绝经后骨质疏松症差异表达lncRNAs及其靶基因抑瘤素M在外周血的表达研究

目的探讨绝经后骨质疏松症差异表达lncRNAs及其靶基因抑瘤素M(oncostatin M,OSM)在绝经后骨质疏松症外周血的表达及其意义。方法在前期lncRNA-mRNA芯片检测绝经后骨质疏松症差异lncRNAs并进行共表达分析的基础上,利用blat软件分析lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1靶基因;RNAfold预测其二级结构;随机选择绝经后妇女受试者,检测骨密度,正常骨密度妇女25例为对照组,骨质疏松症患者25例为骨质疏松症组;定量PCR检测两组人群外周血lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及抑瘤素M的表达。结果blat软件预测lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1的靶基因为OSM,相关系数分别为0.8506(P=0.0037)、0.9314(P=0.0003)及0.9222(P=0.0004);RNAfold预测3个lncRNAs均具有多个茎环、多分枝内部环结构;lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及其靶基因抑瘤素M在骨质疏松症组中表达水平均显著低于对照组(P值均小于0.05)。结论lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及其靶基因抑瘤素M表达下调可能与绝经后骨质疏松症存在相关性。     

绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1 mRNA的表达研究

目的研究绝经后骨质疏松症肾阴虚证差异表达基因CLCF1、ASB1和PROK2的mRNA表达水平。方法随机选择绝经后骨质疏松症患者,中医辨证肾阴虚证组30例,27例健康绝经后妇女为对照组,RT-PCR法检测外周血CLCF1、ASB1和PROK2 mRNA的表达。结果肾阴虚组CLCF1 mRNA表达水平明显低于对照组(Z=-2.621,P=0.009);肾阴虚组ASB1mRNA表达与对照组比较,有降低趋势,但差异无统计学意义;与健康对照组比较,肾阴虚组PROK mRNA表达差异无统计学意义。结论骨质疏松症肾阴虚证与CLCF1 mRNA表达下调关联。     

绝经后骨质疏松症肾阴虚证差异表达基因CLCF1 蛋白表达研究

目的 研究绝经后骨质疏松症肾阴虚证与CLCF1、ASBl和PROK2基因蛋白表达的相关性。方法 病例对照方法,中医辨证肾阴虚证组29例,28例健康绝经后妇女为对照组,Western blot法检测外周血CLCF1、ASB1和PROK2蛋白表达水平。 结果 骨质疏松症肾阴虚组CLCF1蛋白表达水平（0.483±0. 151 )明显低于对照组（0.706± 0.255),P = 0.0001,统计学有非常显著性差异;肾阴虚组ASB1和PROK2蛋白表达与健康对照组比较,差异均无统计学意义（P>0.05>。结论 骨质疏松症肾阴虚证CLCF1蛋白表达水平显著低于健康对照组,骨质疏松症肾阴虚证与CLCF1蛋白下调存在关联。     

六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证差异表达基因的影响

目的 探讨六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证(POP)差异表达基因的影响。方法 用基因芯片技术比较POP肾阴虚证组与POP肾阳虚证组、POP无肾虚证组、健康对照组受试者外周血基因表达谱,筛选出差异表达基因;六味地黄丸治疗 POP肾阴虚证组3个月后,用基因芯片检测六味地黄丸对这些差异表达基因的影响。结果 ①基因芯片筛选POP肾阴虚证组与其他3组比较均有显著性差异的差异表达基因：ASB1、CLCF1、PROK2、GPR27、C3orf35、GSTM5、MUC12,其中ASB1、CLCF1、 PROK2、GPR27和C3orf35表达下调,GSTM5和MUC12表达上调。②六味地黄丸治疗POP肾阴虚证组3个月后,基因芯片检测 ASB1、CLCF1的表达显著上调,CLCF1参与JAK-STAT信号通路中JAK1、CBP显著下调、STAT4显著上调,而PROK2、GPR27、 C3orf35和GSTM5表达水平治疗前后比较无显著性差异。③六味地黄丸治疗POP肾阴虚证组3个月后,与治疗前相比,共有5701个差异表达基因,其中上调基因3072个,下调基因2629个。结论 六味地黄丸上调POP肾阴虚证差异基因ASB1、CLCF1 的表达,其治疗POP肾阴虚证的机理可能与其上调CLCF1介导JAK-STAT信号通路调控下游CBP表达有关。     

hsa-miR-655靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的实验研究

目的研究靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的microRNAs。方法通过生物信息学预测可能与CLCF1基因3'非编码区(3'Non encoding area,3'UTR)作用的miRNAs;将人工合成的野生型和突变型CLCF1基因3'UTR区序列克隆至荧光素酶报告质粒;将重组荧光素酶报告载体和miRNAs表达载体共转染293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,验证miRNA对CLCF1基因翻译水平的抑制作用。结果生物信息学预测结果显示,CLCF1基因3'UTR与hsa-miR-655、hsa-miR-300、hsa-miR-381、hsa-miR-374c、hsa-miR-515等5个miRNAs存在互补结合位点;双荧光素酶实验结果表明,与对照组比较,hsa-miR-655组荧光活性下调至33.09%,差异有显著性意义(P=0.001),当使用突变型CLCF1基因3'UTR,荧光活性上调至67.22%,说明hsa-miR-655对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有显著抑制作用;与对照组比较,hsa-miR-374c和hsa-miR-515组荧光活性分别下调27.27%(P=0.000)和27.74%(P=0.006),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有一定抑制作用;hsa-miR-300和hsa-miR-381组与对照组相比,荧光活性分别下调6.35%(P=0.213)和9.89%(P=0.127),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达无明显抑制作用。结论 hsa-miR-655通过靶向结合CLCF1 mRNA的3'UTR区,在转录后水平负性调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的表达。     

lncRNA在绝经后骨质疏松症肾阴虚证中的表达特征 及调控网络分析

目的探讨绝经后骨质疏松症肾阴虚证中lncRNAs的表达特征及基因调控网络。方法随机选择绝经后骨质疏松症 受试者,分为肾阴虚证组3例和肾阳虚证组3例,并选择健康绝经后妇女3例为正常对照组,采用基因芯片技术检测外周血单 个核细胞lncRNAs的表达水平。肾阴虚证组分别与其他2组比较,筛选共同差异表达lncRNAs,并构建lncRNA调控网络;实 时荧光定量PCR检测LINC00334、LINC00189和LOC101929378的表达,验证基因芯片结果。结果肾阴虚证组与正常对照组 和肾阳虚证组比较,筛选出 8 个共同差异表达 lncRNAs： LINC00334、LINC00189、L0C101929378、XLOC _013921、 ENSG00000237489. 2、ENSG00000225278. 2、AK125437 和 RNA95672;这些差异 lncRNAs 参与 Jak/STAT、MAPK、胰岛素通路和 钙离子代谢等12条信号转导通路的调控;实时荧光定量PCR证实,与正常对照组比较,LINC00189在绝经后骨质疏松症肾阴 虚证表达下调（FC =4. 71,P =0. 007) ;LINC00334(FC =6. 83,P =0. 005)和L0C1019293"78绝经后骨质疏松症肾阴虚证表达上 调（FC = 4.51,P = 0.035 ),变化趋势与芯片结果相一致。结论 LINC00334、LINC00189、L0C101929378、XL0C_013921、 AK125437、ENSG00000237489. 2、ENSG00000225278. 2 和 RNA95672 等 8 条 lncRNAs 可能通过调控 Jak/STAT、MAPK、胰岛素通 路和钙离子代谢等信号通路参与绝经后骨质疏松症肾阴虚证的发生发展过程。     

miRNA在绝经后骨质疏松症肾阴虚证中的表达谱特征及生物信息学分析

目的探讨绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)肾阴虚证miRNA的表达谱特征,及对差异表达的miRNA进行生物信息学分析。方法随机选择绝经后骨质疏松症受试者,中医辨证,分为3组:PMOP肾阴虚组3例,PMOP肾阳虚组3例,健康绝经后妇女3例作为对照组。采用人miRNA芯片检测外周血单个核细胞miRNA的表达水平。肾阴虚证组分别与其他两组比较,筛选共同的差异表达基因,实时荧光定量PCR验证芯片结果,并对差异表达的miRNA进行pathway分析及靶基因预测。结果肾阴虚证组与对照组、肾阳虚证组两组比较,筛选出20条共同差异表达miRNA;实时定量PCR验证hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p表达的结果与芯片结果相符;pathway分析结果显示,这些差异miRNA主要参与代谢通路、癌症通路、Rap1信号通路、粘着斑信号通路、PI3K-Akt、MAPK信号通路、钙离子信号通路、内质网蛋白加工、c GMP-PKG信号通路、Ras信号通路、Wnt信号通路的调控;结合多个数据库对差异表达的miRNA进行靶基因预测,最终筛选出9个靶基因(RC3H1、SOX11、FUT4、GABRA4、NUFIP2、ONECUT2、PHF20、PURB、ZNF148)。结论建立了PMOP肾阴虚证的miRNA基因表达谱,且这20个差异表达的miRNA可能通过调控PI3K-Akt、MAPK、Wnt等与骨代谢相关信号通路参与PMOP肾阴虚证的发生发展过程。     

长链非编码RNA GAS5在绝经后骨质疏松症肾阴虚证的表达及对骨免疫细胞因子的调控作用

目的 研究长链非编码RNA GAS5 (long non-coding RNA GAS5,lncRNA GAS5)在绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis,PMOP）肾阴虚证的表达及其对骨免疫相关细胞因子的调控作用。方法 随机选择绝经后妇女,经骨密度检测和中医辨证分型,分为肾阴虚证组（38例）、肾阳虚证组（32例）和健康对照组（35名）。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测外周血单核细胞中lncRNA GAS5的表达。通过慢病毒介导的RNA干扰技术,抑制THP-1人单核细胞中lncRNA GAS5基因的表达,并应用细胞因子抗体芯片技术检测骨免疫相关细胞因子的表达变化。结果 与对照组比较,lncRNA GAS5在PMOP肾阴虚证组和肾阳虚证组的表达水平均明显降低（P<0.01）;与肾阳虚证组比较,肾阴虚证组lncRNA GAS5的降低趋势更明显（P<0.05）;RNA干扰抑制lncRNA GAS5表达后,与对照组比较,干扰组lncRNA GAS5的表达下调67.58%,而白细胞介素(IL-6、IL-7、IL-17)、转化生长因子β(TGF-β1)、集落刺激因子（G-CSF 、M-CSF）等23种骨代谢相关细胞因子的表达水平显著上调,重组人巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1b）、白细胞介素1 b （IL-1 b）、胞间黏附分子-1（ICAM-1）等3种因子的表达下调。结论 lncRNA GAS5在PMOP肾阴虚证中低表达;体外抑制lncRNA GAS5的表达可影响骨免疫相关细胞因子水平。     

绝经后骨质疏松症肾阴虚证的免疫蛋白相关研究

目的探讨绝经后骨质疏松症肾阴虚证与LRG1、SRC蛋白表达变化的关联性。方法随机选择绝经后骨质疏松症患者,中医辨证肾阴虚证组25例,30例健康绝经后妇女为对照组,Western-blot法检测外周血LRG1、SRC的蛋白表达。结果肾阴虚证组LRG1蛋白表达水平(1.2391±1.5860)高于对照组(0.8033±0.7485),有升高趋势,差异无统计学意义(Z=-0.085,P=0.933),肾阴虚证组SRC蛋白表达水平(0.7873±0.6275)与对照组(0.3712±0.4064)比较,差异有统计学意义(Z=-2.874,P=0.004)。结论骨质疏松症肾阴虚证与SRC蛋白表达升高相关联。     

绝经后骨质疏松症肾阳虚证差异表达基因分析

目的通过基因表达谱的差比性分析,探讨绝经后骨质疏松症肾阳虚证相关基因的信息学特征。方法随机选择绝经后骨质疏松症受试者,分为肾阳虚证组3例,肾阴虚证组4例、非肾虚证组3例,并选择健康绝经后妇女3例设为正常对照组。用人全基因组表达谱芯片检测4组基因表达谱,肾阳虚证组分别与其他3组比较,筛选共同的差异表达基因,并对这些差异表达基因进行相关功能分析。结果肾阳虚证组与正常对照组、肾阴虚证组、非肾虚证组的差异表达基因分别为348,355,76条;肾阳虚证组与其他3组比较共同的差异表达基因有46条:与正常对照组相比,表达上调基因有4条,表达下调基因有42条。结论绝经后骨质疏松症肾阳虚证主要与免疫、细胞信号转导、钙离子活性和神经内分泌等方面相关。     

原发性骨质疏松症的中医证素辨证法

目的原发性骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症(Ⅰ型)、老年骨质疏松症(Ⅱ型)以及特发性骨质疏松症,以Ⅰ、Ⅱ型为高发。探讨Ⅰ、Ⅱ型骨质疏松症与证素辨证法的相关性,推动中医辨证法的返本与开新。方法按照中西医结合诊断标准,将随机选取的100例Ⅰ、Ⅱ型骨质疏松症患者进行证素辨证法的临床观察,探索病位、病性证素与Ⅰ、Ⅱ型骨质疏松症,以及患者疼痛程度与证素之间的相关性。结果Ⅰ型骨质疏松症患者的病位在肾者人数最多,占Ⅰ型中总人数的59%;其次是脾,占50%;再次是肝,占41%。Ⅱ型骨质疏松症中病位在肾者最多,占Ⅱ型总人数的75%;其次是肝,占46%;再次是脾,占32%。Ⅰ型骨质疏松症中的病性证素例数分级:阴虚阳虚寒或痰或湿血瘀气滞。Ⅱ型骨质疏松症中的病性证素例数分级:阳虚气滞阴虚血瘀寒或痰或湿。疼痛程度是在肝、血瘀上痛势最重,在脾、阴虚中痛势较缓。在阳虚、寒痰湿中痛势尚可。结论根据证素辨证排列组合,Ⅰ型骨质疏松症以肾阴虚、脾肾阳虚更常见。Ⅱ型骨质疏松症患者以肾阴阳两虚、肝气郁滞等为多发。骨质疏松症疼痛程度在肝、血瘀上痛势最重,在脾、阴虚中痛势较缓。说明了Ⅰ、Ⅱ型骨质疏松症与证素辨证法有很强的相关性,将二者结合为疾病诊疗提供新的思路方法,为部分揭示证素辨证法的科学内涵提供理论基础。     

绝经后骨质疏松症中医证型与握力的研究

目的探讨绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)患者中医证型与握力的关系。方法选取2017年11月至2018年10月在济南各社区及山东中医药大学附属医院骨质疏松门诊纳入的绝经后骨质疏松症女性142例(骨质疏松组)、绝经后非骨质疏松症女性39例(非骨质疏松组)。依照中医辨证分型将骨质疏松组患者分为肝肾阴虚、脾肾阳虚及肾虚血瘀三型,采集所有受试者一般指标,研究握力在绝经后骨质疏松症中医证型上是否存在差异。结果骨质疏松组年龄、绝经年限高于非骨质疏松组,差异有统计学意义(P<0.05),骨质疏松组身高、体重、体质量指数(body mass index,BMI)、握力和骨密度(bone mineral density,BMD)水平均低于非骨质疏松组,差异有统计学意义(P<0.05)。三组中医证型的年龄、绝经年限、身高、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05),肝肾阴虚组体重大于脾肾阳虚组,差异有统计学意义(P<0.05)。三组中医证型的握力由大到小依次为肝肾阴虚组、肾虚血瘀组、脾肾阳虚组,三组之间两两比较均有统计学意义(P<0.05)。结论脾肾阳虚型骨质疏松症患者握力较低,脾肾对肌力的影响具有普遍性的意义。     

原发性骨质疏松症肾阴虚证骨组织基因表达谱研究

目的：通过检测原发性骨质疏松症患者骨组织基因表达谱的差异,探讨原发性骨质疏松症肾阴虚证相关基因的信息学特征。方法随机选择骨质疏松症患者,中医辨证分型为肾阴虚证组3例、肾阳虚证组3例、无肾虚证组3例,并选择正常骨密度人群3例设为正常对照组。用人全基因组表达谱芯片检测4组人群骨组织基因表达谱,筛选共同的差异表达基因,并对这些差异表达基因进行基因通路等相关功能分析。结果肾阴虚证组与正常对照组、肾阳虚证组、无肾虚证组的差异表达基因分别为2378、4026、4071条,肾阴虚证组与其他3组比较共同的差异表达基因有344条,这些差异基因参与免疫调节、矿物质吸收、激素合成、组氨酸代谢等11条信号通路。结论原发性骨质疏松症肾阴虚证的相关基因主要与免疫调节、激素合成、组氨酸代谢、矿物质吸收等信号通路相关。     

Hedgehog信号通路与“肾虚血瘀”骨代谢失常的实验研究

目的观察去卵巢骨质疏松症模型大鼠的骨组织和肾组织中Hedgehog信号通路细胞表面受体Patched-1(PTCH1)和Gli3mRNA和蛋白含量变化及补肾填精、活血化瘀中药复方对其影响,探讨中药组方治疗绝经后骨质疏松症的可行性以及绝经后骨质疏松症的发病机制与Hedgehog信号通路的关系。方法采用切除雌性大鼠双侧卵巢的方法建立绝经后骨质疏松症模型,分别给予补肾填精中药复方、活血化瘀中药复方、骨疏康对模型大鼠灌胃12周。然后将大鼠分为补肾填精组、活血化瘀组、阳性对照组、正常组和模型空白组,其中骨疏康作为阳性药物为阳性对照组。运用RT-PCR检测各组大鼠骨组织和肾组织PTCH1和Gli3mRNA相对表达量;通过ELISA法检测各组大鼠骨组织和肾组织PTCH1和Gli3蛋白含量。结果各组大鼠股骨和肾组织中PTCH1mRNA及蛋白表达方面:与正常组比较,模型组显著升高(P0.01);与模型组比较,补肾填精组、活血化瘀组、阳性对照组显著降低(P0.01);各个用药组间比较,补肾填精组下调优于活血化瘀组,具有显著性差异(P0.01)。各组大鼠股骨和肾组织中Gli3mRNA及蛋白表达方面:与正常组比较,模型组显著升高(P0.01);与模型组比较,补肾填精组、活血化瘀组、阳性对照组显著下降(P0.01);各个用药组间比较,补肾填精组下调优于活血化瘀组,具有显著性差异(P0.01)。结论 PTCH1mRNA及蛋白含量和Gli3mRNA及蛋白含量在去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨组织和肾组织中显著升高,提示PTCH1和Gli3可能参与绝经后骨质疏松症骨代谢失衡的发生和进展。补肾填精中药复方和活血化瘀中药复方可下调PTCH1和Gli3mRNA相对表达量及其蛋白含量,这可能是起到防治绝经后骨质疏松症的作用机制之一,并且补肾填精法优于活血化瘀法。     

广东省中老年女性骨质疏松症患者骨密度、中医证型及其影响因素调查分析

目的对广东省中老年女性骨质疏松症患者骨密度、中医证型及其影响因素做横断面研究并探讨分析其关系。方法对广东省内各地(广州市、中山市、佛山市、惠州市、台山市等)医院1 453名骨质疏松症患者进行问卷调查,对所收集的资料采用SPSS统计软件进行统计分析,分析骨密度、中医证型及其影响因素(年龄、绝经年龄/年限,既往骨折史,髋部骨密度,治疗时间等)。结果最终筛选出符合标准的样本共373例,年龄介于48～95岁之间,平均年龄73.56±9.32岁,其中脾肾阳虚证130例,占34.85%,肝肾阴虚证161例,占43.16%,气滞血瘀证75例,占20.11%,其他证型7例,占1.88%。各年龄段、不同绝经年龄组间、不同绝经年限组间的患者骨密度比较差异有统计学意义(P0.05),是否有既往骨折史和父母是否发生过髋骨骨折的骨密度比较有明显差异(P0.05),脾肾阳虚证的患者髋部骨密度明显高于肝肾阴虚证(P0.05),治疗时间大于6个月的患者活动度改善情况和一般情况优于治疗时间少于6个月的(P0.05),脾肾阳虚证、肝肾阴虚证的患者接受治疗半年以上的治疗效果明显优于不超过半年的,结果具有统计学意义(P0.05)。结论广东省中老年女性骨质疏松症各年龄段的骨密度有一定的差异性,绝经年龄、绝经年限、既往骨折史、父母髋骨骨折史与骨密度有一定相关性,不同中医证型的患者接受治疗的时间不同其效果亦有差别。     

基于肾之“精气”“阴阳”理论探析绝经后骨质疏松症的病机变化

中医学防治绝经后骨质疏松症具有完善的理论体系、确切的临床疗效,中医药的现代研究又为其防治绝经后骨质疏松症提供了客观依据。基于古代文献和中医临床立法用药规律,结合现代医学对绝经后骨质疏松症发病机制的研究,围绕肾之“精气”“阴阳”理论阐释绝经后骨质疏松症的病机变化为以肾精亏虚为先导,继而肾之阴阳平衡失调,导致骨髓失养、代谢紊乱、骨枯形伤,出现疼痛、骨量减少、骨强度下降、骨脆性增加、易于骨折等临床表现。