Wistar大鼠的咬肌放射损伤模型

背景：构建稳定可靠的咬肌放射损伤模型对颌面部肿瘤放疗的相关研究有重要意义。目的：以放射剂量40Gy照射后Wistar大鼠咬肌构建大鼠咬肌放射损伤模型。方法：成年Wistar大鼠20只,随机分成正常对照组和放射损伤组。放射损伤组采用直线加速器照射大鼠咬肌区累积40Gy制造咬肌放射损伤。在28d后,在光镜及电镜下观察咬肌放射区病理改变,RT-PCR检测转化生长因子B1的基因表达。结果与结论：40Gy照射后28d大鼠咬肌区出现结构受损、血管密度减低（P〈0．01）等放射损伤表现,同时引起转化生长因子β1的基因表达升高（P〈0．001）等机体被动修复表现。结果证实Wistar大鼠咬肌区直线加速器40Gy照射可以作为咬肌放射损伤模型。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞☆

背景:血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义.目的:克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建 pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性.方法:采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和 DNA 测序的方法对提取和重组 DNA 进行鉴定.pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定.结果与结论:构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段.提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性.     

血管内皮生长因子C靶向RNA干扰重组载体的构建和效应检测

目的:构建针对人血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,并观察其在胃癌细胞中的干扰效果。方法:实验于2006-02/2007-02在河南省分子医学重点学科开放实验室完成。①实验材料:小干扰RNA表达载体pSilencer3.1为美国Ambion公司产品;胃癌细胞SGC7901为河南省分子医学重点学科开放实验室保存;血管内皮生长因子C基因的干扰片断和聚合酶链反应引物(152bp)由上海生工生物公司合成。②实验过程:根据pSilencer3.1-H1载体要求设计靶向血管内皮生长因子C基因的两对小干扰RNA,退火后连接入载体相应位点,构建重组表达质粒。经酶切和测序鉴定后分别转染胃癌细胞株SGC-7901,经G418筛选,获得稳定表达的细胞株。③实验评估:采用反转录-聚合酶链反应和Westernblot法检测血管内皮生长因子CmRNA和蛋白水平的表达。结果:①重组质粒的酶切、核苷酸序列分析结果:经酶切和测序鉴定证实成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,建立了稳定转染细胞株。②稳定转染的细胞株中血管内皮生长因子CmRNA和蛋白表达:反转录-聚合酶链反应和Western blot显示转染后血管内皮生长因子C表达与对照组相比有不同程度的降低,以pSilencer3.1-neo-VEGF-C1尤为明显,抑制血管内皮生长因子C表达,不影响细胞的生长。结论:成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体及稳定转染的胃癌细胞株。     

细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体

背景:腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法.目的:观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性.设计、时间及地点:基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成.材料:合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供.pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pint.AV.spaT质粒、pint.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司.方法:通过动态模板PCR基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165.将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pint.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pint,AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B转染293细胞.主要观察指标:以DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率.结果:重组质粒用EcoR Ⅰ酶切后,切成2条片段,大小约为1 kb和6.9 kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒.荧光显微镜下,8 h后即可见部分细胞发出荧光,24 h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%.线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B共转染293细胞,12-14 d后会出现细胞病变效应.分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500 bp处出现条带.结论:以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒.     

血管内皮生长因子基因转染促进骨髓间质干细胞增殖的实验

目的:以基因转染为平台,利用脂质体将血管内皮生长因子基因转入骨髓间质干细胞,使其可以在作为种子细胞的同时,作为基因治疗的载体将血管内皮生长因子基因导入缺血组织,从而为探索一种更加有效的缺血性心脏病治疗方法提供实验室基础。方法:实验于2004-07/2005-03在解放军第二军医大学医学遗传实验室及上海交通大学附属第一人民医院心内科实验室完成。①分离、培养、鉴定大鼠骨髓间质干细胞。②试验组用构建好的PcDNA3.1-VEGF进行基因转染,阳性对照组用PcDNA3.1空质粒进行转染,阴性对照组只加入培养液。③收集各组第1,3,5,7,9,11天的上清液,用ELISA法测定培养上清液中血管内皮生长因子的浓度;提取阳性克隆的细胞蛋白;进行Westernblot分析;用四甲基偶氮唑盐法检测转染后血管内皮生长因子的表达对骨髓间质干细胞增殖的影响。结果:①免疫组织化学示所培养细胞CD106 ,CD34-。②ELISA方法示质粒转染细胞后第2天,上清液中即可出现血管内皮生长因子浓度的增高,第5天时达到高峰,以后逐渐降低,10d后趋于稳定,但其浓度仍高于对照组。③Westernblot示转染组血管内皮生长因子蛋白浓度明显高于空质粒转染组和未转染组。④四甲基偶氮唑盐示转染后血管内皮生长因子的表达可以促进骨髓间质干细胞的增殖。结论:血管内皮生长因子成功转染骨髓间质干细胞,血管内皮生长因子的表达促进了骨髓间质干细胞的增殖,从而可以将促血管生长因子治疗和干细胞移植有效的结合起来。     

血管内皮生长因子基因转染促进骨髓间质干细胞增殖的实验

目的：以基因转染为平台，利用脂质体将血管内皮生长因子基因转入骨髓间质干细胞，使其可以在作为种子细胞的同时。作为基因治疗的载体将血管内皮生长因子基因导人缺血组织，从而为探索一种更加有效的缺血性心脏病治疗方法提供实验室基础。 方法：实验于2004—07／2005-03在解放军第二军医大学医学遗传实验室及上海交通大学附属第一人民医院心内科实验室完成。①分离、培养、鉴定大鼠骨髓间质干细胞。②试验组用构建好的PcDNA3．1-VEGF进行基因转染，阳性对照组用PcDNA3．1空质粒进行转染，阴性对照组只加入培养液。③收集各组第1，3，5，7，9，11天的上清液，用ELISA法测定培养上清液中血管内皮生长因子的浓度；提取阳性克隆的细胞蛋白；进行Western blot分析；用四甲基偶氮唑盐法检测转染后血管内皮生长因子的表达对骨髓间质于细胞增殖的影响。 结果：①免疫组织化学示所培养细胞CD106^＋，CD34^-。②ELISA方法示质粒转染细胞后第2天，上清液中即可出现血管内皮生长因子浓度的增高，第5天时达到高峰，以后逐渐降低，10d后趋于稳定，但其浓度仍高于对照组。③Westem blot示转染组血管内皮生长因子蛋白浓度明显高于空质粒转染组和未转染组。④四甲基偶氯唑盐示转染后血管内皮生长因子的表达可以促进骨髓间质干细胞的增殖。 结论：血管内皮生长因子成功转染骨髓间质干细胞，血管内皮生长因子的表达促进了骨髓间质干细胞的增殖，从而可以将促血管生长因子治疗和干细胞移植有效的结合起来。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显.     

神经生长因子可促进骨折愈合过程中血管内皮生长因子的表达

背景：骨折愈合过程十分复杂,需要多种细胞因子的参与.目前研究较多的细胞因子有骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、血管内皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子,但神经生长因子在骨折愈合过程中对血管内皮细胞生长因子的作用尚不明确.目的：观察神经生长因子对兔骨折愈合中血管内皮生长因子表达的影响.方法：实验建立标准兔桡骨骨折模型,分别用神经生长因子、神经生长因子单克隆抗体和生理盐水进行干预,即应用神经生长因子组、拮抗神经生长因子组和对照组.结果与结论：损伤后24,48 h和损伤后1,3,6,8周Western blot检测骨折端组织血管内皮生长因子蛋白的表达分析结果显示,3组各时间点血管内皮生长因子表达的关系为：应用神经生长因子组＞对照组＞拮抗神经生长因子组（P＜0.05）.结果证实,在骨折愈合过程当中,应用神经生长因子可以促进血管内皮生长因子表达.     

血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

背景：血管内皮生长因子是一种有效的血管形成和通透性诱导因子,其中在体内以血管内皮生长因子165和血管内皮生长因子121表达为主,具有强烈的促血管新生作用。目的：观察以血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞,继而分化为血管内皮细胞的可行性。方法：分离提取50gSD大鼠骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪鉴定,将携有血管内皮生长因子165基因的质粒pGLV．EFla,采用慢病毒转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果与结论：转染后12h可见细胞内有绿色荧光蛋白表达,48h后表达增多,72h后达到高峰,其后部分细胞荧光开始减退。结果证明血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有绿色荧光蛋白表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165）不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的：观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1：3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义（P〈0.05）,但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义（P〉0.05）,转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义（P〈0.05）,hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

大鼠皮肤创伤修复过程中转化生长因子β1和β3的表达

背景：转化生长因子β在组织创伤修复中发挥核心和关键作用.目的：观察转化生长因子β1和转化生长因子β3在大鼠皮肤瘢痕性创伤愈合过程中表达量及表达部位的变化.方法：制备大鼠皮肤全层切伤模型,长度1.5-2.0 cm,深及筋膜层.于伤后0 h,12 h,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d,7 d处死大鼠,取损伤部位皮肤,采用免疫组织化学染色检测各时间点转化生长因子β1和转化生长因子β3的表达,并进行定量分析.结果与结论：免疫组织化学染色显示,在创伤愈合的早期阶段（伤后1-5 d）,转化生长因子β1和转化生长因子β3免疫阳性颗粒主要出现在上皮细胞、上皮基底层细胞胞浆、巨噬细胞等免疫细胞胞浆及肉芽组织中;随着创伤修复时间的持续,免疫阳性颗粒主要出现在真皮层的成纤维细胞及细胞外基质中.其中转化生长因子β1的表达在创伤后1-5 d最强,而转化生长因子β3在创伤后六七天时开始明显表达.可见在大鼠皮肤瘢痕性创伤愈合过程中,转化生长因子β1的表达先于转化生长因子β3,提示转化生长因子β1与胶原形成及创伤修复关系密切,而转化生长因子β3在愈合后期表达量有升高趋势,其可能与创伤后期的组织改建密切相关.     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景:骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的:观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法:体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1:3比例的混合液转染,并分为3组:转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论:转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P<0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P>0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P<0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

最新进展的转基因技术在骨与软骨缺损修复中的应用

背景：组织工程技术在骨与软骨的修复方面已经取得巨大进步,其中转基因技术的引入在最近几年也引起人们广泛的关注。目的：总结近5年来转基因技术在骨与软骨缺损修复中的最新研究进展。方法：应用计算机检索CNKI数据库和PubMed数据库2007年1月至2012年3月关于转基因技术治疗骨与软骨缺损方面的文献,中文检索词＂基因,治疗,骨,软骨,缺损＂。英文检索词＂gene,therapy,bone,cartilage,defect＂,最终纳入22篇符合要求的文献。结果与结论：基因治疗为骨和软骨再生带来了一种新的治疗理念,它可以把具有特异性的目的基因精确转移入靶细胞内,并特异性的表达。目前应用于骨与软骨缺损的基因主要包括骨形态发生蛋白,转化生长因子,碱性成纤维细胞生长因子,胰岛素样生长因子,血管内皮细胞生长因子,Bcl-xl基因等。应用基因治疗可以诱导骨与软骨的形成,为骨与软骨的修复提供了崭新的途径。     

肥厚腰椎黄韧带中成纤维细胞生长因子、转化生长因子及结缔组织生长因子的表达

背景：腰椎黄韧带肥厚是临床上引起腰椎管狭窄的主要因素之一,但其分子机制仍不是非常清楚。目的：分析纤维化相关细胞因子碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和结缔组织生长因子在腰椎黄韧带肥厚过程中的作用。方法：取临床手术所取黄韧带,对照组6例（椎管内占位且无腰椎不稳患者黄韧带）、突出组（单纯腰椎间盘突出症患者黄韧带）6例、腰椎管狭窄症组6例。采用实时定量RT-PCR的方法检测各组黄韧带中碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1、结缔组织生长因子及Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原蛋白的mRNA含量,分析3个细胞因子在黄韧带肥厚过程中的作用。结果与结论：腰椎管狭窄症组碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达均明显高于突出组和对照组（均P 〈0.05）;腰椎管狭窄症组转化生长因子β1mRNA在3组中的表达明显高于对照组和突出组（均P 〈0.01）;结缔组织生长因子 mRNA 3组间差异无显著性意义（P 〉0.05）。腰椎管狭窄症组Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显高于突出组和对照组（均P 〈0.05）;Ⅲ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白mRNA表达3组之间差异无显著性意义（P 〉0.05）。结果说明碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1在腰椎黄韧带肥厚形成过程中有重要作用,引起黄韧带肥厚的主要胶原产物为Ⅰ型胶原蛋白。     

丹参酮ⅡA抑制心肌细胞的纤维化

背景：转化生长因子β-Smads信号通路是心肌纤维化的关键通路;丹参酮ⅡA具有抑制心肌纤维化作用.目的：验证丹参酮ⅡA对转化生长因子β1致心肌纤维化的作用并探讨其机制.方法：取出生24 h内的SD大鼠心脏,利用酶消化法结合差速贴壁体外培养心肌成纤维细胞.取上述第3代心肌成纤维细胞,用5μg/L转化生长因子β1培养15,30,60,120 min或6,12,24 h后收集细胞,用不同浓度（10-5 mol/L、10-4结果与结论：转化生长因子β1在一定范围内以时间依赖方式诱导结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原、磷酸化Smad3及Smad7的表达,刺激终末结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原mRNA的表达量明显上升（均P 〈0.01）;磷酸化Smad3及Smad7蛋白表达量在刺激后1 h达到峰值,表达量显著增加（均P 〈0.01）.高浓度丹参酮ⅡA预处理可显著下调磷酸化Smad3、结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原表达（均P 〈0.01）.两种浓度的丹参酮ⅡA预处理均可上调Smad7蛋白表达（P 〈0.05,P 〈0.01）.提示丹参酮ⅡA对心肌纤维化有抑制作用,可能与其上调Smad7蛋白表达,抑制转化生长因子β1诱导的Smad3磷酸化,部分阻断转化生长因子β1-Smads信号通路有关. mol/L）丹参酮ⅡA预处理2 h后再加入5μg/L转化生长因子β1培养120 min或24 h后收集细胞,并设空白对照组.免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定,反转录聚合酶链反应检测结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达,Western Blot检测Smad7及磷酸化Smad3蛋白表达.免疫组织化学染色及免疫荧光法检测磷酸化Smad3、结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原蛋白表达.