低温微滤技术制备富含β-酪蛋白和乳清蛋白的新型功能性乳蛋白配料

以市售的巴氏杀菌脱脂乳为原料,探究膜孔径、温度、洗滤液和洗滤次数等条件对β-酪蛋白和乳清蛋白分离效果和膜通量的影响,最终制备了富含β-酪蛋白与乳清蛋白的新型功能性乳蛋白配料。研究采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱对蛋白做定性和定量分析。研究表明,在4℃条件下,使用30 nm孔径的陶瓷膜,以水作为洗滤液,可使得β-酪蛋白的分离效果最佳;在最优条件下,脱脂乳经微滤浓缩3倍后,再在相同条件下补水洗滤4次,将膜过滤各阶段所得的透过液混合,可得到β-酪蛋白和乳清蛋白的产率分别为51.7%和99.7%,复合蛋白中β-酪蛋白和乳清蛋白所占比例分别为51.1%和40.0%,而αs-酪蛋白的含量得以大大降低,该功能性复合蛋白可作为一种新型的功能性蛋白配料用于配方乳粉等婴幼儿食品的研制。     

A2β-酪蛋白的功能性及其在乳制品中应用的研究进展

牛奶中富含多种营养成分,包括蛋白质、脂质、碳水化合物等,每100 g牛奶中就含有3 g蛋白质,其中主要包括乳清蛋白和酪蛋白。β-酪蛋白占牛奶蛋白总量的24%～28%,其主要包括两种基因型：A1型与A2型。A1β酪蛋白经消化后产生的β-酪啡肽-7会导致人体消化功能紊乱、心血管疾病等不良反应。A2β-酪蛋白则产生较少甚至并不产生β-酪啡肽-7,在胃肠道消化、提高抗氧化功能、降低胆固醇浓度等方面具有益生作用。本文综述了β-酪蛋白基因型在人体内消化后所产生的影响,并阐述了A2β-酪蛋白的益生功能,讨论其对人体健康的作用。并从β-酪蛋白基因型在乳制品中的应用入手,阐述A2β-酪蛋白乳制品的研究进展,为今后乳制品中A2β-酪蛋白的功能研究提供指导意义。     

稳定同位素稀释-超高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定牛奶及牛源性婴幼儿配方乳粉中A1型和A2型β-酪蛋白含量

目的 建立基于纯化蛋白和稳定同位素稀释-超高效液相色谱-三重四极杆质谱法(ultra performance liquid chromatography coupled triple quadrupole mass spectrometry,UPLC-MS/MS)定性及定量测定牛奶及牛源性婴幼儿配方乳粉中A1和A2 β-酪蛋白变异体的分析方法。方法 首先将β-酪蛋白标准品中A1和A2 β-酪蛋白变异体在高效液相色谱仪上分离,通过各自的纯化蛋白确定两种变异体在标准品中的含量,再将试样中的β-酪蛋白经胰蛋白酶酶解成肽,经UPLC-MS/MS检测。通过筛选的特异肽段,经β-酪蛋白标准品及稳定同位素稀释内标法计算,获得试样中β-酪蛋白A1变异体和A2变异体的含量。结果 本研究采用的β-酪蛋白标准对照品中A1和A2 β-酪蛋白变异体含量分别为20.8%和55.1%,且在检测中标准曲线的线性相关系数均大于0.99,方法重现性中相对标准偏差为2.290%～4.720%。结论 本方法溯源性及精密度好,适用于牛奶及牛源性婴幼儿配方乳粉中两种β-酪蛋白变异体的测定。     

乳类食物中β-酪蛋白的结构及营养功能

综述了人类母乳(以下简称母乳)和牛乳蛋白质中乳清蛋白与酪蛋白比例、相应蛋白质种类、含量及其营养特点,并重点叙述了酪蛋白的亚型及结构,母乳中含量最多的酪蛋白组分β-酪蛋白的消化特性、营养价值和促进钙铁等矿物质吸收、免疫调节和肠道健康促进等生物学功能的最新研究进展。由于牛乳蛋白质在组分含量和比例与母乳的差异,乳基婴幼儿配方粉中蛋白质的调整,既要考虑乳清蛋白和酪蛋白的比例,还需要进一步精细调整蛋白质亚组分的含量和比例,是当前乃至今后婴幼儿配方食品配方创新和工艺技术研发的重要方向。     

高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白含量

建立婴幼儿配方乳粉中A1、A2 β-酪蛋白的高效液相色谱-串联质谱测定方法。乳粉经尿素溶液溶解稀释,胰蛋白酶酶解,过膜后利用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱分离,0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈为流动相梯度洗脱,高效液相色谱-串联质谱仪测定。结果表明,A1、A2 β-酪蛋白在0.02～2.00 mg·mL^-1线性范围内,相关系数(R²)均≤0.99,检出限为0.05～0.10 g·kg^-1;定量限为0.2～0.5 g·kg^-1;平均回收率在92.08%～105.29%;平均相对标准偏差为1.5%～7.9%。随机选取了10个品牌的婴幼儿配方乳粉进行测定,得到A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白的含量在0～30.3 g·kg^-1。     

商品化酪蛋白磷酸肽中通用型标记肽的筛选及其在婴幼儿配方奶粉中应用

目的 对4种常见的商品化酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides, CPP)的多肽组成进行鉴定, 筛选通用型标记肽, 并且应用于婴幼儿配方奶粉中CPP含量的定量检测。方法 采用液相色谱-串联飞行时间质谱法对多肽进行鉴定和筛选; 采用同位素稀释液相色谱-串联质谱技术, 建立婴幼儿配方奶粉中CPP含量的检测方法。结果 所筛选获得的多肽VLPVPQK普遍存在于4种商品化CPP中, 定量检测方法的标准曲线线性r2>0.99, 平均回收率在99.0%~101.5%之间, 批间精密度在3.8%~5.7%之间, 方法精密度在2.0%~7.6%之间, 符合检测要求。结论 该通用型标记肽普遍适用于中国市场上常见的商品化酪蛋白磷酸肽, 适合婴幼儿配方奶粉企业用于产品质量控制, 方法简单高效, 可应用于常规理化实验室。     

ELISA法快速检测婴儿配方奶粉中酪蛋白含量

目的建立快速检测奶粉中酪蛋白含量的方法。方法通过夹心酶联免疫吸附法(ELISA)定量测定婴儿配方奶粉中的酪蛋白含量。按照试剂盒内附的操作说明,制作标准曲线,计算3种奶粉样品所对应的酪蛋白含量,同时测量另外10种奶粉样品的酪蛋白含量。结果酪蛋白在0.5~13.5μg/g内具有良好的线性关系,相关系数(R~)大于0.99。3种奶粉样品实际测得酪蛋白含量与标签上的含量一致性在99%以上。10种奶粉样品酪蛋白含量在4.17~6.65 g/100 g范围内。结论该方法专一性强,灵敏度高,简便、快速、准确,可用于婴儿配方奶粉中的酪蛋白含量的测定。     

高原娟姗牛β-酪蛋白A2纯合基因型的筛选鉴定

为了筛选出A2A2基因型娟姗牛，组建A2型奶牛育种核心群，为A2牛奶的开发应用奠定基础。从云南欧亚乳业公司鹤庆有机牧场核心群选取385头娟姗牛进行尾静脉采血，提取血液中基因组DNA，检测浓度和纯度后，将提取的DNA进行PCR扩增并送公司测序，同时对血清中β-酪蛋白的含量进行检测。经不同公司各自使用不同引物进行检测，结果一致。在所有娟姗牛中，检测到3种基因型：A2A2基因型198头、A1A1基因型29头、A1A2基因型158头；3种基因型奶牛分别占51.43%、7.53%和41.04%,A2基因频率达71.95%。娟姗牛β-酪蛋白的平均含量为5.58μg/mL,A2A2型和A1A2型奶牛的β-酪蛋白含量均显著低于A1A1型奶牛（P<0.05），但是A2A2型和A1A2型奶牛之间则无统计学差异（P>0.05）。结果表明，通过DNA测序检测突变位点核苷酸能够鉴定出A2A2基因型娟姗牛，β-酪蛋白含量测定不能分辨出A2A2型和A1A2型娟姗牛。与ELISA蛋白检测方法相比，DNA测序法具有快速准确、成本较低等优点，可作为牛群分型的理想方法。     

SDS-PAGE测定乳基婴幼儿配方食品中乳清蛋白方法的研究

采用SDS-PAGE对乳基婴幼儿配方食品内乳清蛋白进行了分离和定量分析,优化了试验条件,简化了数据的处理方法。结果表明采用该法对乳粉内6种重要蛋白(α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清白蛋白)能实现较好地分离,依据乳清蛋白和酪蛋白的比值可以推算出乳清蛋白在乳粉内的含量。对乳清蛋白含量不同的乳粉及市售婴儿粉的测定表明,SDS-PAGE法是一种操作简便、准确快速测定乳粉内乳清蛋白含量的方法。     

牛乳β-酪蛋白检测的间接ELISA方法

将从干酪素中提取的牛β-酪蛋白对新西兰白兔进行多次皮下免疫注射.采集血清并用硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,以制备兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体.最后将纯化的抗体用于间接ELISA法检测牛乳β-酪蛋白的含量.     

多酚氧化酶交联β-酪蛋白的抗原性变化初步研究

利用多酚氧化酶催化牛乳β-酪蛋白交联,并通过ELISA方法检测交联前后β-酪蛋白抗原性的变化。SDS-PAGE结果显示,多酚氧化酶可以有效地催化β-酪蛋白交联。同时,间接竞争ELISA检测的β-酪蛋白交联后的半抑制浓度(IC50值)由2.63μg/mL变为4.07μg/mL,表明交联后β-酪蛋白抗原性明显降低。本研究工作为通过多酚氧化酶交联制备低致敏性乳制品提供了部分理论依据。     

添加α-乳清蛋白——婴儿配方奶粉将进一步接近母乳

在无法哺喂母乳的情况下使用最为接近母乳的配方奶粉 ,给婴儿最好的照顾 ,这是每个母亲的希望 ,也是全球医生与科研工作者一直在探索与追求的目标。对母乳营养成分的分析显示 ,母乳中的蛋白质有 2 7%是α 乳清蛋白 ,而牛奶中的α 乳清蛋白仅占全部蛋白质的 4 % ,目前广泛使用的各种婴儿配方奶粉中的α 乳清蛋白也远远没有达到母乳的水平。据介绍 ,目前在国内使用的大多数婴儿配方奶粉虽然采用了母乳 6 0∶4 0乳清蛋白与乳酪蛋白的比例 ,但由于工艺技术的问题和观念上的局限 ,婴儿配方奶粉中α 乳清蛋白含量上仍与母乳差距较大。如果能将婴儿…     

应用SDS-PAGE法评价乳基婴幼儿配方食品中有效蛋白质组分

利用SDS-PAGE法评价乳基婴幼儿配方食品中的有效蛋白组分,优化了样品前处理方法,采用Bio-Rad Quantity One软件对电泳谱图进行数据分析,实现牛乳蛋白组分的定性和半定量测定。采用该法对我国市售婴幼儿配方食品中的牛乳蛋白有效成分进行了质量评价分析,发现0～12月龄婴儿配方食品基本符合GB 10765-2010中对乳清蛋白不得低于60%总蛋白的规定;0～6月龄Ⅰ段婴儿配方食品中的乳清蛋白含量最高,乳清蛋白/酪蛋白为1.57～2.12(61∶39～67∶33);6～12月龄的Ⅱ段较大婴儿配方食品中乳清蛋白相对Ⅰ段少,二者比例为1.06～1.55(52∶48～61∶39);而在12月龄以上的Ⅲ段幼儿配方食品中二者比例为0.65～0.71(40∶60～42∶58)。虽然Ⅰ段婴儿配方食品乳清蛋白/酪蛋白符合标准,但是在母乳中占主要成分的α-LA(α-乳白蛋白)在Ⅰ段婴儿配方食品中含量偏低(19.1%～24.1%),母乳中不存在的α-CN(α-酪蛋白)在Ⅰ段婴儿配方食品中却占11.9%～17.8%,另外还发现Ig G(免疫球蛋白G)在乳基婴幼儿配方食品中的含量偏低。     

适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉的致敏性评价

牛奶是婴儿饮食中最早引入的食物之一,也是引起食物过敏最常见的原因之一。因此,低致敏奶粉的研制具有重要意义。该文采用4周龄雌性BALB/c小鼠,以灌胃方式致敏。将乳清蛋白浓缩物作为阳性对照,通过观察过敏症状,计算脾脏系数,测定血清中总免疫球蛋白E(IgE)和组胺含量,对适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉进行致敏性评价。结果表明:乳清蛋白浓缩物组出现了明显过敏症状,血清中总免疫球蛋白E(IgE)、组胺含量以及脾脏系数显著高于空白及佐剂对照组,说明乳蛋白致敏模型成功建立;适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉组无过敏症状,与空白组及致敏佐剂组相比,血清中总免疫球蛋白E(IgE)、组胺含量以及脾脏系数均无显著差异,说明适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉未引起小鼠过敏;同样,由于深度水解破坏了乳清蛋白抗原表位,深度水解乳清蛋白粉也未引起小鼠致敏;而普通脱脂奶粉致敏小鼠血清中总免疫球蛋白E(IgE)、组胺含量以及脾脏系数均显著高于空白组及致敏佐剂组,说明普通脱脂奶粉导致小鼠致敏。因此,适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉可有效降低或缓解牛奶过敏症状,但仍有待于更多临床试验的验证。     

高压液相色谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中的叶黄素和β-胡萝卜素

目的建立同时测定婴幼儿配方乳粉中叶黄素和β-胡萝卜素的快速测定方法。方法奶粉样品加2mL 50%氢氧化钾碱溶液,在70℃水浴下皂化15min,经石油醚:乙醚(1:1,v/v)提取,水洗、浓缩后,C30色谱柱分离,在450 nm波长处检测,外标法定量。结果叶黄素和β-胡萝卜素在0.2~4.0μg/mL范围内线性良好,相关系数:R20.9990;三浓度水平加标回收率均在80%~90%之间,样品及三个浓度水平加标6次重复试验RSD均5%。结论该方法准确、简单、快速且能同时测定婴儿配方乳粉中的叶黄素和β-胡萝卜素含量。     

山羊β-酪蛋白的分离及其含量的测定

从呼和浩特市周边地区采集的新鲜山羊奶，通过离心脱脂，调节等电点沉淀蛋白，对所得沉淀物进行DEAE离子交换层析，分离出α-酪蛋白和β-酪蛋白，并且β-酪蛋白被完全纯化出来。建立ELIsA双夹心方法对β-酪蛋白的含量进行测定，该法可直接用于培养液中β-酪蛋白的定量分析。     

同位素稀释质谱法测定乳及含乳饮料中的酪蛋白含量

目的建立同位素稀释质谱法对以牛乳、乳粉为原料的饮料中4种不同亚型的酪蛋白进行含量测定。方法样品溶解后,经等电点沉淀法提取其中的酪蛋白,将样品复溶液稀释至适当浓度,取适量稀释液同时混入多肽同位素内标,加入胰蛋白酶酶解16 h,使用甲酸停止酶解反应,定容后离心,取上清液分析;以WATERS ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×50 mm,1.8μm)作分析柱,用0.3%(V:V)甲酸-水和乙腈作为流动相,梯度洗脱分离。质谱采用ESI正离子模式检测,多反应监测模式进行采集,内标法定量分析。结果 4种不同亚型的酪蛋白特征肽段在4 min内达到基线分离,αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白在0.05~8μmol/L浓度范围内线性良好,αs2-酪蛋白在0.01~5μmol/L浓度范围内线性良好,相关系数均在0.9990以上。αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的方法检出限均为3 nmol/L,定量限均为10 nmol/L,αs2-酪蛋白的方法检出限为1.6 nmol/L,定量限为5 nmol/L。阴性基质加标的复溶液中,β-酪蛋白浓度在0.5、2.0、5.0μmol/L 3个水平下的平均回收率为62.21%~84.36%,相对标准偏差为3.37%~5.50%。采用该方法分别测定了豆奶粉、白咖啡饮品和液体乳饮料中的酪蛋白含量,结果表明3种样品中均含有4种不同亚型的酪蛋白,且含量各不相同。结论该方法灵敏度高、特异性强,可以准确快速地测定乳及含乳饮料中酪蛋白含量。     

牛乳中β-酪蛋白基因分型及β-酪啡肽-7的研究进展

牛乳营养丰富,乳蛋白是牛乳中最有营养价值的成分。β-酪蛋白约占乳蛋白总量的30%,A1和A2是β-酪蛋白最常见的两种类型,其中A1型为突变型。β-酪蛋白基因多态性是受常染色体上共显性基因所控制的,可通过蛋白水平或分子水平进行检测。A1型β-酪蛋白在人体内消化酶解后可产生多种特定的氨基酸残基片段,其中β-酪啡肽-7(β-casomorphin-7,BCM-7)是具有阿片活性的七肽物质,推测其可能与1型糖尿病、心血管疾病、自闭症、精神分裂症、消化功能紊乱等人体慢性非传染性疾病的发生有密切联系。本文从β-酪蛋白基因变异和分型方法、BCM-7的生成机制及其对人体健康潜在影响等方面进行了综述,为未来β-酪蛋白和A2型牛乳在乳制品行业的研究开发提供一定参考。     

羊奶及奶粉中27种β-受体激动剂类药物残留UPLC-MS/MS检测方法

采用超高效液相色谱串联质谱建立羊奶及奶粉中吡布特罗、丙卡特罗、瑞普特罗、克伦普罗、奥达特罗等27种β-受体激动剂类药物残留检测方法。样品经过1%甲酸乙腈提取、Oasis PRi ME HLB柱净化后,经Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)分离,以甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,多通道MRM信号采集模式,27种β-受体激动剂类药物能在10.5 min内出峰完好,在1.0~100.0μg/L浓度范围内,27种β-受体激动剂类药物线性良好,相关系数均在0.993以上;羊奶中最低定量限均低于0.5μg/kg,通过0.5、2.5、5.0μg/kg三个浓度的加标回收实验表明,回收率为65.7%~119%,批内变异系数为0.79%~10.4%,批间变异系数为2.13%~15.7%。奶粉中最低定量限均低于2.0μg/kg,通过2.0、10.0、20.0μg/kg三个浓度的加标回收实验表明,回收率为60.5%~109%,批内变异系数为1.91%~12.4%,批间变异系数为3.06%~17.2%。所建立方法为一种高通量检测羊奶及奶粉中β-受体激动剂类药物残留确证分析方法。     

两种牛乳κ-酪蛋白的间接ELISA定量检测研究

分别以兔血清IgG与鸡卵黄抗体(IgY)为检测抗体,建立了两种牛乳κ-酪蛋白的间接ELISA定量方法。牛乳κ-酪蛋白分别免疫新西兰大白兔和临产母鸡,经亲和层析分离纯化后得到anti-κ-CN-IgG与anti-κ-CN-IgY两种抗体。两种抗体均与β-酪蛋白、α-乳白蛋白和乳清粉存在一定交叉反应,抗体与相应抗原进行免疫吸收后得到高特异性IgG与IgY。用吸收后的anti-κ-CN-IgG建立的间接ELISA法,当标准κ-CN质量浓度在0.098~3.125 mg/L时,A450 nm值与κ-CN的质量浓度具有线性关系,变异系数小于1%,回收率在99.10%~101.1%之间;用吸收后的anti-κ-CN-IgY检测κ-CN,在0.098~6.25 mg/L时,A450 nm值与κ-CN的质量浓度成良好的线性关系,变异系数小于2%,回收率在98%~100.8%之间。当三聚氰胺掺假量在0~20%时,两种抗体均能通过κ-CN的定量检测而实现乳品的掺假检验。