抗人载脂蛋白6 单链抗体的筛选、制备及活性鉴定

目的:筛选特异性抗人载脂蛋白6单链抗体(anti-hLCN6 scFv),并进行表达纯化和活性鉴定。方法:采用RT-PCR技术,用抗体可变区简并引物,从hLCN6免疫小鼠的淋巴细胞中扩增全套V_H和V_L基因,装配成scFv基因后将其克隆到噬菌体载体pFAB5C中,构建scFv噬菌体抗体库。对抗体库进行4轮富集,筛选抗hLCN6阳性scFv。经原核表达纯化后,用Western blot和间接ELISA对其活性进行鉴定。结果:筛选到2株亲和力较高的阳性克隆,测序表明其序列一致。获得了高纯度的scFv抗体,其对抗原具有良好的亲和力和特异性。结论:成功筛选到特异性抗hLCN6 scFv,为利用该抗体进行混合斑中的精子分离奠定了基础。     

抗CD147人源单链抗体的筛选及生物特性初步鉴定

目的利用噬菌体展示技术筛选特异性抗CD147人源单链抗体(human anti-CD147 sc Fvs)并进行生物特性鉴定。方法以真核表达的CD147蛋白为抗原,采用"酸洗脱法"对库进行4轮富集性筛选、以ELISA法对筛选克隆的结合活性进行测定,以竞争ELISA和Western blot实验对获得的噬菌体抗体和可溶性sc Fv的特异性进行鉴定,通过DNA测序核实特异性sc Fvs的人源性及其亚群,以硫氰酸盐洗脱法对获得的抗体进行相对亲和力分析。结果经过4轮的富集性筛选,共筛出4个与CD147特异性结合的阳性克隆,其中3个获得可溶性表达,竞争抑制及Western blot实验证实其能与CD147特异性结合。DNA序列分析证实3个阳性克隆具有不同的基因型,三者的轻链可变区分别属于V_λⅠ、V_κⅡ、V_λⅢ亚群,重链可变区分别属于V_HⅠ、V_HⅢ、V_HⅢ亚群。硫氰酸盐洗脱法测出13号、15号和168号3个human anti-CD147 sc Fvs的亲和力分别为0.20 mol/L、0.35 mol/L和0.6 mol/L。结论成功从大容量噬菌体抗体库中筛选到特异性human anti-CD147 sc Fvs,为进一步研究该抗体的功能及应用前景奠定了基础。     

从人源天然ScFv噬菌体抗体库中筛选A型肉毒毒素特异性抗体

目的:以不同形式的A型肉毒毒素或类毒素为靶抗原,对已经构建的人源天然ScFv噬菌体抗体库进行特异性抗体的筛选及特异性抗体的序列分析。方法:制备3种不同形式的A型肉毒毒素或类毒素,抗原梯度包被免疫管,对人源天然ScFv噬菌体抗体库进行筛选,经过3轮"吸附-洗脱-扩增"淘选富集,制备单克隆噬菌体抗体颗粒,用ELISA验证ScFv的结合活性,并对获得的阳性克隆进行基因序列分析。结果:用3种不同形式的抗原进行筛选,各挑180个克隆进行单克隆噬菌体抗体颗粒的ELISA分析,其中以A型肉毒类毒素筛选获得52个阳性克隆,阳性率为28.8%,随机挑取12个克隆测序,结果表明7个ScFv序列正确且各不相同;以纯化后A型肉毒神经毒素(BONT/A)筛选获得18个阳性克隆,阳性率为10%,测序结果表明获得的14个ScFv序列正确且各不不同;以原核表达的A型肉毒毒素重链C段筛选获得122个阳性克隆,阳性率为68%,随机挑取55个克隆测序,结果表明30个正确的ScFv序列中14个系列完全相同,16个序列各不相同;结论:应用固相筛选的方法,从人源天然ScFv噬菌体抗体库可以获得肉毒毒素特异性抗体,为抗肉毒毒素马血清的更新替换提供了研究依据与应用基础。     

人源性抗乳腺癌单链抗体库的筛选与初步鉴定

目的:本研究旨在已构建的大容量人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的基础上,筛选出高亲和力的特异性单链抗体(scFv)并对抗体基本特性进行初步鉴定。方法:以人乳腺癌细胞系MCF-7为靶标,经过4轮淘洗,筛选出高亲和力的特异性抗乳腺癌scFv,并对其结构序列进行分析;通过ELISA和Western blot方法,鉴定scFv的亲和力和特异性,以及其蛋白的基本表达情况。结果:成功构建具有高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库,获得scFv的长度约为750 bp,ELISA证实所得抗体对乳腺癌细胞具有良好的亲和力和高度的特异性,IPTG诱导表达及Western blot结果显示,scFv为相对分子质量(Mr)30 000的可溶性蛋白。结论:本研究在已构建的大容量抗乳腺癌单链抗体库的基础上,筛选获得了高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库。研究结果为进一步获得可应用于临床诊断和治疗的乳腺癌靶向性抗体奠定了良好的基础。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

胰淀素Fab抗体的筛选及初步鉴定

目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性.方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,提取其质粒、切除gⅢ、自身环化并转入大肠杆菌中,以IPTG诱导表达可溶性抗体,最后用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定抗原结合活性和特异性.结果:成功筛选并表达了抗胰淀素的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE蛋白电泳,在相对分子质量约为47 kD处可见一蛋白条带.ELISA和Western blot证实了该Fab片段与胰淀素抗原的结合活性和特异性.结论:利用噬菌体抗体库技术获得了人源性的特异抗胰淀素Fab抗体,为临床进行下一步研究奠定了基础.     

Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选与初步鉴定

目的:构建针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系噬菌体抗体库,从中筛选特异性抗体,并对所筛选出的阳性克隆进行鉴定.方法:以Daudi细胞免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗血清滴度后,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞,提取RNA.利用RT-PCR扩增抗体к轻链和重链Fd片段,经Sac Ⅰ/Xba Ⅰ和Xho Ⅰ/Spe Ⅰ双酶切,依次克降入噬菌体载体pComb3H-SS的相应酶切位点,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库.以Daudi细胞为抗原对抗体库进行6轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过ELISA法对随机挑选的克降进行抗原结合活性测定,获得的阳性克隆进一步做DNA序列测定、在大肠杆菌XL1-Blue中进行可溶性表达,并用Western blot对表达产物的特异性作了鉴定.结果:构建了容量为3.13 × 107的抗人B细胞淋巴瘤Daudi细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Daudi细胞系特异性识别结合的4株阳性克隆.氨基酸序列分析结果显示:阳性克隆的重链、轻链可变区序列分别与基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链、轻链可变区序列有80%～94%和88%～95%同源性.阳性克隆成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达,Western blot结果表明所获得的可溶性表达产物可与Daudi细胞膜抗原特异性结合.结论:成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Daudi细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础.     

大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选

目的构建大容量人源Fab噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,插入噬菌体载体pCANTAB5H中,构建人源Fab噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,随机挑取96个单克隆进行phage-ELISA鉴定,筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为5×1010的噬菌体抗体库,从中筛选到11株阳性克隆,对其进行测序鉴定,表明该11株克隆的序列均一致,ELISA证实其对抗原CD276具有较强的结合性。结论构建了大容量人源Fab抗体库,从中获得具有抗CD276的人源Fab抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。     

抗阿尔茨海默病Aβ人源单链抗体基因的筛选和表达

目的 从人源噬菌体单链抗体库中筛选与阿尔茨海默病发病中起关键作用的β淀粉样多肽(Aβ)1-42特异性结合的单链可变区抗体(scFv)基因,利用原核生物大肠杆菌进行可溶性表达,以获得抗AB1-42人源抗体.方法 利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮富集,以Aβ1-42为抗原经酶联免疫吸附(ELISA)检测,筛选与Aβ1-42特异性结合的阳性噬菌体克隆,再用阳性噬菌体感染E.coli HB2151进行可溶性表达,经SDS-PAGE、Western blot及ELISA法检测scFv单抗的可溶性表达水平及抗原结合活性.并对阳性scFv抗体基因进行基因测序鉴定.结果 获得了7个特异性的抗Aβ1-42 scFv阳性噬菌体克隆,其中4个克隆ELISA检测吸光度值(A值)高于阴性对照5倍以上;其中1株(A 10)获得可溶性单链抗体的成功表达,表达产物主要位于菌体中,ELISA效价显示在全菌蛋白中A值高于对照5倍以上.其相对分子质量约为33 000.DNA测序表明所获抗体的可变区基因属于scFv抗体基因,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构.结论 用人源噬菌体单链抗体库筛选出抗Aβ1-42的人源抗体单链可变区基因,并成功表达了具有抗原结合活性的可溶性单链抗体,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制和治疗奠定了基础.     

用噬菌体多肽库筛选日本血吸虫表膜抗原的模拟表位

为探索可用于诊断的模拟表膜抗原。采用纯化的兔抗表膜抗原IgG作探针 ,免疫筛选噬菌体随机十二肽库 ,经 3轮生物淘洗后 ,随机挑选 30个噬菌体克隆 ,用ELISA检测其与筛选抗体的特异性结合 ,选择两个阳性克隆进行DNA序列测定 ,并用斑点ELISA比较检测正常人和日本血吸虫病患者血清各 10份。结果显示 ,随机挑选的 30个克隆中有 9个噬菌体克隆与筛选的抗体有特异性的结合反应。DNA测序结果显示 ,两个阳性噬菌体克隆 (携带的抗原表位 )所演绎的氨基酸序列与GenBank已知的氨基酸序列无同源性。斑点ELISA结果显示两个抗原表位可被血吸虫病患者血清呈特异性识别     

抗人转化生长因子β1纳米抗体的制备及功能鉴定

目的制备并鉴定羊驼来源的高特异性、高亲和力的抗人转化生长因子β1(TGF-β1)的纳米抗体。方法构建真核表达质粒并瞬时转染人胚胎肾上皮细胞HEK-293T,获得重组TGF-β1蛋白;用该蛋白混合弗氏佐剂免疫羊驼,分离外周血单核细胞,提取RNA进行巢式PCR,扩增抗体重链可变区(VHH),并构建VHH噬菌体展示文库;利用ELISA筛选能与TGF-β1重组蛋白特异性结合的抗体株,原核表达并纯化抗TGF-β1的纳米抗体;利用免疫印迹、免疫荧光和ForteBio Octer等方法鉴定纳米抗体的特异性及亲和力。结果成功构建cFUGW-TGF-β1表达载体并纯化了3 mg TGF-β1蛋白;羊驼经过5次免疫后得到容量为1.2×108的TGF-β1-VHH噬菌体展示文库;通过4轮ELISA筛选,得到7株能与重组TGF-β1蛋白特异性结合的抗体株;免疫印迹及免疫荧光实验结果均显示原核表达纯化的TGF-β1纳米抗体B3和C8能特异性识别肺癌细胞系NCI-H520表达的天然TGF-β1;ForteBio Octer结果显示B3、C8与重组TGF-β1的亲和力分别达到1.48×10-9 mol/L、9×10-9 mol/L。结论TGF-β1纳米抗体B3和C8能特异性结合TGF-β1,特异性强、亲和力高,或可开发用于肿瘤的免疫治疗。     

Characterization and enzyme-conjugation of a specific anti-l1 nanobody

Persistent infection of the human papillomaviruses (HPV) has been shown to result in cervical cancer and intraepithelial neoplasia. Early detection and screening programs are essential strategies against cervical cancer. A nanobody is the smallest antigen-binding fragment known and is derived from a camelid heavy-chain antibody. This tiny protein shows high solubility and stability. It can be produced cost-effectively with high yield production. In this study, we enriched a nanobody library against the L1 protein of HPV. Several colons were selected from this enriched library using monoclonal phage-enzyme linked immunosorbent assay (phage-ELISA) and analyzed for identification of nanobody genes. The expression of nanobody fragments was performed in Rosetta gami2. The C74 nanobody that showed strong binding to the L1 protein of HPV16 was selected, purified, and characterized by Western blotting and ELISA. The selected nanobody was tested for sensitivity, specificity, and affinity. A nanobody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) was selected and used for detection of L1 protein of HPV16. This study demonstrates that the C74-HRP, due to its specificity and good binding affinity for a specific viral antigen, is a potential diagnostic tool that can be used as a promising reagent for the new generation of HPV diagnosis approaches.     

从人源全合成抗体库中筛选到抗人干扰素α1b单链抗体

目的研究开发人源抗huIFN—α的基因工程抗体,为系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）的治疗提供有效的抗体药物。方法本研究利用噬菌体表面展示技术,以纯化的人干扰素α1b（huIFN-α1b）和人干扰素α2b（huIFN—α2b）蛋白为抗原从人源全合成抗体库中筛选抗huIFN-α的基因工程单链（single chain variable fragment,scFv）抗体,通过phage—ELISA对噬菌体单链抗体的结合特异性和稳定性进行验证。将单链抗体基因克隆到原核分泌表达载体pET22b上在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,通过Western blot检测单链抗体的分泌表达,并通过ELISA对单链抗体的结合特异性进行验证。通过金属螯合亲和层析纯化单链抗体,并用Western Blot对单链抗体的结合特异性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,获得100株对huIFN—α1b有特异性结合的噬菌体单链抗体。对得到的86株克隆的测序分析表明,共有9株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体,有7株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL3家族,有2株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL1家族。获得了5株稳定且特异针对huIFN—α1b而与huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应的人源单抗。这5株抗体在BL21（DE3）中分泌表达,有3株单链抗体能特异性结合huIFN-α1b而与无关抗原无交叉反应。结论通过噬菌体表面展示技术,从人源全合成抗体库中筛选得到3株稳定且特异结合huIFN—α1b的人源治疗用基因工程单克隆抗体。     

骆驼重组SpaA-N单域抗体的制备与性质研究

目的:获得特异识别SpaA-N的单域抗体。方法:用His-SpaA-N重组抗原从新疆双峰驼单域抗体噬菌体展示文库中,筛选SpaA-N的结合子。经测序后亚克隆至pET30a并在E.coli BL21高表达,用镍离子亲和层析柱纯化。ELISA分析重组单域抗体的热稳定性,Western blot检测结合特异性。结果:经His-SpaA-N筛选富集后,筛选得到2个目的克隆。构建至pET30a,PCR和酶切鉴定目的基因大小与预计相符。SDS-PAGE显示,Mr 29 000和23 000有特异性目的条带。ELISA检测显示,抗SpaA-N的VHH对SpaA-N重组蛋白具有很好的结合活性;VHH热变性后,经室温复性均可以恢复其抗原结合活性。Western blot显示,重组VHH在Mr 66 000处可以识别丹毒丝菌中存在的表面蛋白。结论:获得了具有热稳定性和特异结合SpaA-N的单域抗体,为进一步研究spaA抗原在丹毒丝菌感染免疫中的作用提供了基础。     

抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

目的：制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体(mAb)，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法：以hBCMA—Ig融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合制备抗Fc段mAb，用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法;Western blot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联，制备亲和层析柱，对LAIR1-Ig融合蛋白进行纯化。结果：获得7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤(FMUFcl-FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb，FMUFc5作为酶标记mAb，成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法，敏感度达到2μg／L；在7株mAb中，FMUFc6可用于Ig融合蛋白的western blot检测。用FMUFc 6mAb制备的亲和层析柱，可有效地纯化LAIRl—Ig融合蛋白。结论：成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb，建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法，为Ig融合蛋白的应用提供了有力手段。     

人CD20跨膜区与g3pN端融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建g3pN1 hCD2 0跨膜及胞外区基因表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效融合表达。方法 :利用反转录PCR和PCR方法 ,分别从Daudi细胞和M13K0 7噬菌体中扩增hCD2 0基因和编码g3pN1蛋白N1端的基因 ,并重组到pTIG Trx表达载体中 ,在大肠杆菌中融合表达。结果 :表达产物可被抗CD2 0分子的单克隆抗体 (mAb)识别。结论 :成功地表达并鉴定了目的蛋白。     

Selection of single chain variable fragments (scFv) against the glycoprotein antigen of the rabies virus from a human synthetic scFv phage display library and their fusion with the Fc region of human IgG1

We have prepared human recombinant antibody molecules against the glycoprotein antigen of the rabies virus (GPRV) based on the single chain variable fragment (scFv) format. Anti-GPRV scFvs were selected from a human synthetic scFv phage display library with a repertoire of approximately 109 specificities. After three rounds of selection against the PV11 strain of the virus, 40% of the clones tested recognized the rabies antigen. Of the 20 positive clones that were sequenced, five distinct sequences were identified. These distinct scFvs were cloned into a mammalian expression vector carrying the human IgG1 Fc region. The specificity of the resulting scFv-Fc molecules for GPRV was established by ELISA, dot blot and western blot analyses and membrane immunofluorescence. Two of the scFv-Fc fusion proteins neutralized the PV11 strain in a standard in vivo neutralization assay where the virus was incubated with the scFv-Fc molecules before intracranial inoculation in mice. These anti-GPRV scFv-Fc molecules have the potential to be used as an alternative to the presently available HRIG, for use in post-exposure preventive treatment.     

Recombinant λ Bacteriophage Displaying Nanobody towards Third Domain of HER-2 Epitope Inhibits Proliferation of Breast Carcinoma SKBR-3 Cell Line

Phage display of many nanobodies via filamentous phage in combination with helper phage has been reported by many scientists. The aim of this study was to produce lambda (λ) bacteriophage displaying high-affinity nanobody against HER-2 expressing breast carcinoma cells. Bacteriophage λ is a temperate phage with inherent biological safety in mammalian cells. Here we report the construction of a recombinant λ phage that efficiently expresses specific nanobody towards third domain of HER-2 target on SKBR-3 and MCF-7 cell lines in vitro. We constructed recombinant λ phage particles containing a mammalian expression cassette, C-Myc tagged, encoding VHH gene of camelid anti HER-2 third domain epitope using λ ZAP-cytomegalic virus (CMV) vector. The SKBR-3, MCF-7 and human endometrial stem cells were treated by the nanobody displayed recombinant λ phage. The cell growth inhibition assay was performed by MTT Cell Viability Assay Kit. After the fourth round of biopanning there was a significant enrichment in the phage specifically binding to the antigen. The ratio of targeted phage increased approximately 1,000-fold in the fifth round. The nanobody expressed by λ ZAP-CMV-VHH phagemid cloned in λ bioparticles significantly inhibited the proliferation of HER-2 positive SKBR-3 and MCF-7 cells. Recombinant bacteriophage λ ZAP-CMV-VHH-cDNA could be used efficiently for construction of nanobodies to mortify HER-2 positive breast carcinoma cells as a nanomedical therapeutic.     

人源抗狂犬病毒基因工程单链抗体的研究

目的 研制人源抗狂犬病毒基因工程抗体.方法 从具有高滴度狂犬病毒抗体的疫苗接种者采集外周血淋巴细胞,通过pHAL14载体和高效噬菌体系统构建人源抗狂犬病毒单链基因工程抗体库,经纯化的狂犬病毒aG株富集筛选,通过ELISA和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定.利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能.结果 成功地获得了6株抗狂犬病毒糖蛋白的人源单克隆抗体,非竞争ELISA显示6株抗体具有较高的亲和力,体外中和试验证实这6株人源单抗对狂犬病毒CVS株无中和活性,对aG株具有较强的中和活性.结论 从免疫库中获得了6株人源单克隆抗体,为狂犬病毒的鉴别诊断和治疗奠定了基础.