人胃印戒细胞癌组织差异表达基因克隆的研究

目的：分离胃印戒细胞癌组织差异表达基因。探讨人胃印戒细胞癌发生的分子机制。方法：采用抑制性消减杂交技术(SSH)．构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库；随机挑选部分阳性克隆测序，与GenBank中的已知序列进行基因同源性分析，并进一步探讨基因功能。结果：成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，并分离出多个差异表达基因片段：其中1条与染色体序列相似，可能代表未知的新基因序列，已被GenBank接收(注册号：CN446913)；其他多为已知的肿瘤相关基因的部分片段。结论：1)SSH技术是分离差异表达基因的有效方法；2)胃印戒细胞癌的发生发展与多种基因表达异常有关。     

mRNA差异显示法筛选和克隆胃癌相关基因

目的 :筛选和克隆胃印戒细胞癌与正常胃黏膜细胞差异表达基因片段。方法 :采用mRNA差异显示法 (mRNAdifferentialdisplayPCR ,DD PCR) ,对比胃印戒细胞癌组织与正常胃黏膜组织mRNA的表达差异 ,克隆胃印戒细胞癌差异片段 ,经过RNA的斑点杂交、测序以及序列分析和同源性比较。结果 :胃印戒细胞癌与正常胃黏膜中存在明显的基因表达差异 ,发现与胃癌相关的差异表达条带 16条 ,其中 7条为缺失表达条带 ,9条为过度表达条带。对其中 4条差异表达条带进行克隆、测序 ,经序列分析及同源性比较和RNA的斑点杂交 ,表明确认其中 1条为GenBank/BLAST中尚未收录的片段。结论 :胃印戒细胞癌的mRNA差异显示证明 ,该EST序列可能在胃癌的发生发展中具有一定作用     

mRNA差异显示法筛选和克隆胃癌相关基因

目的：筛选和克隆胃印戒细胞癌与正常胃黏膜细胞差异表达基因片段。方法：采用mRNA差异显示法(mRNA differential dlsplay PCR，DD-PCR)，对比胃印戒细胞癌组织与正常胃黏膜组织mRNA的表达差异，克隆胃印戒细胞癌差异片段，经过RNA的斑点杂交、测序以及序列分析和同源性比较。结果：胃印戒细胞癌与正常胃黏膜中存在明显的基因表达差异，发现与胃癌相关的差异表达条带16条，其中7条为缺失表达条带，9条为过度表达条带。对其中4条差异表达条带进行克隆、测序，经序列分析及同源性比较和RNA的斑点杂交，表明确认其中1条为GenBank／BLAST中尚未收录的片段。结论：胃印戒细胞癌的mRNA差异显示证明，该EST序列可能在胃癌的发生发展中具有一定作用。     

高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库的建立

目的:以抑制性消减杂交技术分离高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞HcaF和HcaP间差异表达的基因。方法:采用抑制性消减杂交技术,以高低转移力小鼠肝癌细胞HcaF为检测子,以低转移力HcaP细胞为驱赶子,分离高转移力癌细胞中高表达的基因的cDNA片段。将差异表达基因的cDNA片段插入T/A克隆载体,并通过热转化的方法转化大肠埃希菌DH5α,建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库。以菌液PCR的方法检测随机挑选的白色菌落中插入片段的出现频率。提取14个重组质粒进行序列分析。结果:在消减文库中共获800个白色菌落,对随机挑选的160个白色菌落进行菌液PCR扩增,发现95%的白色菌落中含有100～700bp的插入片段。对重组质粒的序列分析和同源性比对发现,所获的14个序列中3个为已知基因,分别来自小鼠热休克蛋白、ribosomalproteinS13、ethanolinduced6基因;4个可能来源于新基因;3个与3个不同的EST同源。结论:成功构建了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库,为今后高通量筛选癌淋巴道转移相关基因,奠定了坚实的基础。     

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的 已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因.本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础.方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定.结果 成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段.其片段大小范围为(300-750)bp.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库.nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达.     

在肝母细胞瘤中筛选XTP6的反式调节基因及其意义

目的: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建XTP6反式激活相关基因差异表达的cDNA文库,筛选XTP6蛋白反式激活相关基因.方法: 构建XTP6真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6,并将其转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;48h后收获细胞后提取mRNA并逆转录成cDNA,tester cDNA经RsaI酶切消化后分成两组,分别与两种不同接头衔接,再与过量的driver cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应,第二次PCR产物与pGEM-Teasy克降载体连接,构建cDNA消减文库,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析.结果: 成功构建人XTP6蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库.扩增后得到70个200-1000bp插入片段的克隆,随机挑选其中20个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得11种已知功能编码基因.结论: 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞周期调节、生物代谢和炎症修复密切相关的蛋白编码基因.     

甲状腺癌组织差异表达cDNA消减文库的构建与鉴定

目的 :应用抑制性消减杂交技术 ,构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库。方法 :分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA ,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术 ,构建成功cDNA消减文库 ,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果 :构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库 ,文库扩增得到了 4 0 0个克隆 ,随机挑取 5 0个制备质粒 ,酶切分析均得到 5 0～ 4 0 0bp大小插入片段 ,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段 ,结论 :人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

K562细胞消减cDNA文库的构建及初步鉴定

背景与目的:消减杂交技术是一种寻找和克隆差异基因的方法。本研究目的是通过快速、高质量构建消减cDNA文库,筛选K562细胞中差异表达基因。方法:以用限制性显示(restriction display,RD)技术制备的K562细胞cDNA片段作为消减对象,以正常人淋巴细胞的Sau3AⅠ酶解cDNA片段对其进行消减。经过消减后的RD片段被分组扩增出来,并克隆于T载体中,挑选阳性克隆进行测序并进行初步分析。结果:构建的K562细胞消减cDNA文库,包含360个阳性克隆,插入片断大小范围在200～800bp之间,选取50个克隆进行测序分析,结果为来源于42个已知基因。结论:利用自行建立的消减杂交法,成功构建了特异性K562细胞消减cDNA文库,文库质量可靠,可用于进一步筛选及克隆K562细胞中差异表达基因。     

高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株差异表达基因的筛选

目的 筛选高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株差异性表达基因。方法 应用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株Hca-F及其同源低转移细胞系Hca-P的cDNA消减杂交文库,筛选阳性克隆进行测序,并在GenBank数据库中进行同源性比较。结果 成功克隆10个差异基因片段,其中2个为新基因。结论 SSH技术是克隆差异表达基因及发现新基因的有效方法。     

甲状腺癌组织差异表达cDNA消减文库的构建与鉴定

目的：应用抑制性消减杂交技术，构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库。方法：分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA，应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术，构建成功cDNA消减文库，再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果：构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库，文库扩增得到了400个克隆，随机挑取50个制备质粒，酶切分析均得到50～400bp大小插入片段，这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段，结论：人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆人肺鳞癌差异性表达基因

目的 克隆人肺鳞癌肿瘤差异性表达基因。方法 应用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH)构建人肺鳞癌cDNA消减杂交文库，筛选后挑选阳性克隆进行测序，并在Gen Bank数据库中进行同源性比较，最后经RT－PCR验证。结果 成功克隆10个差异基因片段，其中2个为新基因（GenBank登录号分别为：C20：AF363068；C34：AY032661）。结论 抑制性消减杂交技术是克隆差异表达基因及发现新基因的有效方法。     

肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因的克隆与鉴定

目的：克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因,方法：将肺腺癌多药耐药细胞（SPC－A－1／CDDP）作为实验方,肺腺癌细胞（SPC－A－1）作为对照方,应用抑制消减杂交技术,构建实验方特异表达cDNA消减文库;用斑点杂交法初步筛选cDNA消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析（Genbank),对新的cDNA序列进行Northern blot杂交验证。结果：建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC－A－1／CDDP）特异表达cDNA消减文库,斑点杂交法初步筛选显示23个个克隆中有SPC－A－1／CDDP特异表达cDNA片断,测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列,其余cDNA片段与已知基因有93％－100％的同源性,Northern blot杂交结果表明2个新的cDNA片断来自SPC－A－1／CDDP细胞。结论：2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列;抑制消减杂交法是克隆特异表达基因的有效方法。     

Identification of genes differentially expressed in association with acquired cisplatin resistance

The goal of this study was to identify genes whose mRNA levels are differentially expressed in human cells with acquired cisplatin (cDDP) resistance. Using the parental UMSCC10b head and neck carcinoma cell line and the 5.9-fold cDDP-resistant subline, UMSCC10b/Pt-S15, two suppressive subtraction hybridization (SSH) cDNA libraries were prepared. One library represented mRNAs whose levels were increased in the cDDP resistant variant (the UP library), the other one represented mRNAs whose levels were decreased in the resistant cells (the DOWN library). Arrays constructed with inserts recovered from these libraries were hybridized with SSH products to identify truly differentially expressed elements. A total of 51 cDNA fragments present in the UP library and 16 in the DOWN library met the criteria established for differential expression. The sequences of 87% of these cDNA fragments were identified in Genbank. Among the mRNAs in the UP library that were frequently isolated and that showed high levels of differential expression were cytochrome oxidase I, ribosomal protein 28S, elongation factor 1alpha, alpha-enolase, stathmin, and HSP70. The approach taken in this study permitted identification of many genes never before linked to the cDDP-resistant phenotype.     

与肺癌和胃癌转移可能相关的RAB5A基因

目的 研究和分离肿瘤转移相关基因,探讨肺癌及胃癌转移发生的分子基础。方法 应用细胞培养、ｍＲＮＡ差异显示技术、ｃＤＮＡ克隆、测序技术、ＲＴ－ＰＣＲ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交技术以及免疫组化技术,分析比较了细胞来源相同,但转移能力不同的人肺腺癌细胞系Ａｎｉｐ９７３和ＡＧＺＹ８３－ａ基因差异表达及其差异表达基因ＲＡＢ５Ａ在临床胃癌和肺癌标本中存在的实际意义。结果 在两细胞系之间确有明显的差异表达基因存     

应用抑制消减杂交技术筛选人肾癌差异表达新基因

背景与目的：认识肾癌差异表达基因有助于阐明肾癌发生,发展的分子机制。但至今有关肾癌差异基因尤其肾癌特异相关基因的研究仍不令人满意,本实验应用抑制消减杂交技术筛选入肾癌组织与正常肾组织间差异表达的新基因,以期克隆出新的肾癌特异相关基因。方法：以肾癌组织mRNA为检测对象（Tester)。正常肾组织mRNA为驱赶者（Driver)。构建cDNA消减文库,随机挑取文库克隆进行酶切及测序,所得结果在GenBank中做同源性比对分析。对感兴趣的片段进行电子定位确定其在染色体的位置,用Northern blot,半定量RT-PCR方法检测新基因在肾癌组织与正常肾组织中的差异表达。结果：文库包含414个阳性克隆;随机挑取280个克隆提取质粒并酶切分析,其中265个有插入片段;将其中80个克隆进行测序,初步显示28、158、170、249号4个克隆为新基因片段,电子定位表明上述4个基因分别位于染色体21q^22,4q^15.3,9q^34,22q^11.2。已在GenBank中登录（BM181083,BI784487,BI863835,BI863386）,对其中28、170号克隆用Northern杂交,半定量RT-PCR检测,证实新基因在肾癌组织中表达较正常肾组织显著增高。结论：抑制消减杂交技术是筛选,克隆肾癌差异表达新基因的有效手段;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长,研究基因功能提供了实验基础。     

肿瘤敏感相关基因克隆cDNA消减文库的构建

目的 :烷基磷脂类化合物 (十六烷基磷酸胆碱 ,HePC)诱导人上皮性肿瘤细胞系产生交叉耐药。方法 :用抑制消减杂交技术 ,构建KB和KBrcDNA消减文库。KB为testercDNA与过量的KBrcDNA消减杂交 ,非特异性cDNA片段被有效消减 ,特异表达的文库得到富集。结果 :扩增后得到 12 7个克隆 ,挑取质粒 ,酶切分析均得到 4 0 0～ 80 0bp插入片段。在获得可分析的 78个克隆中 ,2 7%没有同源基因片段或同源性很低 ,暂定为“新基因” ;14 %具有染色体明确定位 ,应该认为是化疗敏感肿瘤KB细胞所特有的cDNA片段 ;19%在人类EST文库MGC和CGAP中出现 ,可能是肿瘤细胞所特有基因 ;发现与耐药性相关的已知功能基因高达 4 0 %。结论 :探索伴随肿瘤细胞耐药发生基因丢失 ,以开拓抗性逆转措施的新途径。     

正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库的构建及差异基因的初步筛选

目的构建人正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.方法采用抑制削减杂交技术,以正常肝组织及有肝癌背景的肝硬化组织作为对比材料.分离出mRNA,经反转录后,通过两轮杂交、两次PCR和T/A克隆构建了两种组织间差异表达基因的cDNA削减文库.结果挑取70个克隆进行酶切和PCR鉴定,显示65个克隆有250～2000 bp插入片段.结论用SSH和T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.该文库的建立为进一步筛选、鉴定出肝癌发生过程中的相关调控基因奠定了基础,也有助于阐明肝硬化在肝癌发生过程中所起的作用.     

Differential gene expression profiling in aggressive bladder transitional cell carcinoma compared to the adjacent microscopically normal urothelium by microdissection-SMART cDNA PCR-SSH

Identifying novel and known genes that are differentially expressed in aggressive bladder transitional cell carcinoma (BTCC) has important implications in understanding the biology of bladder tumorigenesis and developing new diagnostic and therapeutic agents. In this study we identified the differential gene expression profiles comparing tumor to the adjacent microscopically normal mucosa by manual microdissection on frozen sections. The RNAs extracted from microdissected tissues were amplified by SMART cDNA PCR technology to generate forward subtractive cDNA library by suppressive subtractive hybridization (SSH). We obtained 376 positive clones, one hundred clones of aggressive BTCC subtracted cDNA library were selected at random and inserts were reamplified by PCR. After differential screening by reverse dot blotting, 73 positive clones, that contend inserts putatively upregulated in aggressive BTCC, were further analysed by DNA sequencing, GenBank and EST database searching. Sequencing results showed that 66 clones stand for 23 known genes and 7 clones for three new EST (Genbank number: DN236875, DN236874 and DN236873). In conclusion, microdissection-SMART cDNA PCR-SSH allowed for an efficient way to identify aggressive BTCC-specific differential expressed genes that may potentially be involved in the carcinogenesis and/or progression of aggressive BTCC. These differentially expressed genes may be of potential utility as therapeutic and diagnostic targets for aggressive BTCC.