短乳杆菌和植物乳杆菌产γ-氨基丁酸及其关键基因的研究

为研究乳杆菌γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的产量以及其与谷氨酸脱羧酶系统关键基因表达的相关性,实验结合GABA产量、基因组学调查和谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)系统基因的扩增结果,发现产GABA的菌株在短乳杆菌、植物乳杆菌中分布较多,这2个种属可作为产GABA菌株的主要筛选对象。通过qRT-PCR研究短乳杆菌和植物乳杆菌不同生长时期GAD相关基因转录情况,结果表明,短乳杆菌的gad B和gad C的表达量变化情况相似,且在对数后期或稳定前期达到高峰。文中的短乳杆菌高产GABA可能与其gad C和gad B的高表达有关。植物乳杆菌的gad B表达变化与短乳杆菌类似,但是与GABA的产量之间相关性较弱,可能存在其他因素的影响。该研究为产GABA菌株的筛选,乳杆菌中GAD基因的表达调控,GABA发酵工艺的优化提供了理论基础。     

固定化米糠对谷氨酸脱羧酶活性影响的研究

米糠是稻谷加工中的副产品,年产量很大但开发利用程度很低,其含有的谷氨酸脱羧酶(GAD)活力是植物中的佼佼者,该酶可以将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸(GABA).研究发现,可以将米糠固定化以达到固定化其中GAD的目的.本文研究了固定化后的米糠中GAD的酶学性质,研究表明,经海藻酸钠固定化的米糠GAD的最适温度由40℃左右移至45℃左右,其它性质没有发生变化,此时固定化米糠GAD酶活力回收率达到51.00%.利用固定化米糠GAD制备的GABA制备液中GABA含量为3.06%.为植物法制备GABA提供又一种技术方法.     

植物中γ-氨基丁酸的代谢和功能

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸,存在于大部分真核和原核生物组织中。它在植物体中开启了一个信号传递途径,由于其重要的生理功能而备受重视。GABA的累积主要是受谷氨酸脱羧酶(GAD)的调控,也需要其他酶(GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶)的作用以及胞内和胞外GABA的运输。数据表明,应激条件可引起植物中GABA的积累,因为应激条件可激活信号转换通道,在此通道内,逐渐增加的胞液Ca2+会激活受CaM调控的GAD和进而催化GABA的合成,同时H+也能激活植物中的GAD。生物体中GABA的合成涉及到pH的调节、N的贮藏、植物的生长发育和免疫、兼容性渗透以及谷氨酸盐的选择性利用。本文综述了GABA的代谢途径及代谢中的关键酶,并讨论了GABA在pH调节、储存氮源、植物生长和保护以及谷氨酸的转换利用中的发挥的功能。     

谷氨酸脱羧酶(GAD)的研究进展

谷氨酸脱羧酶(GAD,EC4.1.1.15)是生物体内广泛存在的一种酶,有重要的生理学作用,能催化谷氨酸脱羧生成重要的抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)。GAD用于医疗和食品中具有很大潜力,本文综述了GAD的研究进展和应用。     

浅析谷氨酸脱羧酶克隆分析与应用

谷氨酸脱羧酶(GAD)能够催化L-谷氨酸(L-Glu)生成γ-氨基丁酸(GABA),GAD是生物技术富集生产GABA的关键酶,GABA作为一种抑制性神经递质,在哺乳动物体内有着多种重要的生理功能。因而研究GAD有着广泛的应用前景。但由于GABA天然含量较低,利用谷氨酸脱羧酶GAD催化谷氨酸生物合成是目前的研宄热点。因此,如何获得高纯度高效率的谷氨酸脱羧酶是一个具有巨大潜力和重要意义的研究项目。而且谷氨酸脱羧酶酶在食品、医学、工业、酒业等方面都具备广大、宽阔的前景,值得我们深入研究分析。本论文研究目的是通过菌体培养,基因组提取,引物设计,pcr扩增,测序结果分析等方法来获得高纯度高效率的谷氨酸脱羧酶。     

利用海藻酸钠固定化米糠制备γ-氨基丁酸的研究

米糠是稻谷加工中的副产品,年产量很大但开发利用程度很低,其含有的谷氨酸脱磉酶(GAD)活力是植物中的佼佼者,该酶可以将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸(GABA).本研究中将米糠固定化以达到固定化其中GAD的目的,得到最佳固定化条件:米糠6.0%、海藻酸钠溶液浓度2.5%、硬化时间1h、CaCl2溶液浓度10%,此时固定化米糠GAD酶活力回收率达到4894%.利用固定化米糠GAD制备的GABA制备液中GABA含量为3.06%,为植物法制备GABA提供又一种技术方法.     

脂肪酸对基因表达的调控作用

脂肪酸是油脂的主要组成部分,对基因表达具有调控作用,这种调控作用与脂肪酸的种类、结构以及不同脂肪酸的比例有关。阐述了油脂中脂肪酸种类、结构、脂肪酸含量及比例与相关基因表达的调控效应关系,为进一步研究脂肪酸的功能和作用机制提供依据。     

米糠中钙调素的提取及谷氨酸脱羧酶激活作用研究

谷氨酸脱羧酶是一种钙调素(CaM)结合蛋白,能够在Ca2+-CaM的激活作用下专一地催化L-谷氨酸脱羧转变成γ-氨基丁酸(CABA)。本文研究发现,经过三氯乙酸沉淀的提取方法和冷冻干燥可以有效提取CaM。同时研究发现:金属离子的存在会不同程度地抑制Ca2+-CaM对GAD的激活,其中K+和Zn2+对CaM激活GAD的抑制作用较为明显;随着Ca2+和GaM浓度在一定范围内的增加,Ca2+-CaM对GAD的激活作用有所增强;C末端水解后的GAD被Ca2+-CaM的激活有一定程度的降低,由此推测GAD的C末端可能是Ca2+-CaM的结合区域。     

大豆谷氨酸脱羧酶分离纯化及酶学性质研究

对大豆中的谷氨酸脱羧酶(GAD)进行了提取、纯化及酶学性质的研究.采用硫酸铵分级沉淀技术对大豆中GAD进行了纯化,该酶被纯化了4.7倍.纯化后的大豆GAD最适温度为40℃,最适pH为5.9,大豆GAD的热稳定性较差,在80℃几乎失去活性,但该酶在pH5.0～8.0较稳定,能保持很好的酶活.大豆GAD对底物谷氨酸的Km值为19.4 mmol/L.Mg2、KCl对大豆GAD活性影响不大,但KI、Ag+、SDS对大豆GAD有抑制作用.Ca2+对大豆GAD有激活作用,当Ca2浓度为1 500 μmol/L时,对大豆GAD激活作用最强,相对酶活能达到160％.大豆GAD与其他植物GAD相比存在差异,并证实可被Ca2+激活.     

短乳杆菌GLB-127发酵制备γ-氨基丁酸

短乳杆菌(Lactobacillus brevis)为国家卫健委批准用于制备γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)的微生物菌种。利用短乳杆菌发酵表达谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD),将GAD全细胞用于催化L-谷氨酸生产GABA的研究具有重要意义。采用扫描电子显微镜与分子生物学手段鉴定了1株短乳杆菌GLB-127,构建了该乳酸菌的系统发育树。通过优化发酵及转化条件,包括培养转速、培养温度及全细胞催化酶加量等条件,初步确定了短乳杆菌制备GABA的工艺;然后又对发酵培养基进行了优化,使得GAD活力及GABA产量有了明显提升。经10 L发酵罐放大培养,GABA质量浓度达到了345.1 g/L,转化率为98.5%,GAD活力达315.9 U/g。该研究为新食品原料GABA的工业化生产奠定了基础。     

Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403谷氨酸脱羧酶的克隆表达、分离纯化及活性研究

谷氨酸脱羧酶(GAD)是功能因子γ-氨基丁酸(GABA)生物合成过程中的重要酶。为了得到一种有高效活性的GAD基因工程菌,克隆到一种GAD基因,来源于微生物Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403。以pET-22b(+)为载体质粒,Escherichia coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的重组GAD过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约54 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明,该重组GAD的转化活性比野生菌株有明显提高,野生菌株经5h细胞转化,反应底物转化率为55.8%,而工程菌20min后转化率达到82.1%,30min后转化可达到98.3%。     

1 株产γ-氨基丁酸植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

以1 株产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BC114谷氨酸脱羧酶为研究对象,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术获得该酶基因,对其进行生物信息学分析,并转入大肠杆菌BL21（DE3）中实现异源表达。采用实时荧光定量PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分别测定重组菌不同发酵时间点谷氨酸脱羧酶基因的表达量、蛋白表达量以及产GABA能力。结果表明：植物乳杆菌中谷氨酸脱羧酶基因大小为1?410?bp,编码469?个氨基酸,蛋白二级结构由α-螺旋（32.2%）、β-折叠（11.5%）和无规则卷曲（56.3%）构成,完成了该酶的三维结构同源建模;成功构建了重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌,谷氨酸脱羧酶基因在诱导6?h相对表达量最大,而蛋白表达量较基因在转录水平表达量有一定滞后,在8?h达最大值,此时GABA产量也达最高,为2?387?mg/L。     

基于基因组挖掘技术的新型谷氨酸脱羧酶基因挖掘及表达鉴定

采用基因组挖掘技术,以来源于Lactobacillus brevis活性较高的谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD）LbGAD为探针,从乳酸菌（Lactococcus lactis、Lactobacillus senmaizukei）和肠球菌（Enterococcus sulfureus）的基因组中挖掘到了3 个假定的GAD基因（LlGAD、LsGAD和EsGAD）。借助pET28a质粒分别实现了这4 个基因在大肠杆菌BL21中的表达,其中LsGAD和LlGAD的表达产物可溶性较好,相应发酵液中GAD活力分别为34.17、38.91 U/mL。LsGAD的比活力、温度特性、pH值特性和Kcat/Km值也明显优于其他几个酶。此外,初步研究了全细胞催化L-谷氨酸制备γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）的工艺,6 g/L的L-谷氨酸经过24 h转化后,GABA得率最高可达58%。本研究实现了GAD从基因组数据到真实酶的跨越,获得了1 个性能优良的GAD,并初步实现了GABA的生物合成,为实现GABA低成本、规模化的生物合成提供了科学依据。     

基于秀丽隐杆线虫的酒精生物效应研究进展

酒在现代生活中日趋重要,适量饮酒有促进活血、预防心血管疾病的功能,但长期过量饮酒,会损害肝、胃和脾等器官甚至导致神经性疾病,这已成为人们十分关注的问题。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)作为一种特殊的模式生物,具有相对简单且已明晰的生理结构(特别是其神经结构),以及大量被证实的与人类疾病相关的同源基因,因而被用作生物模型来研究疾病发生的分子靶点和相关神经通路。本文介绍了以秀丽隐杆线虫作为模式生物来研究酒精干预下的寿命调控机制、神经退行性疾病、酒精引发成瘾及Ⅱ型糖尿病等相关研究进展,展示了线虫作为模式生物在酒精生物功能研究领域发挥的独特优势,为了解酒精性疾病的发生、发展及其相关生理机制,预防酒精引起的相关疾病研究提供了新的方法与思路。     

Analysis of organic solvent tolerance in Escherichia coli using gene expression profiles from DNA microarrays

To investigate the biological mechanism of organic solvent tolerance (OST), DNA microarrays were used to collect and compare the gene expression profiles of normal and organic solvent-tolerant Escherichia coli strains. First, we compared the tolerant-strain OST3410 to its sensitive parent strain JA300 in the absence of organic solvents. Numerous genes showed higher expression levels in OST3410, and Northern analysis was used to confirm the higher expression level of some genes. Next, the gene expression profiles of JA300 and OST3410 exposed to hexane as an organic solvent were investigated and compared with JA300 before exposure to organic solvent. In OST3410 and JA300, 115 and 47 hexane-induced genes were found, respectively. As candidates for genes related to OST, we focused on six genes: cysD, marA, mg1B, tnaA, tnaB and yihM, which were upregulated by hexane in both strains. When these genes were over-expressed on plasmids, only the marA plasmid increased OST activity. It should be noted that we succeeded in finding a gene related to OST activity using only DNA microarray data, without any biochemical or biological knowledge.     

Specific expression of adherence-related genes in Escherichia coli O157:H7 strain EDL933 after heat treatment in ground beef

In this study, the expression of particular stress- and virulence-associated genes of Escherichia coli O157:H7 strain EDL933 in ground beef was investigated using real-time PCR. Specific gene expression in the food matrix was found in combination with heat treatment. In contrast to a treatment at 37°C, treatment at 48°C for 10 min resulted in increased expression of the genes eae, hcpA, iha, lpfA, and toxB. Adherence to human intestinal HT-29 cells was enhanced in bacterial cells inoculated and heat treated in ground beef. The expression of gadE, which encodes a main regulator of the glutamate system of the acid response, was reduced under these conditions. However, expression of rpoS and recA, which are involved in the establishment of stress responses, and Shiga toxin genes was not significantly different under the same conditions.     

RNA delivery in Saccharomyces cerevisiae using electroporation.

An efficient delivery method for introducing in vitro synthesized RNA into yeast has been developed using electroporation. Spheroplast preparation, electroporation, and subsequent expression analysis can be accomplished within a single day. The use of introduced mRNA constructs avoids any complications due to nuclear regulation and is particularly suited for cytoplasmic regulatory studies. Moreover, this technique is useful for introducing those RNAs that cannot be made in vivo, such as poly(A)- mRNAs or RNAs with base modifications. We demonstrate that the Escherichia coli GUS gene and the firefly Luc gene are both excellent reporter genes for RNA electroporation.     

Gene Ontology annotation status of the fission yeast genome: preliminary coverage approaches 100%

In this review, we present an overview of the Gene Ontology (GO) structure and describe how the GO is implemented for Sz. pombe and made available via Sz. pombe GeneDB (http://www.genedb.org/genedb/pombe/). We give a detailed progress report of Sz. pombe GO annotation, providing the current status of both manual and automatic annotations. Fission yeast has at least one GO annotation for 98.3% of its genes (excluding annotations to 'unknown' terms), greater than the current percentage coverage for any other organism. Approximately 65% (3225 gene products) have at least one annotation to each of the three ontologies (biological process, cellular component and molecular function). Approximately 30% (1443 gene products) have GO terms derived directly from small-scale experiments in fission yeast, supporting the validity of fission yeast as a model eukaryote and a reference organism.     

碳源对manA基因突变大肠杆菌代谢的影响

ManA基因编码的甘露糖-6-磷酸异构酶在大肠杆菌中催化D-甘露糖和D-果糖的异构化,促进大肠杆菌对碳源的代谢吸收。本文通过研究manA基因突变大肠杆菌对碳源的利用和编码糖代谢基因情况,探讨甘露糖-6-磷酸异构酶对大肠杆菌糖代谢的影响。采用Ⅱ型内含子逆转录突变方法构建manA基因突变大肠杆菌,分析manA基因突变大肠杆菌对不同碳源的利用情况和manA基因突变对大肠杆菌糖代谢相关基因表达的影响,结果显示,大肠杆菌BL21(DE3)ΔmanA以甘露糖、果糖为碳源时,菌株生长受到显著抑制;以淀粉为碳源时,BL21(DE3)ΔmanA菌株的生长显著优于野生型大肠杆菌;以葡萄糖为碳源时,manA基因突变对大肠杆菌的生长无显著影响。通过基因表达分析,发现大肠杆菌BL21(DE3)ΔmanA中甘露糖代谢相关基因的表达显著性降低;果糖代谢途径中6-磷酸果糖激酶Ⅰ亚基的编码基因(pfkA)显著下调表达;水解淀粉的α-淀粉酶编码基因(malS)显著性上调表达。ManA基因突变影响大肠杆菌甘露糖、果糖和淀粉代谢途径中相关基因的表达,从而影响大肠杆菌对碳源的利用。