细粒棘球蚴重组铁蛋白和重组线粒体苹果酸脱氢酶免疫差异的初步观察

目的比较细粒棘球蚴重组铁蛋白(rEgferritin)和重组线粒体苹果酸脱氢酶(rEgmMDH)对感染细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)小鼠的免疫差异。方法 30只雌性ICR小鼠随机分为3组(rEgferritin免疫组、rEgmMDH免疫组和对照组)。将rEgferritin、rEgmMDH和PBS与佐剂乳化后,分别于背部皮下多点注射免疫小鼠,每次注射100μl/只(含抗原10μg),共免疫3次,每次间隔2周。末次免疫后2周,3组小鼠分别于腹腔注射0.1 ml原头节悬液(约1 500个)进行攻击感染,22周后剖杀,无菌取脾组织,并记录包囊数量和直径,评价免疫保护力。用流式细胞仪检测脾组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞,计算两者比例。结果 rEgferritin免疫组30%(3/10)小鼠有包囊,包囊总数为5个;rEgmMDH免疫组小鼠均有包囊,包囊总数为118个;对照组9只小鼠中7只有包囊,包囊总数为35个。rEgferritin免疫组小鼠获得了84.7%的免疫保护力,而rEgmMDH组无免疫保护力。小鼠脾淋巴细胞CD4+亚群百分比,rEgferritin免疫组[(57.50±7.02)%]显著高于对照组[(43.60±6.09)%](P<0.05)。小鼠脾淋巴细胞CD8+亚群百分比,rEgferritin免疫组[(25.66±6.18)%]和rEgmMDH免疫组[(19.23±5.40)%]与对照组[(21.80±6.12)%]比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。小鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+亚群比值,rEgferritin免疫组和rEgmMDH免疫组与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)结论 rEgferritin能抑制细粒棘球蚴的生长,而rEgmMDH促进了细粒棘球蚴的生长。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)亲肌肉抗原重组蛋白的免疫保护性研究

目的探讨细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)亲肌肉抗原重组蛋白的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值。方法ICR小鼠随机分为蛋白免疫组和佐剂对照组,每隔2w皮下免疫1次,在第3次免疫后2周,用Eg原头蚴进行攻击感染,感染后20w剖杀小鼠,检获棘球蚴包囊,计算免疫保护力,并用ELISA法测定血清中IgG及其亚型和IgE水平。结果与佐剂对照组比较,蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为94.46%;与免疫前比较,免疫后和攻击感染后蛋白免疫组小鼠血清IgG、IgG1、IgG3和IgE水平均明显升高(P<0.05),IgG2b降低(P<0.05)。结论细粒棘球绦虫亲肌肉抗原重组蛋白能诱导小鼠产生一定的保护性免疫,是潜在的疫苗候选抗原分子。     

pIL-12质粒DNA对细粒棘球蚴感染小鼠免疫应答的影响

目的探讨pIL-12质粒DNA免疫对细粒棘球蚴感染小鼠免疫应答的影响。方法将pIL-12质粒DNA肌肉注射免疫BALB/c鼠,免疫后8w用Eg原头节进行攻击感染,感染后18w剖杀小鼠,计算减蚴率;取脾并分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比;用EgAg或ConA刺激培养脾细胞,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平;流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率,同时设有BCG和PBS对照。结果pIL-12质粒DNA免疫组的减蚴率为44.85%,脾CD4+和CD8+T细胞亚群显著增加,IL-2、IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低,脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组。结论pIL-12质粒DNA可诱导细粒棘球蚴感染小鼠产生一个保护性的免疫反应。     

小鼠感染细粒棘球蚴早期TGF-β1表达分析

目的观察细粒棘球蚴早期感染BALB/c小鼠TGF-β1的表达情况。方法用细粒棘球蚴感染BALB/c小鼠,分别于感染后第1、3、5、7、9、12d处死,取其脾细胞和外周血,采用酶联免疫法检测外周血细胞因子TGF-β1的含量,采用qRT-PCR法检测TGF-β1基因的表达量。结果实验鼠Eg感染后第1~12d,外周血TGF-β1的含量为2 695.79~3 055.09ng/ml,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1mRNA相对表达量为0.029~0.060,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1及其mRNA表达量均有随着感染时间延长呈增高的趋势。结论TGF-β1在小鼠细粒棘球蚴感染早期表达增加,可能有利于细粒棘球蚴的免疫逃逸。     

四种小鼠对细粒棘球蚴感染情况观察

为了解新疆人体细粒棘球蚴对不同种株小鼠的易感性,小鼠感染细粒棘球蚴后对子一代小鼠感染能力的影响,我们采用实验性继发性包虫动物模型(Deve.compleRenclu Sean Boil 1933;144:455)观察感染小鼠对细粒棘球蚴的感染情况,筛选出理想的实验小鼠种株。     

细粒棘球蚴感染对小鼠炎症性肠病的保护机制研究

目的 观察细粒棘球蚴感染对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠炎症性肠病(IBD)症状的保护作用及可能机制。方法 建立继发性细粒棘球蚴感染小鼠模型,再给予DSS诱导IBD症状,解剖后ELISA法检测小鼠血清中囊液抗原水平,并观察腹腔内的包囊;根据每日体重监测、解剖后结肠长度测量及结肠组织病理学评分指标评估细粒棘球蚴感染对炎症性肠病的保护作用;采用流式细胞术CBA法检测模型鼠血清中Thl/Th2/Thl7水平,评价细胞因子对炎症性肠病的保护作用。结果 小鼠感染细粒棘球蚴后血清HCF抗体阳性率与成囊率均为100%。细粒棘球蚴感染减轻了DSS引起的小鼠体重下降程度;结肠变短程度减小,HE染色检查小鼠结肠组织炎性症状显著改善。CBA检测显示细粒棘球蚴感染小鼠血清IL-4、IL-10、IL-17A、IL-6、IFNγ含量均较正常小鼠显著增加,表现为Th2为主的免疫反应;细粒棘球蚴感染合并IBD模型组小鼠Th2/Th1型细胞因子比率同IBD组相比显著升高。结论 细粒棘球蚴感染IBD模型小鼠血清IL-4、IL-10水平升高,Th2高水平状态削弱了DSS引发的Th1反应,表明细粒棘球蚴感染可改善IBD小鼠...     

细粒棘球蚴慢性感染阶段小鼠血清中炎症因子的变化及意义

目的研究细粒棘球蚴慢性感染阶段小鼠血清中细胞因子水平的变化,探索机体对抗寄生虫感染的免疫应答 机制。方法从病羊内脏分离细粒棘球绦虫原头节,注射入BALB/c小鼠腹腔（2 000个原头节/只）,建立细粒棘球蚴感染 小鼠模型,对照组小鼠腹腔注射等体积PBS。于感染5个月后,采集对照及感染组小鼠血清,采用流式液相多重蛋白定量 技术检测血清中多种细胞因子水平并分析。结果感染组小鼠腹腔、肝脏、肺脏等部位均出现多个单一性包囊;其血清 中IL?17A、IL?6、IFN?γ、MCP?1、IL?12P70、TNF?α等炎症因子水平均显著高于对照组（t = 2.713～9.255,P 均< 0.05）;而抑 炎因子IL?10水平亦显著升高（t = 3.936,P < 0.001）。结论细粒棘球蚴慢性感染阶段小鼠体内炎症因子水平较高,有助 于抑制虫体生长。     

不同药物对小鼠肝细粒棘球蚴术后感染的抑制作用

目的:探讨不同药物对小鼠肝细粒棘球蚴感染的抑制作用,了解增强宿主免疫功能对小鼠肝细粒棘球蚴感染的影响.方法:取包虫囊液成功免疫小鼠,分为药物治疗组和模型对照组.肝脏接种原头蚴前1 wk及接种后1 mo,药物治疗组分别用阿苯哒唑脂质体、槐耳浸膏及阿苯哒唑脂质体联合槐耳浸膏治疗,接种头节时各药物治疗组再分为4组,每组头节分别使用750 mL/L乙醇、200g/L高渗盐水、阿苯哒唑脂质体及平衡液处理后接种.模型对照组头节用平衡液处理后直接接种,接种后3 mo观察小鼠肝细粒棘球蚴大体和病理变化,检测小鼠脾脏指数、外周血IgG和IgE水平,并用流式细胞仪检测小鼠外周血CD4 和CD8 淋巴细胞的百分率.结果:联合治疗组中小鼠肝细粒棘球蚴生发层和角质层破坏较严重.各药物治疗组小鼠脾脏指数、IgE水平明显低于模型对照组(3.84±0.86,3.95±1.01,3.27±0.52 vs 5.46±0.52;0.06±0.08 μg/L,0.07±0.08 μg/L,0.03±0.03μg/L vs 0.20±0.02 μg/L,均P<0.01),其中联合药物治疗组降低最为明显;药物治疗组IgG水平与模型对照组相比无显著性差异.药物治疗组CD8 水平明显低于模型对照组(16.60±3.89,18.18±3.90,15.38±2.63 vs 32.90±4.71,均P<0.01),CD4 /CD8 明显高于模型对照组(3.21±0.70,3.05±0.66,3.53±0.57 vs 1.57±0.26,均尸<0.01),其中联合治疗组变化最为明显.结论:阿苯哒唑脂质体与槐耳浸膏联合用药可以明显增强小鼠免疫功能,抑制细粒棘球蚴的生长,使小鼠肝细粒棘球蚴病术后感染率降低.     

甲苯咪唑对小鼠体内棘球蚴囊的渗透作用

作者应用~(14)C-甲苯咪唑治疗感染细粒棘球绦虫的小鼠,分别测定给药后不同时间药物在血液、棘球蚴囊壁和囊液中的浓度变化,以此观察甲苯咪唑对棘球蚴囊的渗透作用。方法:取未成熟CF_1雌性小鼠,腹腔注射感染1,000条细粒棘球绦虫原头蚴,15个月后,选用严重感染的小鼠为实验对象,每鼠平均体重为55±3g。12鼠用~(14)C-甲苯咪唑糖     

MMP2与细粒棘球蚴感染小鼠肝纤维化研究

目的通过检测细粒棘球蚴感染小鼠肝脏中MMP2及其mRNA表达水平的变化,探讨其在肝纤维化过程中的作用。方法收集感染细粒棘球蚴病羊肝脏,取肝脏囊泡中的原头蚴处理后接种实验组小鼠肝脏,建立细粒棘球蚴病动物模型。于感染后2、8、30、90和180d各取8只小鼠处死,无菌收集肝脏,采用RT-PCR检测MMP2mRNA,采用免疫组织化学法检测MMP2在肝脏中的表达。实验设假手术对照组。结果与对照组比较,实验组小鼠肝脏MMP2mRNA水平在感染后2d达高峰(t2d=6.566,P0.01),总体呈现早期高表达,晚期下降的趋势。免疫组化检查实验小鼠肝脏MMP2表达趋势与RT-PCR的结果一致。结论小鼠感染细粒棘球蚴早期肝脏MMP2高表达,中、晚期低表达,这可能是导致细粒棘球蚴小鼠发生肝脏纤维化的机制之一。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导BALB/c小鼠的保护力观察

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率、抗体及其亚类的变化。方法将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;收集血清,常规ELISA测定血清IgG及其亚类和IgE水平,试验设有空载体、Bb和MRS对照。结果皮下注射组、肌肉注射组、鼻腔内接种组和口服灌胃组免疫小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%,血清IgGI、gG2aI、gG2b和IgG1水平显著升高,IgG3和IgE水平显著降低。结论接种Bb-Eg95-EgA31疫苗能诱导小鼠产生保护力,IgGI、gG2aI、gG2b和IgG1起重要作用。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠脾细胞亚群变化的研究

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率及脾细胞亚群的变化。方法将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T细胞亚群的百分比,同时设有空载体、Bb和MRS对照。结果以上4种疫苗接种组小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;疫苗接种组的脾CD4+和CD8+T细胞亚群显著增加,鼻腔内接种和口服免疫组的的CD4+T细胞亚群和CD4+/CD8+比值显著高于皮下和肌肉注射组。结论CD4+和CD8+T细胞亚群在疫苗诱导的保护力中起重要作用。疫苗鼻腔内接种和口服免疫是两种较好的免疫途径。     

Antibody response in CD4-depleted mice after immunization or during early infection with Echinococcus granulosus

The aims of this work were to investigate the existence of T-independent antigens in Echinococcus granulosus protoscoleces and to evaluate the relative contribution of T-independent stimulation to the overall antibody response in early infection. Mice depleted of CD4(+)-cells were immunized with protoscolex somatic antigens (PSA) or infected with E. granulosus protoscoleces (PSC). Results showed that the response of CD4-depleted immunized mice had the expected characteristics of a T-independent stimulation and that such T-independent stimulation was important mainly during primary response. During infection absence of CD4(+)-cells affected mainly the secretion of all IgG subclasses with the exception of IgG3 and IgM. To carry out a preliminary isolation of PSC T-independent antigens we prepared a carbohydrate enriched fraction from protoscolex antigens, using a monoclonal antibody specific for the carbohydrate moiety Gal alpha(1,4)Gal highly expressed in PSC. This fraction was mitogenic for naive mouse splenocytes and was recognized by a high percentage of the specific antibodies secreted by CD4-depleted immunized or infected mice. In summary, these results suggest that E. granulosus protoscoleces contain immunogenic T-independent antigens. Primary antibody responses to protoscolex somatic antigens and the production of IgM and IgG3 in early infection would be mainly stimulated by a T-independent mechanism.     

细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液诱导小鼠细胞因子的变化

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液免疫小鼠被Eg原头节攻击感染后体内棘球蚴囊重减少率及细胞因子的变化。方法热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,同时提取转空质粒(pBI121)苜蓿叶蛋白和正常苜蓿叶蛋白作对照。32只雌性BALB/c小鼠随机均分4组,A和B组分别用转基因苜蓿叶蛋白提取液100μl灌胃和10μl滴鼻免疫小鼠,C组用转空质粒苜蓿叶蛋白提取液10μl滴鼻免疫小鼠,D组用正常苜蓿叶蛋白提取液100μl灌胃免疫小鼠。各组小鼠每3d免疫1次,连续免疫2个月。末次免疫后第8周,各组小鼠用Eg原头节腹腔注射攻击感染(50个/只),感染后第24周剖杀小鼠,分离并称重细粒棘球蚴囊,计算囊重减少率;取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原(EgAg)、伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)刺激培养,收集脾细胞培养上清液,常规ELISA法检测脾细胞培养上清液中白介素-12(IL-12)、白介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果A、B、C和D组小鼠的棘球蚴囊重分别为(28.0±36.0)、(41.0±33.0)、(72.0±36.0)和(78.0±57.0)mg,A组低于D组(P0.05),囊重减少率为64.1%。A组的IFN-γ、1L-12和TNF-α水平高于D组(P0.01),分别为(925.0±88.6)、(22.5±2.7)和(82.5±11.7)pg/ml,IL-10水平低于D组(P0.01),为(125.0±26.7)pg/ml;B组小鼠脾的IFN-γ和TNF-α水平高于D组(P0.01),分别为(750.0±100.0)和(80.0±13.1)pg/ml,IL-12和IL-10水平与D组相比差异无统计学意义(P0.05);C组小鼠脾细胞因子水平与D组相比,差异无统计学意义(P0.05)。当用EgAg、ConA或LPS刺激时,刺激组的细胞因子水平高于相应的未刺激组(P0.05或P0.01),ConA或LPS刺激组的细胞因子水平高于EgAg刺激组(P0.05或P0.01)。结论转细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液可诱导免疫鼠产生Th1型细胞免疫应答以对抗Eg原头节的攻击感染。     

新疆阿尔泰山和西部天山牛源细粒棘球蚴原头节感染不同品系小鼠后发育情况的比较

用新疆西部天山区域和阿尔泰山区域牛源细粒棘球蚴（Echinococcus granulosusE.g)原头节实验感染不同品系小鼠后的不同时期剖检,比较观察细粒棘球蚴在其体内的发育情况。结果为四种小鼠的继发性细粒棘球蚴囊在雌性鼠中的发育较雄性间的为快,在四种小鼠中,西部天山牛源E.g比阿尔泰山牛源E.g的发育较好,生长亦较快,感染后10个月,西部天山牛源E.g在鼠体内出现了发育成熟的原头节,而阿尔泰山牛源E.g到第12个月时仅有一只鼠出现发育成熟的原头节,表明西部天山牛源E.g与阿尔泰山牛源E.g在四种小鼠中的发育情况存在着明显的差别。     

细粒棘球蚴亲肌肉抗原在小鼠中的免疫保护力研究

目的 对细粒棘球蚴亲肌肉抗原(myophilin antigen)进行原核表达、纯化并用小鼠实验评价其免疫学特性. 方法 提取总RNA,构建克隆质粒Eg myophilin/pGEM-T,然后将亲肌肉抗原基因亚克隆于表达载体pET28a,进行诱导表达;纯化重组蛋白并免疫小鼠.利用Western blot、ELISA鉴定其免疫学特性,并通过包囊计数,评价其免疫保护力. 结果 成功构建原核重组表达载体Eg myophilin/pET28a,并表达、纯化出浓度较高的亲肌肉抗原.ELISA检测显示,用纯化的亲肌肉抗原免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体;Western blot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴.攻击感染实验表明亲肌肉抗原免疫小鼠的包囊数为0.93±2.1,对照组为7.13±10.21,两者差异有统计学意义,获得的保护力约为94.4%. 结论 成功表达细粒棘球蚴亲肌肉抗原,纯化后的重组蛋白具有抗原性和免疫原性,有望作为棘球蚴病疫苗候选分子.     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31蛋白对感染小鼠脾细胞凋亡的抑制作用

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组蛋白Bb-Eg95-EgA31免疫小鼠被Eg原头节攻击感染后小鼠体内生成的棘球蚴囊重减少率及脾细胞凋亡的变化。方法56只雌性BALB/c小鼠随机均分7组,分别为重组蛋白皮下注射组(A组)、肌肉注射组(B组)、鼻腔内接种组(C组)、灌胃组(D组)、空载体对照组(E组)、双歧杆菌对照组(F组)和双歧杆菌液体培养基(MRS)对照组(G组)。A、B和D组分别以5×106、5×106和5×108蛋白克隆形成单位(CFU)悬浮于100μlMRS免疫小鼠,C组以5×105蛋白克隆形成单位(CFU)悬浮于10μlMRS免疫小鼠,E和F组分别以空载体[Bb(pGEX-1λT)]和Bb5×106CFU悬浮于100μlMRS皮下注射小鼠,G组以100μlMRS皮下注射小鼠。8周后各组均用Eg原头节(50个/只)攻击感染,25周后剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重减少率;取脾,分离脾细胞,伴刀豆球蛋白(ConA)刺激培养,流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率。结果A、B、C和D组小鼠的棘球蚴囊重分别为(41.0±23.0)mg、(44.0±22.0)mg、(22.0±21.0)mg和(28.0±16.0)mg,均低于G组(75.0±33.0)mg(P0.05,P0.01),A、B、C组与D组间囊重差异无统计学意义(P0.05);E组(63.0±30.0)mg、F组(69.0±22.0)mg和G组间囊重差异无统计学意义(P0.05)。未加ConA培养的脾细胞凋亡发生率,A(0.14±0.01)、B(0.14±0.01)、C(0.13±0.01)和D组(0.14±0.01)均低于G组(0.21±0.01)(P0.05);C组低于A、B和D组(P0.05);E组(0.20±0.01)、F组(0.20±0.01)和G组间差异无统计学意义(P0.05);加ConA培养后的脾细胞凋亡发生率,A(0.19±0.01)、B(0.20±0.00)、C(0.17±0.01)和D组(0.19±0.01)均显著低于G组(0.26±0.01)(P0.01),C组低于A和B组(P0.01),C组低于D组(P0.05),D组低于B组(P0.05),A组与B组、D组间差异无统计学意义(P0.05),E组(0.25±0.01)、F组(0.25±0.01)和G组间差异无统计学意义(P0.05)。各组小鼠加ConA培养的脾细胞凋亡率显著高于相应的未加ConA培养组(P0.01)。结论Eg原头节感染可引起小鼠脾细胞凋亡,用Eg重组蛋白Bb-Eg95-EgA31免疫小鼠在一定程度上可抑制感染鼠脾细胞的凋亡,诱导小鼠产生一定的保护力。