表达新城疫病毒F48E8株血凝素—神经氨酸酶的重组鸡痘病毒的构建 …

在克隆和鉴定新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８株血凝素－神经氨酸酶（ＨＮ）基因的基础上,应用分子克隆技术将ＨＮ基因导入鸡痘病毒插入载体ｐＦＧ１１７５－１中启动子Ｐ７．５的下游,得到携带ＮＤＶ－ＨＮ基因的质粒ｐＦＧＨＮ１１７５－１。将此质粒ｐＦＧＨＮ１１７５－１以脂质体转染中国鸡痘病毒疫苗株２８２Ｅ４株感染３￣４ｈ的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化３次,得到稳定的重组鸡痘病毒。用ＮＤＶ－ＨＮ基因特异     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中表达水平初探

将含有鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的重组转移质粒ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 和ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ ,ｇａｌ＋ ） 共转染草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞,经空斑纯化得到重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 和 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。将重组毒株分别感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,并进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测。结果表明, Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 蛋白, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后７２ ｈ Ｓ１ 蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的３５ ．８ ％ ,而 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 感染的细胞内检测不出 Ｓ１ 蛋白。经分析认为这一差异主要来自 Ｓ１ 基因翻译起始位点及其附近的周围环境。     

血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区基因的克隆及其在中国仓？…

朋原代培养的人脐静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）提取细胞总ＲＮＡ,采用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法得到ＶＥＧＦ受体Ｆｌｔ－１胞外区前３个ＩｇＧ样区域ｃＤＮＡ片段（Ｆｌｔ－１ｎ３）。将获得的受体基因克隆到真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡ３．１中,得到重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆｌｔ－１ｎ３,通过南体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）,用Ｇ４１８筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞砍隆。经固相结合实验筛选     

利用脊髓灰质炎病毒5‘NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）ＲＮＡ聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体ｐＳＧ５质粒上,分别构建了４个表达ＲＮＡ聚合酶的质粒。体外转录实验证明,ｐＳＧ５－ＰＯＬ１．９９和ｐＳＧ５－ＰＯＬ２．０３质粒转染细胞的提取物促进了特异的ＲＮＡ转录,表明两质闰可表达ＲＮＡ聚合酶。将ＰＶ的５’ＮＣＲ序列插在载体ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１的ＣＭＶ启动子下游,构建了ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１－５’ＮＣＲ质粒;     

HIV—1 SF2株env基因（120）在大肠杆菌中的表达

运用基因重组技术,将ＨＩＶ－１ ＳＦ２株编码外膜蛋白ｇｐ１２０的ｅｎｖ基因片段与原核载体ｐＢＶ２２０进行重组,构建成质粒ｐＢＶＳＦ２ｅｎｖ,并在大肠杆菌（Ｅ．ＣｏｉｌＤＨ１０ｂ）中获得表达,经Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ反应证实,该重组蛋白与来自ＨＩＶ－１感染者的血清（含多克隆抗体）发生特异性反应。     

表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应技术,用设计带有限制性酶切位点的引物,特异地扩增从起始密码子开始的１ ．８ ｋｂ 新城疫病毒（ Ｎ Ｄ Ｖ） 血凝素神经氨酸酶（ Ｈ Ｎ） 基因开放式阅读框,然后插入ｐ Ｔ Ｋ２ Ｂ 的 Ｎｈｅ Ⅰ位点,构建了含 Ｎ Ｄ Ｖ Ｈ Ｎ 基因的插入载体ｐ Ｔ Ｋ Ｈ Ｎ１ 和ｐ Ｔ Ｋ Ｈ Ｎ２ ,再与感染火鸡疱疹病毒（ Ｈ Ｖ Ｔ） 细胞的总 Ｄ Ｎ Ａ 共转染鸡胚成纤维细胞（ Ｃ Ｅ Ｆ） ,经有限稀释法和 Ｄｏｔｂｌｏｔ 筛选,得到含有 Ｈ Ｎ 基因的重组体ｒ Ｈ Ｖ Ｔ１ 和ｒ Ｈ Ｖ Ｔ２ 。经组织培养传代和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析,表明重组体在感染细胞中表达了 Ｈ Ｎ 蛋白。重组体在 Ｃ Ｅ Ｆ 上的生长特性与亲本病毒相同,且在连续传代过程中保持稳定。为国内新城疫基因工程疫苗研制奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和ＤＮＡ体外重组方法,克隆出５７９ｂｐ的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ４ｂ基因片段,插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－２８ａ中,构建重组质粒ｐＥＴ／ＮＳ４ｂ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,经ＩＰＴＧ诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在３０ｋＤ处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化目的的蛋白,ＥＬＥＳＡ检测结果表     

日本血吸虫(中国大陆株)谷胱甘肽转移酶编码区基因的体外扩增、克隆及在原核细胞的高效表达

为表达、获取日本血吸早谷胱甘肽转移酶（ＳｊＧＳＴ）基因工程重组蛋白,以日本血吸虫（中国大陆株）ｃＤＮＡ为模板,设计、合成特定寡核苷酸引物,ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ编码基因序列,将扩增产物连接ｐＧＥＭ－Ｔ克隆载体,再亚克隆到真、原核表达质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ中,转染大肠杆菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ,经ＩＰＴＧ诱导后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表达效果。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出日本血吸虫ＧＳＴ编码区基因片段,其     

以痘苗病毒天坛株为载体的表达单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D的重组活疫苗的建立

从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１－１６８株）病毒基因组中,分离出含有糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的１．２ｋｂ片段,插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ区的质粒ｐＪＳＢ１１７５Ｐ７．５ｋ启动子下游,转染无白血病鸡胚原代细胞,获得带有ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。在感染细胞中表达的膜抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达分子量为５４ｋＤ糖蛋白。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析了重组病毒ＤＮＡ中特异的ｇＤ基因,对作为活疫苗的重组痘苗病毒株进行了一些微生物学活性、免疫原性和毒力等方面的研究。     

人表皮生长因子(EGF)与单核-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合蛋白在大肠杆菌中的表达

应用基因工程技术,将ＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ基因克隆到ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）载体的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,再将重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达,ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明ＥＧＦ－ＧＭ－ＣＳＦ融合蛋白获得表达,并且具有ＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ的免疫学活性．这为进一步研究该融合蛋白的功能和肿瘤治疗提供一种新的基因产品．     

马立克氏病病毒Rispens株B抗原基因的克隆及其重组鸡痘病毒的构建

马立克氏病病毒（Ｍａｒｅｋ’ｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ,ＭＤＶ）是马立克氏病（ＭＤ）的病原,是第一个能用实验证明具有致肿瘤作用的疱疹病毒,也是研究病毒性肿瘤特别是疱疹病毒肿瘤的理想的实验模型。ＭＤ还是第一个广泛使用疫苗预防的肿瘤性病毒病。应用免疫扩散...     

马立克氏病病毒REispens株B抗原基因的克隆及其重组鸡痘病毒的构建

Purified DNAs from Chicken Embryo Fibroblast (CEF) cultures infected with MDV strain Rispens were used as templates. Specific fragment with the size of about 2.9 kb was successfully amplified through Polymerase Chain Reaction(PCR) and identified to be gB gene of MDV by dot blot hybridization with a digoxigenin-labelled MDV gB specific oligonucleotide probe. The gB gene from strain Rispens was cloned into pUC19 and FPV insertion vector pFG1175-1 to construct plasmid pMGB and pFGBR1775-1 respectively. DOSPER liposome-mediated transfection with insertion vector DNA pFGBR1175-1 was performed on CEF monolayers infected with FPV 3-4 h earlier. Recombinant FPV was clone purified. Immunofluorescence Assay(IFA) showed that MDV gB gene had been expressed in FPV.     

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。     

鸡痘病毒复制非必需区的选择对重组鸡痘病毒免疫效力的影响

母源抗体的干扰是重组鸡痘病毒(FPV)活载体疫苗至今未能得到大规模推广应用的主要原因,而选择适当的FPV复制非必需区可能是解决这一问题的方法之一。根据已发表的美国致病株FPV的基因组设计两对引物,用PCR方法扩增FPV假定复制非必需区的两个侧翼区FPV1和FPV2 ,利用此假定复制非必需区构建FPV表达载体pP12LS及表达ZJ1株新城疫病毒(NDV)F基因的转移载体pP12LSF。pP12LSF与2 82E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF) ,经数轮蓝斑筛选得到纯化的重组病毒rFPV_FSC。重组FPV在CEF上连续传2 0代仍具有良好的遗传稳定性。对重组FPV进行免疫效力试验,在SPF鸡上,重组病毒rFPV_FSC和与之仅有复制非必需区差异的rFPV_FSB均能抵抗NDV强毒的攻击,提供10 0 %的保护。但在有母源抗体的商品鸡上,rFPV_FSC与rFPV_FSB的免疫效力却有显著差异,保护率分别为10 0 %和6 1 5 4 % ,rFPV_FSC的免疫效力与NDV常规油苗相当。试验结果表明,母源抗体对重组FPV的免疫效力有一定的影响,而选择合适的FPV复制非必需区是克服母源抗体并提高重组FPV免疫效力的有效策略之一     

表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其体外表达产物生物活性的检测

从ConA刺激的鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因编码区。将该编码区Cdna序列和调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子（PE/L）的基因片段定向克隆到鸡痘病毒转移载体p1175中,获得重组转移载体P1175il2,然后转染已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV）的鸡胚成纤维细胞（CEF）,质粒P1175il2与wt-FPV基因组DNA发生同源重组,产生了表达ChIL-2的重组鸡痘病毒Rfpv-IL2。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得并纯化重组鸡痘病毒Rfpv-IL2。应用XTT/PMS方法检测的Rfpv-IL2 （M.O.I 2.0）感染CEF 72小时后细胞上清中表达的重组ChIL-2生物活性,效价为3.6×105u/Ml,表明Rfpv-IL2能有效地表达ChIL-2。下一步将利用Rfpv-IL2在体内表达ChIL-2,研究ChIL-2的免疫增强作用及其作用机理。     

表达鸡新城疫病毒F、HN基因和传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒的构建及其特性研究

利用同源重组将新城疫病毒(NDV)的F和HN基因、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因以及报告基因LacZ插入鸡痘病毒(FPV)的017株的复制非必需区,其中NDV的F、HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ是在早晚期启动子LP2EP2的控制下,大肠杆菌报告基因LacZ在晚期启动子P11的控制下。经过10轮蓝斑纯化获得了包含了NDV的F和HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ的重组鸡痘病毒,称为rFPV-F/HN/gB/LacZ。经PCR方法证明rFPV-F/HN/gB/LacZ基因组中含有NDV的F基因、HN基因和ILTVgB基因;间接免疫荧光试验和Western-blot试验表明NDV的F、HN蛋白和ILTVgB蛋白在rFPV-F/HN/gB/LacZ感染的CEF细胞中获得表达。与亲本毒相比,重组病毒在病毒的复制和致鸡胚成纤维细胞的病变方面无显著不同。这证明了在鸡痘病毒载体的一个复制非必需区可以同时插入多个禽类病原的多个外源基因,为制备多价基因工程疫苗奠定了基础。     

表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RTPCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒(AIV)分离株(A/Chicken/China/F/1998)的血凝素(HA)基因,将其定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P75的下游,得到重组转移载体1175HA。以脂质体转染法将1175HA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wtFPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过在含Xgal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPVHA。以间接免疫荧光法证实感染rFPVHA的CEF表达了HA。rFPVHA在免疫7日龄SPF鸡7天后即能诱生可检出的血凝抑制(HI)抗体,14天后诱生的HI抗体到达高峰,且诱生的HI抗体保持较高水平达55天。在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力试验表明,rFPVＨＶ能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒,效果与AIV全病毒灭活苗相当。     

Construction and characterization of recombinant fowlpox virus co-expressing F and HN genes of newcastle disease virus and gB gene of infectious larygnotracheitis virus

The Fusion (F) and Haemagglutinin-Neuraminidase (HN) genes of Newcastle disease virus (NDV) and the glycoprotein B (gB) gene of infectious laryngothracheitis virus (ILTV) as well as a LacZ reporter gene were all inserted into a nonessential gene of fowlpox virus (FPV) 017 strain by homologous recombination. The NDV and ILTV genes were each under the control of a fowlpox virus immediate early/late promoter (LP2EP2), whereas the LacZ reporter gene expression cassette was regulated by a P11 late promoter. A recombinant FPV harboring the F, HN and gB genes as well as the LacZ gene, designated as rFPV-F/HN/gB/LacZ, was obtained after ten cycles of blue plaque purification. The presence of the NDV and ILTV genes was confirmed by PCR. The expression of the recombinant proteins in rFPV-F/HN/gB/LacZ was characterized by Western blot (F and gB proteins) and indirect immunofluorescence tests (F, HN and gB proteins). The results demonstrated that all four foreign proteins, which were encoded within a 10-kb gene fragment, could be expressed authentically and efficiently. Compared with the parental virus, rFPV-F/HN/gB/LacZ showed no obvious difference with respect to virus replication and cytopathogenic effects in the cell culture of chicken embryo fibroblasts (CEF). Overall, this study suggests that FPV can be a useful live virus vector for the expression of multiforeign genes against multiple avian pathogens.     

表达猴免疫缺陷病毒Env蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选

目的:构建并筛选表达猴免疫缺陷病毒(SIV)Env蛋白的重组鸡痘病毒(FPV),并对其进行鉴定。方法:设计引物,通过PCR技术扩增SIV env基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的FPV穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-SIV env,然后将其与FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR、RT-PCR、Western印迹对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组FPV基因组中,RT-PCR、Western印迹结果表明SIV Env蛋白在感染细胞内表达且具有抗原性;连续传代20次,PCR、RT-PCR、Western印迹均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,且病毒已经纯化。结论:获得表达SIV Env蛋白的重组FPV,为进一步免疫试验研究奠定了基础。