转甲状腺素蛋白真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建转甲状腺素蛋白(TTR)的真核表达载体,观察其在NIH 3T3细胞中的表达及定位.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到TTR编码序列,将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒pcDNA3-TTR-HA.重组质粒通过PCR、酶切测序等证明构建正确后经脂质体转染NIH 3T3细胞,固定并染色后通过荧光显微镜观察该融合蛋白的表达及定位.结果 重组质粒经鉴定证明构建正确.转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要分布在细胞质中.结论 成功构建带HA标签的TTR真核表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为深入研究TTR在细胞内的相关生物学功能奠定了基础.     

小鼠膜联蛋白A1真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠膜联蛋白A1(annexin-A1,ANXA1)真核表达载体,并检测其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 采用PCR法从小鼠肝cDNA文库扩增ANXA1基因编码序列,并将其克隆至带有血凝素(HA)标记的真核表达载体pcDNA3-HA上,经PCR、酶切和测序鉴定后,将重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1瞬时转染NIH3T3细胞,采用细胞免疫荧光法检测目的 基因表达情况.结果 菌液PCR、双酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1构建正确,并可在NIH3T3细胞的胞质、胞核和胞膜中广泛表达.结论 成功构建了pcDNA3-HA-ANXA1真核表达载体,该载体中的HA-ANXA1融合基因能在哺乳动物中有效表达并正确定位,为下一步深入研究ANXAl相关的信号通路奠定了基础.     

小鼠ATP酶β亚单位真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建小鼠ATP酶β亚单位(ATPaseβ)真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞中的表达定位情况。方法取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到ATPaseβ编码序列,将其连接到pMD18-T载体上,然后以pMD18-ATPaseβ为模板扩增得到ATPaseβ编码序列,再将其克隆到真核表达载体pcDNA3/HA上。采用脂质体转染法转染NIH 3T3细胞及293细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果 PCR、双酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3/HA-ATPaseβ构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位于细胞质,细胞膜上也有表达,而在293细胞中只表达于细胞质。结论成功构建了带有HA标签的小鼠ATPaseβ真核表达载体,该载体能够在哺乳动物NIH 3T3及293细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究ATPaseβ的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

带FLAG标签小鼠HuR真核表达载体的构建及其生物学功能的鉴定

目的 构建人抗原R (HuR)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达并初步分析其生物学功能.方法 提取NIH3T3细胞总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到小鼠HuR编码序列,酶切后克隆至pcDNA3.1-FLAG载体;重组载体经PCR、酶切、测序鉴定正确后瞬时转染NIH3T3细胞,采用W...     

构建人补体膜辅助调节蛋白真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH 3T3细胞

目的：构建人补体膜辅助调节蛋白（membrane cofactor protein，MCP）真核表达载体并利用壳聚糖（Chitosan）转染小鼠NIH 3T3细胞。方法：应用PCR方法，从MCP-pGEM-T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB-MCP真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定；利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH 3T3细胞，并对转染细胞进行抗MCP免疫组织化学染色。结果：MCP基因大小为1065bp，与Genebank中记载的人MCP cDNA序列结果基本一致；抗MCP免疫组织化学染色显示转染细胞胞浆弥漫阳性。结论：成功构建了人MCP真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH3T3细胞，为进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。     

HA表位标记的人Axud1基因的构建及在肺腺癌SPC-A1细胞中的表达

构建在哺乳动物细胞中表达的血凝素HA表位标记的人Axud1融合蛋白表达载体。RT PCR从人外周血淋巴细胞中扩增Axud1全长cDNA ,用含HA序列的特异引物PCR扩增HA Axud1,经BamHⅠ、XbaⅠ酶切后插入到经BamHⅠ、XbaⅠ酶切的真核表达载体pcDNA3 .1( ) 中 ,重组质粒PCR、酶切和测序鉴定正确 ,最后将该质粒转染入肺腺癌SPC A1细胞中 ,Westernblot检测HA Axud1融合蛋白的表达。结果显示 ,筛选的G418抗性克隆SPC A1细胞中均有HA Axud1融合蛋白的表达 ,为进一步研究Axud1蛋白在肿瘤细胞中的功能提供了一个重要工具     

RNF185的克隆及过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

目的克隆RNF185全长基因,构建真核表达载体,检测其蛋白表达和亚细胞定位,并探讨RNF185过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 TRIzol法提取人胚肾HEK293T细胞的总RNA,经RT-PCR反应扩增出RNF185基因,并通过酶切连接将其构建到真核表达载体pCMV-Myc和pEGFP-N1上,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序。测序正确后抽提质粒作为模板扩增N端截短体,构建其真核表达载体。转染MC3T3-E1检测其蛋白表达及亚细胞定位情况。采用碱性磷酸酶染色法分析RNF185过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。结果①完成了RNF185的分子克隆,构建的真核表达载体pCMV-Myc-RNF185测序正确,所获得的序列与GenBank中收录的序列完全一致,N端截短体测序正确;②成功转染至MC3T3-E1细胞,蛋白相对分子质量大小与预期一致,全长形式定位于质膜;③RNF185及其N端截短体过表达均可抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。结论 RNF185过表达可抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。     

小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达。方法利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3′末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcD-NA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建的重组质粒通过脂质体转染COS-7细胞,分别采用RT-PCR和免疫荧光法检测其FABP3mRNA及蛋白的表达情况。结果所构建的pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag重组载体可酶切出418bp的FABP3 cDNA片段和442bp的FABP3-FlagcDNA片段,经测序证实正确。转染后的COS-7细胞经RT-PCR可扩增出278bp的目的片段,且免疫荧光分析可见特异性的FABP3及Flag蛋白表达。结论构建了FABP3基因真核表达载体pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并于COS-7细胞中成功转录表达,为后续研究奠定了基础。     

高迁移率族蛋白HMGB2的细胞内定位及移位研究

目的 观察鼠高迁移率族蛋白B2(HMGB2)在真核细胞中的定位和移位情况.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增得到HMGB2编码序列.然后将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒命名为pcDNA3-HA-HMGB2,随后将其转染NIH 3T3细胞.荧光显微镜观察仅转染质粒的细胞和质粒转染与亚砷酸钠刺激30min和1h后细胞内HA-HMGB2融合蛋白的定位及移位情况.结果 重组质粒经酶切、聚合酶链反应(FCR)和测序鉴定证明构建正确,并在NIH 3T3细胞中得到大量表达.荧光显微镜观察发现,FIA-HMGP2蛋白主要分布于细胞核中,经亚砷酸钠刺激后30min,部分细胞中的蛋白从胞核移位到胞质,刺激1h后蛋白则主要分布于胞质中.结论 成功构建带HA标签的HMGB2真核表达载体.该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位、移位,为下一步深入研究HMGB2作用细胞的信号通路提供了一个重要工具.     

P16、P21蛋白表达与肝细胞癌预后的关系

 目的 研究P16、P21蛋白表达与肝细胞癌(HCC)预后的关系.方法 采用免疫组化SABC法染色检测46例HCC组织与38例癌旁组织P16、P21蛋白的表达情况,并分析其与预后的关系.结果 P16蛋白的阳性表达率在HCC(41.3%)显著低于癌旁组织(65.8%)(P＜0.05),P16蛋白阳性表达在术后3年复发组(17.4%)显著低于无复发组(73.7%)(P＜0.01),在3年存活组(64%)显著高于死亡组(11.8%,P＜0.01).P21蛋白的阳性表达率在HCC(19.6%)显著低于癌旁组织(52.6%)(P＜0.01),P21蛋白阳性表达在术后3年复发与无复发组差异无统计学意义,在术后3年存活组与死亡组差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 P16、P21蛋白的表达缺失同HCC的发生密切相关.且P16蛋白表达缺失与HCC的预后相关.P16蛋白的表达缺失是HCC预后的一个可靠因子.     

Grp-94在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

目的研究葡萄糖调节蛋白94（Grp-94）在子宫内膜癌组织中的表达及其临床病理学意义。方法应用免疫组化S—P法检测50例子宫内膜癌组织中Grp-94表达,同时回顾性研究了表达与子宫内膜癌发生、浸润及转移等临床病理学参数的关系。结果在50例子宫内膜癌组织中,Grp-94的阳性表达率为68．0％（34／50）,对照组织中Grp-94的阳性表达率为6．0％（3／50）,子宫内膜癌组织中的阳性表达率高于对照组织的阳性表达率,两组间比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。不同分化程度高分化、中分化、低分化Grp-94的阳性表达检出率分别为56．5％、70．0％和82.4％。三者比较,r=6．0．P〈0．05．统计学差异有显著性,随着分化程度的恶化,Grp-94的阳性表达增高。无淋巴结和有淋巴结转移Grp-94的阳性表达检出率分别为40．0％和86．7％,统计学检验显示,χ^2=24．0,P〈0．05,Grp-94的阳性表达在子宫内膜癌组织的表达升高与淋巴结转移明显相关。临床分期T Ⅰ～Ⅱ和TⅢ～ⅣGrp-94的阳性表达率分别为69．4％、64.3％,两者比较,χ^2=0．4,P〉0．05,统计差异无显著性。结论Grp-94与子宫内膜癌的发生发展关系密切,可成为子宫内膜癌转移及预后的标志物,与临床分期关系不密切。     

胃癌及肠上皮化生组织中P53、C-myc蛋白表达

目的:探讨P53、C-myc表达在胃癌发生、发展中的作用.方法:对60例胃癌、10例肠上皮化生组织和10例对照组,应用免疫组化检测P53和C-myc基因蛋白.结果:胃癌组的突变P53和C-myc基因表达均显著增高(P＞0.01),而肠上皮化生组中P53和C-myc的表达与正常组无显著差异(P＞0.05),肠上皮化生组的C-myc表达明显低于胃癌组(P＞0.01).结论:P53基因发生突变、失活以及C-myc基因激活,在胃癌的发生中可能起重要作用,检测C-myc基因蛋白表达有助于预测胃粘膜癌变.     

蛋白激酶C亚型在慢性"炎症性"肺动脉高压大鼠肺动脉中的表达

目的 研究慢性"炎症性"肺动脉高压大鼠在肺动脉高压形成过程中肺动脉蛋白激酶C(PKC)亚型的表达.方法 建立野百合碱诱导的慢性"炎症性"肺动脉高压大鼠模型,应用Western blot技术检测肺动脉高压形成过程中大鼠肺动脉四种PKC亚型(PKCα、PKCβⅡ、PKCδ和PKCε)的表达变化.结果 PKCα、PKCβⅡ和PKCδ亚型在正常和肺动脉高压大鼠肺动脉中均有表达,而PKCε亚型未检测到.在肺动脉高压形成过程中,大鼠肺动脉胞浆和胞膜组分表达的PKCα均逐渐上升,到第14天达到高峰后略有下降,且胞膜表达量的升高远比胞浆明显.胞浆PKCβⅡ和PKCδ表达量均在第8天达最高,而胞膜中二者均表现出持续升高的趋势.结论 PKCα、PKCβⅡ和PKCδ亚型可能参与了慢性"炎症性"肺动脉高压的形成,其表达变化可能与其转位有关.     

S100A2全长基因真核表达载体pEGFP-N2-S100A2的构建及其在胃癌细胞系BGC-823中的表达

 目的 克隆S100A2 cDNA,构建pEGFP-N2-S100A2重组表达载体,转染胃癌细胞系BGC-823,为探讨其对胃癌细胞系的影响奠定实验基础.方法 应用RT-PCR 和DNA 重组技术构建pEGFP-N2-S100A2 融合蛋白表达载体,质粒经测序正确后,用脂质体转染BGC-823 细胞.结果 重组质粒经限制性酶切鉴定得到与S100A2全长基因长度一致(294 bp) 的酶切产物; 测序分析证实,重组质粒中含有一与GenBank 上登录的S100A2基因(NM-005978) 序列完全一致的序列,表明成功地完成了表达载体的构建; 荧光显微镜下可见转染的BGC-823 细胞有绿色荧光蛋白的表达.结论 构建完成真核表达载体pEGFP-N2-S100A2,S100A2基因在BGC-823细胞内成功表达.     

氡诱发小鼠肺损伤与P53和Bcl-2、Bax蛋白表达的研究

目的 建立氡染毒小鼠肺损伤模型,观察不同剂量组小鼠肺组织损伤情况,分析氡对P53、Bcl-2、Bax在肺组织中表达的影响。方法 建立氡染毒小鼠模型,使染毒累积剂量分别达到30工作水平月(WLM)和60WLM;采用TUNEL法检测小鼠肺组织细胞凋亡程度;采用免疫组化SP法及Westernblot法,检测各组肺组织P53、Bcl-2、Bax蛋白表达情况。结果 与正常对照组相比,氡染毒30和60WLM小鼠肺细胞凋亡指数均明显增加(t=18.11、-10.30,P<0.05);氡染毒30WLM组P53蛋白明显增加(t=-11.08,P<0.05);60WLM组P53蛋白和Bax蛋白表达明显增加(t=-7.00、-2.52,P<0.05),Bcl-2蛋白表达明显下降(t=4.36,P<0.05);氡染毒30和60WLM与对照组相比,Bcl-2、Bax比值均明显下降(t=2.78、4.07,P<0.05)。结论 氡染毒可使小鼠肺损伤,出现肺细胞凋亡,P53、Bcl-2、Bax途径可能参与了肺细胞的凋亡调节。     

串联MS2衣壳蛋白和MS2特异结合RNA表达载体构建及应用

目的构建体内研究RNA-蛋白相互作用的表达载体。方法利用MS衣壳蛋白可与MS2结合位点（MS2bs）RNA特异性结合的特点,通过设计特异引物,构建pcDNA3．0-Flag．2XMS2和pcDNA3．0—12XMS2％s表达载体,以及表达MEG3非编码RNA的表达载体pcDNA3．0-EG3V1—12XMS2bs。共转染细胞,进行RNA免疫沉淀,所得RNA进行实时定量PCR分析验证。结果成功构建了pcDNA3．0-Flag-2XMS2和pcDNA3．0．12XMS2bs表达载体,实时定量PCR结果表明,与对照相比能明显富集MEG3V1非编码RNA分子。结论成功构建了体内研究RNA-蛋白质相互作用的表达载体,为RNA一蛋白相互作用研究提供了新的技术方法。     

IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn UK融合基因为目的基因 ,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力 ,然后挑选高表达的克隆 ,通过MTX加压扩增 ,以提高IIn UK融合基因的拷贝数及表达水平。结果与讨论 :构建了 5种新型真核表达载体 ,并筛选出优化的真核表达载体 ,通过MTX加压扩增 ,实现了IIn UK融合基因在CHO细胞中的高表达 ,表达量达到 10 μg/ (10 6细胞·2 4h )。     

Ig样蛋白的表达与恶性肿瘤分化及增殖细胞核抗原的相关性分析

目的：探讨Ｉｇ样蛋白的表达与恶性肿瘤分化及增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ,ＰＣＮＡ）的关系。方法：应用免疫组织化学方法对３２例乳腺癌,大肠癌,胃癌等上皮性恶性肿瘤及相位正常组织细胞内Ｉｇ样蛋白的表达与肿瘤分化,增殖细胞核抗原表达的相关性进行了分析。结果Ｉｇ样蛋白与ＰＣＮＡ在这些肿瘤细胞内部呈阳性反应,而在相应的正常组织细胞内这两种蛋白表达很少或不表达     

蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

目的通过基因工程手段实现牵引丝关键组成蛋白MaSp1在大肠杆菌中的异源表达,并对其进行分离纯化,从而建立基因工程蜘蛛丝基因序列串联拼接、载体构建以及原核表达与纯化的关键技术体系。方法利用同尾酶连接法对合成的基因工程蜘蛛丝基因单体序列进行串联拼接,获得多倍串联体克隆重组子,将鉴定正确的多倍串联体克隆重组子与原核表达载体pET28a（＋）连接,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导其表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western印迹进行鉴定。在此基础上对工程菌进行高密度发酵,所获蛋白通过硫酸铵分级分离方法进行纯化。结果与结论成功构建了基因工程蜘蛛丝MaSp1多串联体的表达载体,原核表达蛋白的相对分子质量与预期一致,且纯化的目的蛋白纯度达80%以上。上述研究工作为开展基因工程蜘蛛丝蛋白的规模化制备建立了关键技术方法,并为后续基因工程蜘蛛丝的人工纺丝提供必要的前提和工作基础。