粉对里氏木霉合成木聚糖酶的影响，并以纯化木聚糖酶水解木聚糖。研究结果表明：木聚糖经酶水解后平均聚合度降低54％，戊聚糖含量为75．4％。采用低聚合度木聚糖为底物碳源和添加黄豆粉都可提高产酶效果。以12g／L低聚合度木聚糖添加2g／L黄豆粉，培养3d后木聚糖酶活力可达到113IU／mL，提高49．3％。通过对木聚糖酶进行纯化处理可以有效除去β-木糖苷酶。以体积分数10％的木聚糖酶水解35g／L木聚糖3h后，低聚木糖得率达到35．5％，而木糖得率仅为1．5％，低聚木糖与总糖的比值达到95．8％，随着酶解时间的延长，低聚木糖不会被降解。     

Aspergillus niger NL-1来源的木聚糖酶的耐热性能改造及其在水解木聚糖中的应用

为提高来源于Aspergillus niger NL-1的木聚糖酶MxynB的热稳定性，通过定点突变技术在木聚糖酶MxynB的相应位置引入二硫键（Cys¹¹⁶-Cys¹³⁵），获得突变酶MynxB-116-135；通过基因融合技术在木聚糖酶MxynB的N端融合了具有较高热稳定性的来源于嗜热菌Thermotoga thermarum DSM5069的纤维素结合结构域（CBD），获得突变酶CBD-MxynB和CBD-MxynB-116-135。分别将原酶及突变酶在E.coli BL21（DE3）中表达，经纯化后对比其酶学性质。结果显示，突变酶MxynB-116-135的最适温度为50℃，较原酶MxynB提高了5℃；突变酶CBD-MxynB和CBD-MxynB-116-135的温度稳定性明显提高，其中CBD-MxynB-116-135尤为突出，在70℃下保温2h仍能保持50%以上的酶活力，而原酶基本失活。研究表明，二硫键的引入和CBD的融合对提高MxynB的热稳定性具有重要的作用。此外，研究了突变酶CBD-MxynB-116-135水解玉米芯木聚糖的产物，结果显示玉米芯木聚糖质量浓度为2.5mg/mL，酶用量为40U/g，在50℃、pH 5.0条件下水解10h后，水解得率为39.6%，水解产物XOS_2-3含量占87.9%。结果表明，利用该突变木聚糖酶酶解碱提玉米芯木聚糖可产生以木二糖及木三糖为主要成分的低聚木糖。     

低聚木糖生产用木聚糖酶的选择性合成

以里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut C-30为产酶菌,研究了碳源、碳氮比对木聚糖酶酶系组成的影响.低分子量组分较多的木聚糖有利于促进内切-β-木聚糖酶的合成,酶解产物中低聚木糖的含量较高(80.70%).低碳氮比有利于促进内切-β-木聚糖酶的合成,抑制外切-β-木糖苷酶的合成.以低分子量较多的木聚糖(7g/L)为碳源,降低培养基的碳氮比为4.0,调控培养60h,用该木聚糖酶酶解粗木聚糖,产物中低聚木糖占总糖的86.32%.     

-木糖苷酶的分离纯化、酶学性质及水解机理研究

通过硫酸铵沉淀、超滤脱盐、离子交换层析、凝胶过滤层析等手段,从里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut C-30木聚糖酶粗酶液中分离纯化得到分子质量110.8 ku、比活力为61.99 IU/mg的电泳纯β-木糖苷酶。酶学性质研究结果表明:该酶反应以温度60 ℃、pH值3.5为宜,在60 ℃以下、pH值3.0～8.0酶活性稳定,且该酶作用于对硝基苯基-β-D-木糖苷的K_m值和V_max值分别为0.29 μmol/mL和169.99 IU/mg。酶水解机理研究结果表明,该酶从低聚木糖的非还原性末端切断β-1,4-糖苷键释放出木糖,其最适作用底物是短链的低聚木糖,随着低聚木糖碳链的增长,酶作用效率逐渐下降,而对木聚糖几乎不降解。     

毕赤酵母产重组木聚糖酶发酵条件的优化及其酶学性质

目的优化毕赤酵母工程菌GS115/xyn11A产重组木聚糖酶的发酵条件,并检测其酶学性质。方法采用单因素试验和L(934)正交试验考察摇瓶发酵条件下培养基起始pH值、诱导剂甲醇添加量、诱导温度及诱导时间对产酶活性的影响;并分析重组木聚糖酶的酶学性质。结果影响重组毕赤酵母产酶的因素重要性依次为:培养基起始pH值>诱导时间>诱导温度>甲醇添加量,重组酵母产酶最佳条件为:起始pH值7.5,甲醇添加量1.5%,32℃诱导96 h,在此条件下进行诱导表达重组木聚糖酶的酶活性可达228.35 IU/ml;酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.5,在低于40℃和pH 4.5～7.5的范围内较稳定。结论优化了毕赤酵母产重组木聚糖酶的发酵条件,为木聚糖酶的工业化生产及应用提供了依据。     

凝胶过滤色谱法研究酶解过程中木聚糖分子结构的变化

采用凝胶过滤色谱法研究了木聚糖在酶解过程中分子量分布的变化。结果表明,木聚糖酶对高分子量组分的木聚糖的降解能力较差,而主要降解分子量介于15000～3000之间组分的木聚糖,使得这部分木聚糖变为分子量更低的木聚糖组分。随着酶解时间的延长,酶解得率上升,酶解产物中低聚木糖含量增多,未被酶解的木聚糖的平均聚合度上升,当酶解时间超过4h时,这种变化趋势缓慢。随着酶解轮次的增加,酶解产物中可溶性木聚糖的含量越来越少,木聚糖被降解的难度越来越大。在实际生产中,用来作为低聚木糖生产的木聚糖其聚合度应在20～100之间,酶解时间以4h为宜,重复利用未水解木聚糖的轮次以2轮为宜。     

荧光假单孢菌高活性木聚糖酶产酶研究

从盐碱土中获得一样荧光假单孢菌（P.flu．01）,研究了该菌木聚糖酶产酶条件。虽然木聚糖为木聚糖酶产酶最佳碳源,但以未处理的玉米芯为碳源,胰蛋白际和酵母混音为氮源时．经60h培养后,木聚糖酶活高达164．OIU／mL,而CMC酶活很低,只有0．29IU/mL。同时该菌对pH值具有广泛的适应性,在起始pH＝6．0－11．0范围内其木聚糖产酶能力相差不大。有机氛胰蛋白股和酵母混音比无机氛更有利于酶活的提高,并且木聚糖酶活力的提高和有机氟含量增加成正比。玉米芯的物理状态即粗细度对产酶影响不大,但玉米芯的含量增加对广酶有强烈的挺进作用。该酶最合适pH值为6．5,最适反应温度为50℃。     

黑曲霉诱变产酶活性与稻壳中木聚糖定向酶解的研究

采用紫外线照射诱变黑曲霉,筛选出低纤维素酶活的木聚糖酶高产菌株,研究了最优诱变条件,分析了诱变后黑曲霉产木聚糖酶的活性,测定了木聚糖酶对温度和pH值的稳定性。并初步探讨了木聚糖浓度、加酶量对酶解的影响。结果表明,最优诱变条件为:紫外照射功率40 W、照射距离28 cm、诱变时间2.5 min;黑曲霉产木聚糖酶的最适温度为50℃、最适pH值为4.2。木聚糖浓度对木聚糖的酶解没有影响,加酶量对木聚糖的酶解有一定影响;在木聚糖浓度为30 g.L-1、加酶量为2%~5%时,酶解效果较好。     

基于CO2原位捕集的生物质热解制氢

以谷壳作为生物质研究对象,在石英管反应器中研究了基于CO₂原位捕集的谷壳热解制H₂,考察了不同温度、不同的CO₂捕集剂（CaO）配比对其热解的产气量、气体中H₂的体积分数的影响。实验结果表明,谷壳热解的产气量随温度的升高而增大,当反应温度在800℃时有最大产气量340mL/g;捕集剂CaO的添加通过原位吸收CO₂促进相关反应向生成氢气的方向移动。在600℃,不同比例CaO下CO₂体积分数都保持在22%左右,谷壳热解产生的气体中H₂的体积分数为14%~26%;在700℃,当CaO与生物质质量比为1：4时,添加CaO捕集剂能够较好地捕集CO₂,有效提高H₂的体积分数,此时获得较高的H₂产率41%,较低的CO₂体积分数16%,CaO的捕集率为64%;GC-MS表征分析发现,CaO在800℃的温度下对热解过程中产生的焦油有部分催化裂解效果。     

新型嗜热耐碱脂肪酶的纯化表征及应用

将来源于解脂嗜热互营杆菌（Thermosyntropha lipolytica）的脂肪酶（TlLipA）基因tll1导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达，通过热处理和镍柱亲和层析获得纯酶，并对其酶学性质进行研究。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示TlLipA分子量为53×10³，其最适反应温度为65℃，最适反应pH为8.0。在55~65℃范围内酶活较高且比较稳定；在pH^{7.0~11.0于室温保存1 h后，残留相对酶活仍达80%以上。1 mmol/L 金属离子Zn2+、Fe3+和试剂SDS，0.05%（质量分数）Tween 80，对酶活力具有强烈的抑制作用，残留相对酶活皆低于15%；1 mmol/L Mg2+、Mn2+对酶活力表现出轻微的激活作用。由底物专一性实验可得，该酶对辛酸对硝基苯酯（C8）和癸酸对硝基苯酯（C10）偏好明显。以棕榈酸对硝基苯酯（p-NPP）为底物，该酶动力学参数K_m值为0.23 mmol/L，V_max为33.50 mmol/(L·min)，k_cat为22.83 _S-1。以重组脂肪酶为催化剂在无溶剂体系中制备生物柴油，含水率20%，酶加量200 U/g油，醇油比为4∶1的条件下，在55℃催化大豆油反应48 h，收率可达91.75%。}     

Purification and characterization of novel thermo-alkaline lipase and its application

In order to excavate thermo-alkaline lipases from bacterial living in extreme conditions, we try to express new gene from Thermosyntropha lipolytica DSM 11003, an anaerobic, thermophilic, alkali-tolerant bacterium which grows in alkaline hot springs Lake Bogoria in Kenya and explore its application in biodiesel production. The lipase gene (tll1) of 1434 bp were ligated at the Nco I / EcoR I sites of the expression vectors pET28a to yield the construct of pET28a-TLL1. The strain harboring pET28a-TLL1 was cultivated for expression at 25℃, the specific activity of 1.99 U/mg protein were detected in disrupted cells. The recombinant lipase TlLipA was purified by a simple two-step procedure involving heat treatment and Ni-chelating affinity chromatography. The subunit of purified TlLipA showed a molecular mass of 53×10³ on 12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The purified TlLipA exhibited optimal activity at 65℃ and pH 8.0 and it was stable from 55℃ to 65℃. The enzyme remained above 80% of its original activity at pH ranging from 7.0 to 11.0 and at room temperature for 1 h. The activity of TlLipA was little unaffected by Co²⁺, K⁺, Na⁺, and Ni²⁺, and a little activated by Mg²⁺ and Mn²⁺, ^{but were significantly inhibited by Zn2+, Fe3+, and SDS, and Tween 80 under the assay conditions. The purified recombinant TlLipA had a specific activity of 22.11 U/mg protein using p-nitrophenyl palmitate (p-NPP) as substrate. Determined by Sigma-Plot of reaction rate on p-NPP, the K_m was 0.23 mmol/L, the V_max was 33.50 mmol/(L·min), and the k_cat was 22.83 s-1. The enzyme was also active towards p-NPP, p-nitrophenyl laurate (p-NPL), p-nitrophenyl myristate (p-NPM) and p-nitrophenyl caproate (p-NPC), moreover TlLipA exhibited a strong preference for p-nitrophenol decanoate (p-NPD) and p-nitrophenyl octoate (p-NPO). Using recombinant lipase as a catalyst to prepare biodiesel in a solvent-free system, with a water content of 20%, an enzyme dosage of 200 U/g oil, and an alcohol-to-oil ratio of 4∶1, catalyzed soybean oil reaction at 55℃ for 48 h, the yield can reach 91.75%.}     

丁酸梭杆菌VPI 3266甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的克隆、表达

对丁酸梭杆菌VPI 3266的1,3-丙二醇代谢途径关键酶甘油脱水酶(DhaB)与1,3-丙二醇氧化还原酶(DhaT)进行了研究。甘油脱水酶基因dhaB全长3315bp,编码两个蛋白亚基,分别为甘油脱水酶的核心酶和脱水酶的再激活酶。前者全长2367bp,编码788个氨基酸,后者全长918bp,编码305个氨基酸。通过构建重组质粒,使其在大肠杆菌中实现了活性表达。1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT全长1166bp,编码388个氨基酸,属于NADP依赖的离子激活的醇脱氢酶家族III。通过IPTG诱导,在大肠杆菌中实现了高效表达,酶活达到5.2U/mL。并通过Ni亲和柱获得了电泳纯的蛋白。蛋白相对分子质量为4.19×10⁴。该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为10.0,在pH值8.5~10.0范围内比较稳定,在45℃保温2h,酶活还残存50%。该酶以1,3-丙二醇为底物,在生理条件下的V_max和K_m分别为29.2U/mg和19.8mmol/L。     

MoO2/g-C3N4催化剂的制备及其氧化脱除模拟油中的硫化物

采用高温煅烧MoO₂和g-C₃N₄混合物制备了不同MoO₂含量的MoO₂/g-C₃N₄催化剂。采用X射线粉末衍射（XRD）、傅里叶红外光谱（FTIR）、扫描电镜（SEM）和N₂吸附脱附对催化剂的结构和性能进行了表征。以MoO₂/g-C₃N₄作为催化剂,H₂O₂为氧化剂,离子液体为萃取剂研究了反应体系的氧化脱硫性能。这项研究中考察了不同煅烧温度下制得的催化剂、负载量、氧化剂使用量、催化剂加入量、反应温度、萃取剂使用量、反应时间、硫化物类型等不同反应参数对脱硫率的影响。结果表明,在H₂O₂的使用量为0.2mL,MoO₂/g-C₃N₄加入量为0.03g,1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯离子液体1.0mL,反应温度为70℃,反应时间60min的最佳工艺条件下,24%-MoO₂/g-C₃N₄催化剂脱硫率可以达到94.8%,催化剂循环使用5次后活性没有明显下降。此外,研究了MoO₂/g-C₃N₄在离子液体中的催化氧化反应机理。     

Thermostable ethanol tolerant xylanase from a cold-adapted marine species Acinetobacter johnsonii

A xylanase-producing bacterium, isolated from deep sea sediments, was identified as the cold-adapted marine species Acinetobacter Johnsonii. A cold-adapted marine species Acinetobacter Johnsonii could grow at 4 ℃. The optimum temperature and pH of xylanase from a cold-adapted marine species Acinetobacter Johnsonii were 55 ℃ and pH 6.0. Xylanase from a cold-adapted marine species Acinetobacter Johnsonii remained at 80% activity after incubation for 1 h at 65 ℃. The xylanase activity was 1.2-fold higher in 4% ethanol solution than in ethanol free solution. Gibbs free energy of denaturation, ΔG, was higher in 4% ethanol solution than in ethanol free solution. Thermostable ethanol tolerant xylanase was valuable for bioethanol production by simultaneous saccharification and fermentation process with xylan as a carbon source.