利用CRISPR/Cas9系统构建HepG2细胞THRAP3基因敲除细胞系

目的 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类肝癌细胞HepG2中的甲状腺激素受体相关蛋白3(THRAP3)基因,构建THRAP3基因敲除细胞系.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向THRAP3基因第3个外显子相关序列的多条小向导RNA,通过T7核酸内切酶筛选出切割效率最高的载体,构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒.测序鉴定后,将重组质粒转染至HepG2细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选细胞株,挑取单克隆,再用PCR、测序等方法鉴定细胞基因型,免疫印迹方法鉴定细胞THRAP3敲除效果.使用高通量测序的方法进行基因表达分析.用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响,CCK-8试剂盒检测细胞增殖.结果 成功构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒,筛选出特异性敲除THRAP3基因的细胞系,验证了THRAP3敲除对细胞周期以及细胞增殖的影响.结论 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建并获得了THRAP3基因敲除细胞系并初步探究了THRAP3基因功能.     

利用CRISPR/Cas9技术构建Nedd4基因敲除BMDM巨噬细胞系

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建Nedd4基因敲除骨髓衍生巨噬细胞系(BMDM),为研究Nedd4在巨噬细胞中的作用和机制奠定基础.方法 利用在线软件筛选了评分较高的3个针对Nedd4基因的单向导RNA(sgRNA),然后将合成的sgRNA序列插入到PX330质粒中;将重组质粒转入BMDM细胞,通过有限稀释法获取单克隆,采用Western印迹检测单克隆细胞中NEDD4蛋白水平;通过序列测定确认单克隆细胞的DNA序列.结果 通过Western印迹检测获取1株NEDD4蛋白缺失的BMDM细胞;测序结果表明该细胞系中Nedd4基因发生了16 bp的缺失突变.结论 利用CRISPR/Cas9技术构建的Nedd4敲除BMDM细胞系将成为研究Nedd4在巨噬细胞中的功能和机制的有力工具.     

应用CRISPR/Cas9技术构建MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株

目的 运用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术,构建线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,研究MAVS对细胞生长的影响.方法 针对MAVS基因第一外显子设计小向导RNA(sgRNA),构建pX459-sgRNA重组质粒.然后利用嘌呤霉素筛选ZR-751 MAVS基因敲除的阳性克隆,Western印迹检测MAVS基因敲除情况,提取克隆基因组进行测序鉴定.平板克隆实验检测MAVS被敲除后对细胞增殖的影响,再利用MTS实验检测在DFX培养基刺激下,MAVS对细胞死亡的影响.结果 Western印迹结果说明ZR-751细胞株内MAVS已完全敲除;且在凋亡诱导剂DFX刺激下,MAVS被敲除后促进细胞增殖.结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,初步实验提示MAVS抑制乳腺癌细胞生长,为后续研究MAVS在肿瘤中的功能奠定了基础.     

利用CRISPR/Cas9系统构建HeLa细胞Cdc25C基因敲除稳定细胞株

目的 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类宫颈癌细胞HeLa中的细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cycle 25 homolog C,Cdc25C)基因,构建Cdc25C基因稳定敲除细胞株.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别Cdc25C基因第一外显子相关序列的上下游小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建真核重组表达质粒.测序鉴定后,将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选稳定敲除Cdc25C基因细胞株,再用免疫印迹方法鉴定细胞Cdc25C敲除效果.最后用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响.结果 筛选出稳定敲除Cdc25C基因细胞株,且Cdc25C敲除显著影响G2/M期进程.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源Cdc25C基因敲除细胞株,为研究Cdc25C在细胞周期进程的功能以及相关癌症的发生奠定了基础.     

蜕皮素诱导基因表达细胞系的建立及其应用

目的：建立一个可诱导表达目的基因的细胞系以研究新基因的功能。方法：将含蜕皮素受体基因的表达载体pVgRXR稳定转染NIH3T3细胞，经zeocin抗性筛选，获得单克隆抗性细胞株，并进一步将可诱导表达质粒pIND-LacZ分别转染各单克隆细胞，经松甾酮(ponasterone)A诱导和β-半乳糖苷酶活性检测，鉴定出阳性单克隆。结果与结论：在建立稳定表达功能性蜕皮素受体的NIH3T3细胞系的基础上，我们进一步建立了一个可诱导表达红系分化相关基因(EDAG)的细胞系，并对目的基因诱导表达特性及诱导目的基因表达后细胞表型的改变进行了初步观察，结果提示EDAG可能与血液细胞的增殖分化密切相关。     

利用CRISPR／Cas9系统构建H22细胞GP73基因敲除稳定株及功能鉴定

目的：利用CRISPR／Cas9基因编辑系统敲除小鼠源肝癌细胞H22中的GP73基因,构建H22细胞GP73基因敲除的稳定细胞株。方法根据CRISPR／Cas9靶点设计原则,设计2条特异性识别GP73基因启动子的上下游sgRNA,利用载体pX459质粒,构建2对重组真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染至H22细胞内,使用嘌罗霉素加压筛选稳定敲除GP73的H22细胞株,利用免疫印迹检测重组质粒对内源GP73的敲除效果。MTT实验检测GP73被敲除后对细胞增殖能力的影响,再利用划痕实验检测细胞的迁移能力。结果免疫印迹结果说明敲除GP73基因的小鼠源H22细胞株内无GP73蛋白的表达;并且GP73被敲除后,H22细胞的增殖能力和迁移能力减慢。结论通过CRISPR／Cas9系统获得了靶向GP73基因的重组质粒,并且筛选出了稳定干扰GP73表达的细胞株,从而为探讨GP73在肝癌发生中的作用奠定基础。     

人HGF基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的构建和鉴定

目的 :构建携带肝细胞生长因子 (HGF)的逆转录病毒载体 ,并建立高效、稳定生产HGF的包装细胞株。方法 :以pcDNA3.0 HGF质粒为模板进行PCR反应扩增出HGF基因全长序列 ,亚克隆至逆转录病毒载体pMSCVneo构建重组逆转录病毒质粒 ,以脂质体介导转染包装细胞PT6 7,经G4 18筛选 ,进而挑选抗性集落扩大培养后 ,用靶细胞NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出高效产毒细胞株。扩大培养后进行RT PCR鉴定HGFmRNA的表达。扩大培养NIH3T3细胞抗性集落 (NIH3T3/HGF) ,并用细胞培养上清进行人肝癌细胞系HepG2的扩散试验。结果 :PCR反应扩增出 2 2 0 0bp的HGF基因 ,构建了重组逆转录病毒表达载体pMSCV HGF ,测序鉴定正确。经脂质体介导转染包装细胞、G4 18筛选和NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出具有最高病毒滴度 (8.8× 10 7cfu /ml)的细胞集落 ,扩大培养后建立高效表达HGF的包装细胞株PT/HGF ,RT PCR证实HGF基因在PT/HGF中有转录。NIH3T3/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散 ,形态改变。结论 :成功构建了携带HGF的逆转录病毒载体pMSCV HGF ,并建立了稳定、高效生产有活性的HGF的产毒细胞株PT/HGF。     

内源性MGF在IGF-Ⅰ Pre-mRNA选择性剪接中的作用

目的 利用CRISPR/Cas9敲除小鼠成肌细胞系C2C12机械生长因子(mechano-growth factors,MGF),研究MGF在IGF-Ⅰ pre-mRNA选择性剪接和C2C12增殖分化中的作用.方法 针对IGF-Ⅰ第五个外显子设计并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒,通过细胞转染并筛选出MGF发生移码突变的细胞株.采用RT-qPCR技术,检测这些细胞株MGF和IGF-IEa表达变化,以及细胞增殖和肌向诱导分化能力的变化.结果 成功构建了针对MGF的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,并筛选出3株MGF移码突变细胞株.这些细胞株的MGF和IGF-IEa表达上升,细胞增殖活性减弱,在诱导分化过程中,肌细胞标志性基因myogenin、MGF和IGF-IEa表达升高.结论 内源性MGF敲除能够影响IGF-Ⅰ pre-mRNA的选择性剪接以及增殖分化能力.     

Schlafen2基因在细胞中的表达及其生物学特性研究

目的:建立Schlafen2(Slfn2)基因稳定表达的细胞系以进一步研究其生物学功能.方法:构建pEGFP- Slfn2真核表达载体;瞬时转染pEGFP- Slfn2载体及其对照载体于NIH/3T3细胞,观察细胞中Slfn2基因的表达及分布;稳定转染pEGFP-Slfn2及其对照空载体于NIH/3T3细胞,G418筛选获得抵制的细胞株,用Northern印迹进一步鉴定Slfn2在各细胞株中的表达情况;利用细胞生长曲线和Transwell细胞侵袭实验检测Slfn2对细胞增殖及迁移能力的影响.结果:本研究获得了稳定表达Slfn2的细胞株,该基因表达的蛋白在细胞核及细胞浆均有分布;稳定表达该基因的细胞株的增殖及迁移能力均显著降低.结论:Slfn2基因可能是一个潜在的肿瘤抑制基因.     

p38 MAPK对PDGF诱导的细胞迁移的调控作用

目的 研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在血小板源性生长因子(PDGF)诱导的细胞迁移中的作用.方法 PDGF刺激小鼠NIH 3T3细胞后,利用免疫印迹法检测p38磷酸化程度的改变情况.利用Transwell细胞迁移系统来观察PDGF对NIH 3T3细胞迁移的诱导作用,以及p38基因敲除对PDGF诱导的细胞迁移的影响.结果 PDGF能显著诱导NIH 3T3细胞迁移(P＜0.001),且在此过程中p38能被磷酸化激活,p38基因敲除能阻断PDGF诱导的细胞迁移(P＜0.001).结论 p38 MAPK参与了PDGF诱导的细胞迁移的调控.