汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的表达及相互作用

目的研究汉坦病毒76-118株包膜糖蛋白G2与β3整合素之间的相互作用。方法根据HV76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR和基因重组获得带有EGFP标签的G2和带有FLAG标签的β3整合素膜外区片段融合表达质粒,并且在HEK293细胞中进行表达。将表达成功的G2与β3整合素片段进行免疫共沉淀,用Western blot检测它们之间的相互作用。结果成功构建了G2和β3整合素膜外区各片段的融合表达质粒。将各表达质粒转染HEK293细胞进行瞬时表达,Western blot结果显示β3整合素膜外区各功能片段在细胞裂解上清中获得大量表达,而G2蛋白膜外区仅有81-140片段在细胞裂解上清中大量表达。将G2 81-140片段与β3整合素膜外区各功能片段进行免疫共沉淀的结果显示,仅G2 81-140片段和β3整合素27-133片段在细胞中以复合物存在,提示两者之间可能有直接的相互作用。结论汉坦病毒76-118株包膜糖蛋白G2 81-140片段与β3整合素27-133片段在细胞中以复合物的形式存在,两者之间存在着相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒受体提供了进一步的证据。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因改建及其表达产物粘膜免疫佐剂活性的研究(英文)

目的改建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因序列以提高重组LTB(rLTB)原核表达量,确定重组改建LTB(rrLTB)粘膜免疫佐剂活性。方法按大肠杆菌偏爱密码子合成全长LTB基因的核苷酸序列。构建pET32a-rLTB原核重组表达质粒及pET32a-rLTB-E.coliBL21DE3表达系统,提取重组质粒并测定其插入的rLTB基因序列。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶成像分析系统鉴定rrLTB表达产量,并与未改建的重组LTB(roLTB)比较。采用GM1-ELISA确定rrLTB和roLTB结合牛GM1的能力。分别以幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位(rUreB),检测rrLTB和roLTB对rUreB对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠保护作用及产生特异性S-IgA的增强效应。结果pET32a-rLTB-E.coliBL21DE3经1 mmol/LIPTG诱导后,rrLTB表达量约占细菌总蛋白的35.4%,为roLTB(2.8%)的12.6倍。GM1-ELISA结果证实rrLTB和roLTB均能与牛GM1结合。单一rUreB对感染小鼠的免疫保护率为66.7%,但与rrLTB或roLTB合用时,保护率可至91.6%,并可提高感染小鼠特异性S-IgA产生量(P<0.01)。结论改建的LTB基因能明显提高表达量,所表达的rrLTB仍保持较强的粘膜免疫佐剂活性。     

细粒棘球绦虫AgB8／1-AgB8／2重组嵌合抗原表达系统的构建

目的构建pET32a—AgBS／1-AgBS／2原核表达载体,并对其重组蛋自进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgBS／1和EgAgBS／2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,人2r-合成EgAgBS／1-EgAgBS／2嵌合抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm—T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm—T／AgBS／1-AgBS／2重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8／1-AgBS／Z嵌合抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段E-确后,转化至E.coli BL21（DE3）Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgBS／1-AgBS／2重组嵌合蛋白。用SDS—PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgBS／1-AgBS／2嵌合抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组嵌合蛋白得到成功表达,在相对分子量约38kD处有表达条带。结论成功构建了pET32a—AgBS／1-AgBS／2原核表达质粒,并初步诱导表达出AgBS／1-AgBS／2嵌合重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

猪链球菌2型中国强毒株CovR重组蛋白及其抗体的制备

目的通过构建pET32a-covR原核表达质粒,表达并提纯CovR重组蛋白,制备其多克隆抗体。方法采用PCR法,从四川资阳病人分离株05ZYH33基因组扩增CovR的编码基因covR,构建重组表达质粒pET32a-covR,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE鉴定后,His亲和层析柱纯化CovR重组蛋白;免疫新西兰兔制备特异性抗体,Western blot检测兔多抗血清的特异性,间接ELISA检测其滴度。结果covR基因在原核细胞中得到高效表达,重组蛋白免疫新西兰兔后血清效价高达1∶204800,且重组蛋白能够与之发生特异性的反应。结论成功构建了表达载体pET32a-covR,可在E.coliBL21中高效表达,制备了特异性抗体,为进一步研究CovR的调控机理奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒-1 Vif蛋白的表达及生物学功能

目的 分析上海HIV-1分离株病毒感染因子(Vif)蛋白编码基因突变特点,构建HIV-1vif基因原核表达质粒,并了解其免疫原性.方法 采用RT-PCR法扩增23例上海HIV-1分离株vif基因并测序,与HIV-1国际标准毒株比较;将vif编码基因克隆入原核表达载体pET32b(+),构建pET32b(+)-HIV-1/Vif重组质粒;将该质粒转化入细胞BL21D3(Star)表达,并纯化HIV-1 Vif蛋白,制备Vif蛋白鼠多克隆抗体,并以ELISA检测Vif蛋白及其鼠多克隆抗体的免疫原性.统计学处理采用t检验.结果 上海HIV-1分离株vif基因与国际标准毒株相比较,核苷酸突变率为(0.179±0.006)%,并具有多处相似的变异位点,上海HIV-1分离株Vif蛋白第151～240位氨基酸相对保守;成功构建HIV-1 vif基因原核表达质粒pET32b(+)-HIV-1/Vif,表达并纯化Vif蛋白,制备了Vif多克隆抗体;重组HIV-1 Vif蛋白与HIV感染者及健康人血清反应比较,差异无统计学意义(P＞0.05);鼠多克隆抗体与重组Vif蛋白反应与健康对照组血清比较差异有统计学意义(t=178.61,P<0.01).结论 上海HIV-1分离株vif基因与HIV-1国际标准毒株比较存在较高突变,成功地构建了HIV-1 vif基因原核表达载体pET32b(+)-HIV-1/Vif,制备了Vif多克隆抗体.     

GⅡ.2型诺如病毒VP1蛋白原核表达及蛋白纯化

目的利用原核表达系统,表达了GⅡ.2型诺如病毒VP1蛋白,优化诱导条件并进行蛋白的纯化。方法扩增诺如病毒的VP1基因,克隆至pET32a(+)载体,构建重组质粒pET32a-VP1。将pET32a-VP1转化至大肠埃希菌BL21(DE3),加入IPTG进行诱导表达并优化诱导条件。利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度。结果成功扩增大小为1 659 bp的诺如病毒VP1基因。PCR检测重组质粒pET32a-VP1构建成功。将重组质粒转化至BL21(DE3),IPTG诱导表达70×10~3的VP1重组蛋白,优化的最佳诱导表达条件为37℃,0.6 mmol/L IPTG诱导5 h。重组蛋白以包涵体的形式表达,并SDS-PAGE鉴定镍柱纯化产物为单一电泳条带的目的蛋白。结论利用原核表达系统成功构建了重组质粒pET32a-VP1,并表达纯化了诺如病毒VP1重组蛋白,为单克隆及多克隆抗体的制备、检测试剂盒以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白膜外区密码子优化、原核表达及纯化

目的 有效检测狂犬病毒抗原。方法 将狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区基因序列优化成大肠杆菌常用密码子并合成。将合成基因与表达载体pET-28a(+) 分别双酶切、胶回收后连接并转化至Rosseta(DE3) 菌株。挑选阳性重组表达菌经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果 在大肠杆菌中成功表达了糖蛋白膜外区。结论 该项研究为后续建立检测狂犬病毒抗原的ELISA试剂盒的研发做铺垫。     

弓形虫RH株膜蛋白P30的原核表达与鉴定

目的在E.coli中表达弓形虫RH株膜蛋白P30。方法将P30基因定向克隆到pET28b,构建含目的基因的pET28b-P30重组质粒,转化E.coliBL21(DE3),接种含pET28b-P30的BL21(DE3)单菌落于LB培养基,1∶100稀释后用0.2mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定诱导表达产物。结果1构建了重组质粒pET28b-P30,2在E.coli中表达了一分子量约为30kDa的融合蛋白,经Westernblot鉴定正确。结论在E.coli中高效表达了弓形虫RH株膜蛋白P30,并以包涵体形式存在。     

恶性疟原虫FCC1/HN株嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因的克隆和原核表达

目的 从恶性疟原虫基因组中扩增、克隆恶性疟原虫嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因,并进行原核表达产物。方法根据恶性疟原虫FCB株嘌呤核酸磷酸化酶基因编码序列,设计一对引物,引入EcoR I和Xho I。采用PCR技术从恶性疟原虫FCC/HN株基因组DNA中特异扩增PNP基因。纯化后扩增产物用EcoR I和Xho I双酶切后,定向克隆入原核质粒pET30a( )和真核质粒pcDNA3,重组质粒pET30a( )-PNP转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组子后,用PCR、EcoRI Xho I双酶切和DNA序列测定鉴定。用IPTG诱导重组质粒pET30a( )-PNP表达融合蛋白。结果 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中特异扩增出PNP基因,将扩增的目的基因亚向插入pET30a( )和pcDNA3表达质粒的EcoR I和XhoI位点;重组子pET30a( )-PNP在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达中表达,表达融合蛋白分子量为31.4kDa。结论 从恶性疟原虫基因组中获取PNP基因,并成功构建pET30a( )-PNP和pcDNA3-PNP重组质粒,获得PNP原核表达产物。     

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3在原核细胞的高效融合表达和特性鉴定

目的　构建重组质粒pET2 8a -Sj14 - 3- 3,并在大肠杆菌中表达 ,检测表达产物的免疫活性。 方法　用亚克隆技术把Sj14 - 3- 3基因克隆至 pET2 8aT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α和BL2 1感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE和Westernblot分析。结果　获得pET2 8a -Sj14 - 3- 3重组表达载体 ,SDS -PAGE和Westernblot显示Sj14 - 3- 3基因在 pET2 8a中表达的融合蛋白约为 32 4kDa ,与天然 14 - 3- 3蛋白具有相同的免疫活性。 结论　日本血吸虫信号蛋白14 - 3- 3在原核细胞中得以高效表达 ,表达产物具有免疫活性 ,为进一步研究其免疫保护作用和信号转导奠定了基础     

狂犬病病毒G基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的初步建立与应用

目的以重组G蛋白为检测抗原,应用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank 公布的狂犬病病毒LEP Flury株基因序列设计引物,PCR扩增出目的基因,连接pGM T载体,重组质粒经BamH I和XhoⅠ双酶切,连接到表达载体pGEX 6P 1,构建重组表达载体pGEX G。将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的蛋白,表达蛋白纯化后SDS PAGE电泳分析并经Western blotting鉴定。纯化的G蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA方法检测93份犬血清抗体。结果成功构建了克隆载体pGM G和表达载体pGEX G,高效表达了狂犬病病毒G蛋白,融合蛋白分子量大小为79kDa,表达蛋白可与狂犬病病毒抗血清发生特异性反应。建立的检测方法灵敏度达到1∶1 600,与商品化的试剂盒相比符合率为96.8%。结论成功表达狂犬病病毒G蛋白,表达产物可作为检测抗原用于间接ELISA方法中狂犬病病毒抗体的检测。     

狂犬病毒N基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

目的用表达的狂犬病核蛋白建立检测狂犬病抗体的间接ELISA方法。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)ERA株N基因序列设计引物,利用PCR的方法从重组质粒pMD-N中扩增RV N基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建原核表达载体pET-N。阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达N基因的最佳诱导时间。通过凝胶薄层扫描分析和Western-blot分析确定表达蛋白的表达量和特异性。用纯化的表达产物作为诊断抗原,通过对各反应条件的优化,初步建立检测RV抗体的间接ELISA方法。结果扩增了RV N基因,构建了原核表达载体pET-N和原核表达菌,表达了N基因且目的蛋白以包涵体形式存在表达菌中,最佳诱导时间为4 h。重组蛋白表达量占菌体总蛋白的56.8%,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病重组N蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了狂犬病核蛋白,用表达的狂犬病核蛋白建立的间接ELISA方法可以用于RV抗体的检测。     

福建省首例狂犬病街毒分离株基因组序列测定及分析

目的 对福建省首次分离的狂犬病毒街毒株进行全基因组序列测定分析,了解病毒序列及进化特征,为进一步研究街毒的遗传变异规律积累理论资料。方法 从病毒细胞培养液中直接提取病毒RNA,采取分段RT-PCR的方法进行序列扩增,将获得的各基因片段进行分子克隆后测序,运用生物学软件进行拼接得到全基因组序列,并进行分析。结果 应用自行设计的引物,获得了狂犬病毒街毒株的全基因组核苷酸序列,编码区没有插入和缺失的发生,对毒株在N蛋白主要抗原位点发生的突变为在B细胞表位发生了379位V→L的突变;糖蛋白抗原位点I(231位)的氨基酸为L;在抗原位点II 199位点发生了R→G的突变,抗原位点III 333位为精氨酸(R)。与国内河北一街毒株BD06无论在G基因的进化上还是N基因的分型上都有着很近的亲缘关系。结论 获得狂犬病毒株全基因组序列,了解病毒重要的氨基酸位点特征,为进一步探讨福建省狂犬病毒变异、传播机制等奠定基础。     

汉滩病毒S、M基因部分片段嵌合基因原核载体的构建及表达产物的鉴定

目的　将汉滩病毒核蛋白 (NP)主要抗原位点活性片段与囊膜糖蛋白G2进行融合原核表达及鉴定 ,为该融合蛋白的真核表达及汉滩病毒基因工程疫苗研究打基础。方法　构建了汉滩病毒 76 - 118株M基因G2 片段与S基因 5’端70 0bp片段的嵌合片段原核表达载体pGEX - 4T1-G2 S0 7,诱导表达相应的融合蛋白 ,用Westernblotting和ELISA方法进行鉴定。结果　酶切结果显示成功构建了原核表达载体 pGEX - 4T1-G2 S0 7。IPTG诱导表达 4h后 ,Westernblotting显示诱导出分子量约 10 0kD的含GST的融合蛋白 (GST -G2 N0 7)。ELISA结果表明该融合蛋白与抗汉坦病毒NP特异性McAb有较高的结合活性 (P/N值为 0 71/ 0 0 7) ,与抗汉滩病毒糖蛋白特异性McAb也有较弱的结合活性 (P/N值为 0 2 1/ 0 0 8)。结论　S、M基因拼接方式是成功的 ,能够表达出有活性的汉滩病毒G2 糖蛋白与NP片段的融合蛋白。     

狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用

目的以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切,酶切产物定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a-P,阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的蛋白作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步将间接ELISA方法应用于狂犬病病毒抗体的检测中。结果扩增RV P基因,构建了克隆质粒pGM-T-P、原核表达质粒pET-32a-P,高效表达了主要以可溶性形式存在的P蛋白,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病病毒重组P蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了磷蛋白,用其作为固化抗原以间接ELISA方法检测RV抗体。     

狂犬病病毒糖蛋白重组表达及其基因工程疫苗研究进展

狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)是唯一暴露于病毒颗粒表面的抗原,能够诱导宿主产生中和抗体,也是唯一存在于所有新型狂犬病疫苗中的病毒成分。本文综述了国内外学者利用原核系统,以及包括酵母系统、植物系统、昆虫细胞系统在内的真核系统和哺乳动物细胞系统、病毒载体系统来表达具有免疫原性的重组狂犬病病毒糖蛋白(rRVGP),并对其与天然RVGP在结构和激发机体免疫反应方面的相似性进行的相关研究,为狂犬病基因工程新型疫苗提供研究思路。     

狂犬病毒HEP-dG株的拯救

目的筛选免疫原性高、致病性低的狂犬病疫苗候选株。方法应用反向遗传技术,在狂犬病毒弱毒株HEP-Flury株全基因组3'-N-P-M-G-L-5'的假基因区域(G与L之间),插入一个G基因,构建携带双G基因的全长感染性克隆,其与辅助质粒共转染BHK-21细胞,盲传十代,用荧光抗体和RT-PCR鉴定病毒。结果成功获得携带双G基因的狂犬病毒HEP-dG株,该病毒在BHK-21细胞中稳定生长,其病毒滴度达到1010FFU/mL。结论HEP-dG株会为研制高效的狂犬病病毒基因工程口服疫苗提供了良好的疫苗候选株。     

云南省2006-2010年狂犬病病毒N和G基因分子结构特征分析

目的了解云南省狂犬病毒的流行情况以及街毒株N、G基因结构特征,为有效控制狂犬病疫情提供初步科学依据。方法对云南省2006-2010年10株狂犬病街毒株N、G基因进行全基因克隆、测序,并与已知国内外代表毒株核苷酸及推导氨基酸进行序列比对及系统发育分析。结果序列分析表明所研究的10个云南毒株与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型代表毒株N、G基因核苷酸序列同源性分别为72.1%～78.5%、58.4%～71.0%,与基因Ⅰ型毒株序列同源性为85.2%～90.1%、82.7～99.6%,云南毒株之间核苷酸序列同源性为89.3%～99.2%、86.0～99.6%。云南10个毒株均为基因Ⅰ型和血清1型毒株,分为2个进化分支,除YNTC06与GXN119和HM88单独属于分支Ⅲ外,其余云南毒株均分布在分支Ⅰ上,且进一步分为3个小亚分支。遗传进化分析表明,各毒株氨基酸位点均存在不同程度的变异,其中YNTC06在360、369、375等多个NP抗原位点存在变异;云南毒株在GP330、333位毒力决定位点未发生变异,均为强毒株。结论云南狂犬病毒属于基因Ⅰ型,存在2个分支;云南狂犬病毒NP和GP存在特异性氨基酸变异位点,其基因结构及变异、亚组群划分与地理位置无相关性。     

恶性疟原虫保护性抗原复合基因—痘苗病毒重组活疫苗株家兔免疫血清及IgG对恶性疟原虫的体外抑制试验

用恶性疟原虫痘苗病毒重组活疫苗候选株的家兔免疫血清及纯化的ＩｇＧ 进行了恶性疟原虫的体外培养抑制试验，并与该目的基因的原核表达蛋白及全虫抗原进行了比较。结果在疟原虫的第一个生长周期内，重组痘苗病毒组的免疫血清抑虫作用最强（Ｐ＜ ０．０５），其次为全虫抗原及原核蛋白组；ＩｇＧ 则在第一及第二个生长周期均以原核表达蛋白组抑虫作用最强（ Ｐ＜ ０．０５） ，其次为重组痘苗病毒及全虫抗原组。说明重组痘苗病毒免疫血清及ＩｇＧ具有一定的体外抑制恶性疟原虫增殖作用，值得进一步深入研究。     

河南省九株狂犬病毒的糖蛋白基因序列分析

目的 了解河南省狂犬病毒与人用、兽用狂犬病疫苗株在糖蛋白基因核苷酸和氨基酸序列水平上的差异,为有效控制狂犬病疫情提供初步的科学依据.方法 以反转录-半套式聚合酶链反应(RT-heminested-PCR)扩增2006年12月分离自河南省信阳市的9株狂犬病毒街毒株,经纯化、克隆、测序后获得9条糖蛋白基因全长序列,采用生物信息学软件构建基因系统发育树,对糖蛋白基因序列和氨基酸序列进行分析.结果 9株狂犬病毒糖蛋白在核苷酸及氨基酸序列水平上彼此的同源性分别为97.6%～98.9%和99.2%～99.8%;9株病毒与CTN疫苗的同源性最高,其核苷酸及氨基酸同源性分别为85.6%～93.0%和91.9%～92.9%;9株病毒与其他疫苗株相比,其核苷酸及氨基酸同源性分别为80.4%～83.3%和87.7%～92.5%;与已知的基因1型狂犬病毒比较,9株病毒糖蛋白氨基酸序列发生了若干位点的氨基酸取代.结论 9株河南省狂犬病毒街毒株均属基因1型,CTN疫苗株可能为目前我国河南省所流行的狂犬病提供较好的保护效果.