气相色谱-燃烧-同位素质谱仪(GC-C-IRMS)测定游离氨基酸的δ13C值

氨基酸的δ13C值测定方法是开展13C标记代谢流分析研究的关键技术手段.建立了气相色谱-燃烧-同位素比率质谱仪测定发酵液中游离氨基酸的δ13C比值方法,结果表明,该方法稳定性好,氨基酸分离度佳,重复测定标准偏差小于0.5‰,完全满足在低丰度同位素标记代谢流分析精度要求,为今后采用大规模低丰度13C标记开展传统白酒和黄酒发酵过程的代谢机理的研究提供了有效的技术手段.     

不同干燥方法对菌体蛋白氨基酸分离鉴定的影响

分别采用氮吹法、烘干法和真空冷冻干燥法对淀粉酶产色链霉菌的菌体蛋白氨基酸进行干燥处理,使用气相色谱与质谱联用对相应氨基酸衍生物的出峰时间及峰面积进行分析,结果表明,相较于氮吹法和烘干法,经真空冷冻干燥法预处理后,所需的16种氨基酸衍生物均可被检出,因此,真空冷冻干燥法是淀粉酶产色链霉菌中菌体蛋白氨基酸的可靠制备方法。该方法的建立为今后开展13C同位素代谢通量分析,深入阐明ε-聚赖氨酸生产机制,提供了技术保障。     

梨白兰地中乙醇碳同位素分布特征研究

利用元素分析-稳定同位素比值质谱仪测定梨白兰地原料的糖中δ13C,发酵后用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法分析乙醇中碳稳定同位素比值(δ13C)。结果显示梨的糖中δ13C值分布在-27‰~-25‰,而发酵后的乙醇δ13C集中在-30‰~-27‰,且糖与乙醇的δ13C具有良好的线性正相关关系(R2=0.98);白兰地精馏过程中乙醇出现反蒸汽压分馏效应,但酒体部分(50%vol~80%vol)δ13C值波动较小,重现性较好,且与发酵醪中的δ13C值较一致。模拟实验表明,乙醇δ13C值与玉米酒精含量和蔗糖含量成正相关关系,发酵前添加蔗糖和玉米酒精均会改变产品中乙醇δ13C值,因此碳稳定同位素技术可作为检测白兰地中C4来源的酒精或发酵前C4植物糖掺假的鉴别手段。     

醋酸对巴氏醋杆菌生长和代谢活性的影响

醋酸对微生物具有较高的毒性,醋酸菌具有特殊的机制能够耐受较高浓度的醋酸,常用于醋酸的发酵生产。本论文以巴氏醋杆菌AC2005为研究对象,研究了醋酸对菌体生长、葡萄糖代谢和胞内ATP浓度的影响。与不含醋酸条件下相比,培养基中加入1%(V/V)的醋酸,菌体的生物量增加了92%,单位菌体葡萄糖消耗速率增加了13%,细胞代谢活性增加了120%,代谢产物中丙酮酸浓度增加了约46%,柠檬酸和琥珀酸的浓度分别降低了80%和46%,胞内ATP浓度增加了171%。进一步利用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)的方法分析了蛋白表达情况,发现加入醋酸后细胞内与三羧酸循环相关的蛋白明显上调。结果表明,醋酸菌可以通过提高菌体代谢活性,增加胞内ATP浓度,从而耐受较高浓度的醋酸。     

发酵乙醇中~(13)C/~(12)C分布的影响因素研究

乙醇的碳稳定同位素组成(13C/13C,δ13C)对饮料酒的真实性鉴别具有重要意义。实验研究发现,乙醇δ13C比发酵原料偏负,且偏负程度随δ13C的变小而增大,但二者呈现显著正相关(R2=0.997);正交试验结果显示,对于乙醇δ13C变化影响较大的发酵条件依次为发酵温度(20~30℃),糖浓度(60~200 g/L)和酵母种类,而初始p H值(4.0~5.0)的影响最小,但F检验表明,4种因素对乙醇δ13C的影响均不显著。本研究为今后应用δ13C识别乙醇的原料来源奠定了应用基础。     

碳稳定同位素在白酒真实性中的应用

本研究优化了有机溶剂稀释法结合气相色谱-燃烧-同位素质谱仪(GC-C-IRMS)测定白酒中乙醇中碳同位素比值(δ13C)的方法。分析了5种年份原酒、24种市场流通固态法白酒以及14种固液法白酒的δ13C值。结果表明:同系列的年份原浆酒中乙醇δ13C值基本无差异;酒中乙醇δ13C值与酿酒粮食和产地有一定关系;利用δ13C鉴别固液法和固态法白酒具有一定可行性。     

定量代谢物组学研究硫酸铵添加对高产红色糖多孢菌生理代谢的影响

为了考察添加硫酸铵对高产红色糖多孢菌生理代谢的影响,首先研究了硫酸铵添加对菌体量、红霉素效价、比葡萄糖消耗速率、比红霉素合成速率等表观生理参数的影响;并进一步采用13C辅助的定量代谢物组学初步探索其调控机理,对比了硫酸铵添加后胞内有机酸、氨基酸等代谢物水平的变化情况。结果表明:在红霉素发酵后期的培养基中添加硫酸铵后,比红霉素合成速率和比葡萄糖消耗速率分别比对照组提高了30.0%、47.2%,表明菌体代谢活性得到提高。与对照组相比,红霉素效价从830 μg/mL提高至1126 μg/mL,红霉素A组分的比例从802.9 μg/mL提高到956.1 μg/mL,红霉素C的转化率在96 h达到99.2%。定量代谢物组学结果表明添加硫酸铵后胞内有机酸水平差异明显,其中α-酮戊二酸浓度的降低(4.15 μmol/g DCW到1.05 μmol/g DCW)有利于菌体生长维持。胞内菌体合成前体类和红霉素合成前体类氨基酸均有所提高,其中脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸浓度分别提高了60.4%、90.0%、204.2%、106.7%。利用定量代谢物组学研究红霉素发酵过程中氮源对胞内中心碳代谢影响大大加深了对红霉素工业生产菌代谢特性的认识,为后续的工业化生产提供了一定的指导意义。     

碳同位素比值法检测棕榈油掺入玉米油的研究

用碳同位素比值法对玉米油的掺伪进行研究.利用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱仪获得玉米油与棕榈油主要脂肪酸的δ13C值,构建其混合油中3种主要脂肪酸的δ13C值－混合比例的标准曲线.结果表明,玉米油与棕榈油的δ13C值差异很大,把棕榈油和玉米油进行掺和,可以检出15%以上的掺伪水平.     

进食状态下不同时间点血中标记氨基酸浓度和丰度差异性分析

目的通过示踪剂动态观察蛋白质和氨基酸的代谢变化过程中在同位素丰度达到稳定的平台期时,不同的时间点血液中标记氨基酸的丰度与浓度的变化,以此反映不同时点蛋白质和氨基酸的氧化分解状况。方法选取20名健康成年男性为研究对象,分为2组,以7 d为一个实验周期,给予受试者日常膳食5 d后,第6天经静脉滴注给予稳定同位素13C标记的亮氨酸,持续3 h。在输液结束前的30 min内每隔15 min取一次血液样品,测定血样中亮氨酸的浓度与13C的丰度值,并比较各时点丰度及浓度的差异性。结果二组受试者3个时间点亮氨酸的浓度与13C丰度值之间的差异无统计学意义。结论在进食状态下持续给予受试者稳定同位素的过程中,不同时间点机体蛋白质和氨基酸的氧化分解处于一个相对稳定的状态,可以在此时期内确定一个同一的时间点来研究机体处于不同的蛋白质和氨基酸营养状态下的各项代谢动力学参数。     

冻干保护剂影响植物乳杆菌代谢途径的研究

本文利用代谢组学方法,对比研究了添加不同冻干保护剂对植物乳杆菌dy-1(L.P dy-1)冻干菌粉发酵过程中代谢途径的影响。研究采用气质联用技术(GC-MS)分析菌体胞内代谢物,通过偏最小二乘法(PLS)和模式识别分析不同冻干保护剂组的差异代谢物,并结合KEGG等数据库对差异变量参与的代谢途径进行解析。结果表明,分别添加10%菊粉、22.4%菊粉、菊粉复合保护剂和脱脂乳复合保护剂,对L.P dy-1冻干粉发酵过程中的能量代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢的影响存在差异:菊粉的添加量由10%增加至22.4%,冻干菌粉与直接活化菌体在发酵过程中的代谢特征差异缩小;与脱脂乳复合保护剂相比,菊粉复合保护剂能够使冻干菌体在代谢特征上更接近于直接活化菌体。贮藏温度对冻干菌粉的代谢影响显著:与4℃相比,-20℃贮藏冻干菌粉更有利于维持菌体在发酵过程中的正常代谢。     

1,3-丙二醇发酵液的絮凝处理及絮凝细胞的再利用

考察了12种絮凝剂或沉淀剂对1,3-丙二醇发酵液预处理的效果,并探索了壳聚糖絮凝Klebsiellapneumoniae细胞再利用的可行性。以菌体和蛋白质去除率为指标,从12种絮凝剂中筛选出壳聚糖为有效的絮凝剂,并确定了适宜的工艺条件为:温度37℃,搅拌转数300 r/min,pH 5.0,壳聚糖分子质量4万u,浓度0.5 g/L,搅拌20 min,静置15 min。发酵液的菌体和蛋白质去除率分别为99.97%和91.56%。絮凝细胞的发酵实验表明,絮凝的K.pneumoniae可再次利用,菌体浓度高达11.4(OD值)。     

葡萄糖浓度对产丁醇芽孢杆菌菌体生长与代谢特性的影响

研究了在兼性厌氧条件下初始葡萄糖浓度对产溶剂芽孢杆菌(Bacillus sp.)C2菌株菌体生长和代谢特性的影响。结果表明:5%初始葡萄糖浓度下菌体的生长速率低于低糖浓度的处理;随发酵产物浓度升高,部分菌体变长;前芽孢及成熟芽孢数量在发酵过程中变化不明显。2%、4%和5%初始糖浓度下,总溶剂产量分别在发酵的72、54和90 h达到最高值,为5.49、11.96和18.4 g/L,其中丁醇占70%,总溶剂的产率分别为0.309、0.303和0.366 g/g。3%初始糖浓度发酵时,发酵于36 h前停止,溶剂产量仅为2.4 g/L。     

δ~(13)C_H值小于δ~(13)C_P值的蜂蜜样品的综合鉴评

为加强蜂蜜真实性监测,从124份市面蜂蜜样品中筛选出51份δ13CH值(蜂蜜的δ13C值)小于δ13CP值(蜂蜜中蛋白质的δ13C值)的蜂蜜样品,采用元素分析-同位素质谱联用技术(EA-IRMS)、液相色谱-同位素质谱联用技术(LC-IRMS)以及液相色谱测定蜂蜜还原糖含量等多种检测手段,通过检测这些蜂蜜样品的系列稳定碳同位素比值、还原糖和蔗糖含量,对δ13CH值小于δ13CP值的蜂蜜样品进行了综合分析。结果表明:51份源于δ13CH值小于δ13CP值无法检测碳-4植物糖的样品,δ13CH值皆小于-23.5‰,2份样品还原糖含量低于60 g/100g,1份样品蔗糖含量超标,含量为7 g/100g,目前常规检测方法难以有效鉴评δ13CH值小于δ13CP值蜂蜜样品的真实性。将δ13CP-H(δ13CP-δ13CH)、Δδ13CF-G(δ13CF-δ13CG)、Δδ13Cmax(各类糖组分δ13C值的最大差值)以及寡糖检出等指标纳入综合鉴评,发现51份蜂蜜样品中的47份存在掺假掺杂嫌疑,所占比率高达92.16%,掺假掺杂主要以添加碳-3植物源转化产物为主,掺假原料可能是多类物质的复配组合。     

酿酒粮食发酵蒸馏乙醇碳稳定同位素的变化

对混合原料总δ13C→总糖δ13C→发酵乙醇δ13C→蒸馏乙醇δ13C的变化规律进行了研究,结果表明,发酵粮食的种类、比例决定了发酵原材料的总δ13C,进而影响发酵粮食的总糖δ13C,最终影响发酵乙醇δ13C,这种影响具有显著的线性相关性,使酿酒原料δ13C决定发酵乙醇δ13C;当酿酒原料为混合粮食时,发酵乙醇δ13C反映但不可准确辨别酿酒原料;蒸馏过程微弱影响着白酒不同摘酒段的乙醇δ13C,使酒头>一级酒>二级酒乙醇δ13C,但在大生产上对不同品级成品酒乙醇δ13C无显著影响。本研究为白酒及其原料真实性的鉴别工作添砖加瓦。     

NH_4~+对合成气乙醇发酵过程的影响及其酶学机理

为研究合成气厌氧乙醇发酵中合成气杂质组分NH_3对发酵过程的影响,实验通过考察发酵培养基内不同初始浓度的NH~+_4对菌株A-fm4,Clostridium ljungdahlii和Clostridium autoethanogenum DSM10061利用生物质合成气发酵乙醇的影响,证实低浓度的NH~+_4可促进菌体生长和乙醇发酵,当其浓度高于9.35 mmol/L时,菌体生长和乙醇发酵随其浓度的增大而抑制显著。对菌株在菌体生长期和乙醇/乙酸发酵期内4种关键酶的活性研究表明,氢化酶(H_2ase)、一氧化碳脱氢酶(CODH)、乙醇脱氢酶(ADH)和乙酸激酶(ACK)均受高浓度(149.6 mmol/L)NH~+_4抑制,且菌体生长期的酶活水平均高于发酵期的值。这说明在低浓度NH~+_4下可促进还原力的产出而利于乙醇发酵,而较高浓度NH~+_4抑制代谢途径,致使菌体生长和乙醇发酵受阻。菌株C.ljungdahlii和C.autoethanogenum DSM10061的K_i值分别为208.13 mmol/L和240.37 mmol/L,耐铵能力较强,可作为未来耐铵菌株的驯化提供材料,为降低工业生产成本和减少合成气净化工艺工序奠定基础。     

氨基酸发酵液菌体蛋白提取工艺技术探究

对氨基酸发酵尾液中的18种氨基酸的检测结果显示,发酵液中总氨基酸含量在3%～3.3%。结合实验研究和生产实践情况,总结了絮凝沉淀法和碟片分离法在谷氨酸和苏氨酸发酵液中提取菌体蛋白的工艺技术。絮凝沉淀法包括化药操作、蛋白提取和烘干等操作。研究得出一套高效的菌体蛋白提取工艺参数,并提出在絮凝剂的选择、工艺设备的参数优化等方面还有一定的探索空间;碟片分离是菌体蛋白提取的高效方法,应通过工作参数的优化,在保证提取率的前提下继续降低能耗。     

地衣芽孢杆菌分批补料发酵γ-聚谷氨酸

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid,γ-PGA）是一种应用于食品、农业、医药等领域的生物聚合物。在不补料发酵γ-PGA过程中,存在因培养基中碳源、氮源不足导致菌体生长发育和γ-PGA合成受限的情况。为实现γ-PGA高产,采用分批补料发酵方式补充菌体生长代谢所需的碳源和氮源,在5 L发酵罐中进行γ-PGA分批补料发酵优化,并在200 L发酵罐进行放大验证。结果表明：当培养基中葡萄糖含量低于5 g/L、氨氮浓度低于0.5 g/L时开始流加补料,持续补料12 h将培养基中葡萄糖浓度维持在5 g/L～15 g/L,氨氮浓度维持在0.5 g/L～1.0 g/L。与不补料发酵相比,这一优化使得菌种指数生长期延长了6 h,生物量（OD660）达到了0.62,提升了39.01%,谷氨酸含量降至16 g/L,谷氨酸利用率提升了38.47%,γ-PGA生产强度和产量分别为15.69 g/（L·d）、（47.09±0.82）g/L,均提高了38.45%,为γ-PGA工业化生产提供了技术支撑。     

一株高产δ-ALA的酿酒酵母菌株的固态发酵条件优化及其代谢产物检测方法

通过发酵底物、发酵培养基、发酵时长的优化,确定高产δ-氨基乙酰丙酸(δ-ALA)的菌株PRS-416固态发酵的最佳工艺条件,并对分光光度法、高效液相色谱法及液相色谱-质谱法3种方法测定δ-ALA的结果进行比较,建立测定饲料中δ-ALA的检测方法。结果表明,发酵底物玉米∶玉米蛋白粉∶豆粕∶大米粉的最佳比例为4∶1∶0∶0,发酵培养基的最佳比例为葡萄糖0.25%、丁二酸0.5%、甘氨酸0.5%,最佳发酵时长为48 h。在最佳发酵条件下,烘干后的发酵产物中δ-ALA含量可达到338.87 mg/kg;利用分光光度法测定δ-ALA含量,会存在一定的偏差,需要与高效液相色谱法进行结合测定,并用液相色谱-质谱法进行定性,才能保证结果的准确性。     

菌株Bacillus sp ST06-95转化植物甾醇为雄甾烯酮发酵条件的优化

利用本研究室筛选获得的Bacillus sp ST06-95为出发菌株,对植物甾醇进行选择性侧链降解制备雄甾-4-烯-3,17-二酮 (AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD).对转化条件如底物浓度、投料方法、投料时间进行了摸索,对发酵初始pH、转化时间、发酵温度、接种量、培养基组成等进行了优化.结果表明,用0.4%的Tween80配合超声波溶解、底物浓度为0.5%、菌体未生长时投加底物转化效果最佳.最佳发酵条件为:初始pH7.0、接种量12%、发酵温度30℃、发酵时间160h,发酵培养基中甘油与葡萄糖的含量为1∶ 4.在最佳转化条件下产物ADD与AD的得率从优化前的29.5%提高到42.5%,其中ADD与AD的含量比值大约为4∶ 1.     

白酒丢糟生产菌体蛋白饲料的研究

以浓香型白酒丢糟为主要原料,通过混合菌种协同发酵生产菌体蛋白,提高白酒丢糟中营养蛋白含量。实验结果表明：在发酵时间为60h、发酵起始pH6.5、投料比（麸皮∶酒糟）为1∶1.5、接种量在4%、溶氧条件为60g/500mL、硫酸铵添加量0.5%条件下发酵生产菌体蛋白可以提高丢糟的营养水平。